Summary
Den ständigt växande musen framtand ger en modell för att studera förnyelse av tandvävnad från tand epitelceller stamceller (DESCs). Ett robust system för konsekvent och tillförlitligt sätt att få dessa celler från framtand och expandera dem in vitro redovisas här.
Abstract
Att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom tand förnyelse och förnyelse har blivit ett ämne av stort intresse 1-4, och musen framtand ger en modell för dessa processer. Denna märkliga organ växer kontinuerligt under hela djurets liv och genererar alla nödvändiga celltyper från aktiva pooler av vuxna stamceller inrymt i labial (mot läppen) och lingual (mot tungan) livmoderhalscancer slinga (CL) regioner. Endast de dentala stamceller från den labiala CL medföra ameloblasts som genererar emalj, det yttersta skiktet på tänder, å labiala ytan. Denna asymmetriska emaljbildning tillåter nötning hos framtand spets, och ursprungsceller och stamceller i det proximala framtand säkerställa att de dentala vävnader ständigt fyllas. Förmågan att isolera och odla dessa progenitorceller eller stamceller in vitro gör sin expansion och öppnar dörrar till många försök som inte uppnås in vivo, till exempel hög genomströmning testning av potentiella stamcells reglerande faktorer. Här beskriver vi och demonstrera en tillförlitlig och konsekvent metod för att odla celler från läpp CL av musen framtand.
Introduction
En av de unika egenskaperna hos ryggradsdjur är utvecklingen av tänder. Tanden har blivit en viktig systemmodell för många forskningsområden, eftersom de molekylära vägar och morfologiska inriktningar relevanta för detta organ har undersökts ur flera perspektiv, bland annat genom utvecklings-och evolutionsbiologer 5. På senare tid har området för regenerativ medicin börjat få värdefulla insikter med hjälp av tanden som modell. Framför allt har upptäckten av dentala epitelceller stamceller varit ett viktigt framsteg 6-13.
Alla gnagare besitter ständigt växande framtänder vars tillväxt drivs av stamceller, vilket gör dessa tänder ett tillgängligt modellsystem för att studera vuxna stamceller reglering. Märkningsförsök i 1970-talet 10,11, följt av genetisk härstamning spåra experiment 8,9,12,14, har visat att DESCs bor i den proximala regionen av framtand. Skaftetcell avkomma i epitel facket på labial sidan flytta ut ur den förmodade nisch, känd som den labial livmoderhalscancer slingan (CL), samt bidra till en population av celler som kallas transit-förstärkning (TA)-celler (Figur 1). Specifikt DESCs bor i den yttre emalj epitel (OEE) och stellate reticulum (SR) 8,9,14, och den inre emalj epitel (IEE) ger upphov till TA celler som framsteg genom ett begränsat antal cellcykler och sedan flytta distalt utmed längden av den framtand (Figur 1). Differentierings ameloblasts i musen framtand fortsätta att röra sig distalt utmed framtand i en anmärkningsvärd hastighet av ca 350 ^ m på en enda dag 15,16. När de rör sig, cellerna differentieras till mogna ameloblasts och stratum och övergångs (SI) celler. Efter avsättning av hela tjockleken för emaljmatris, många av de ameloblasts genomgå apoptos, och de kvarvarande cellerna krympa i storlek och reglera emalj maturation <sup> 17. Den linjen av de andra celltyper i labial CL, till exempel SR, är mindre tydlig, och uppgifter om stamcellerna i mesenkymet 18 och i lingual CL bara börjat växa fram.
Använda musen framtand modellen, har ett antal grupper arbetat med att belysa de genetiska vägar och cellbiologiska processer i naturliga stamcellsbaserad förnyelse orgel. Däremot innehåller den labial CL ett relativt litet antal celler, uppskattas till cirka 5.000 per mus framtand, vilket gör arbetet med primära celler utmanande. Därför har ansträngningar gjorts för att kultur och utöka dessa celler in vitro 6,16,19,20 för att öppna nya dörrar för experimentella metoder som inte uppnås in vivo. Den senaste undersökningen har visat att dessa celler kan både själv-förnya och differentiera till amelogenin uttryckande celler vid odling 13. Här beskriver vi och demonstrera en metod för the tillförlitlig och konsekvent odling av celler från mus labial CL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissekera Lägre Hemi-mandibles från vuxen mus
- Innan du utför detta protokoll, erhålla nödvändiga institutionella godkännande och var noga med att följa alla riktlinjer djurskötsel. Avliva djur med standard IACUC godkända förfaranden. För detta arbete CO 2 kvävning användes följt av cervikal dislokation.
- VALFRITT: Separat huvud från resten av kroppen med hjälp av ett rakblad.
- Ta bort huden från underläppen till halsen.
- Med användning av en skalpell, göra ett snitt mellan de två nedre framtänderna, som är löst förbundna. Vid ansökningen tryck, kommer underkäken delas upp i två halvor.
- Kil skalpellen mellan Condyle i käken och den tidsmässiga mandibular gemensam och skär längs med käkmusklerna för att ta loss käken.
- Ta bort alla muskler, senor och ligament tills bara benet kvar.
2. Isolera Incisor
- Med hjälp av en # 15 skalpellFörsiktigt rakning av ben vid en 45 ° vinkel från den distala änden till den proximala änden av membranregionen. Använd spetsen på skalpellen för att plocka bort eventuell kvarvarande ben inklusive benfragmenten vid kanten. Sakta börjar plocka bort på den linguala kortikala plattan av underkäken, med början strax under 3: e molar.
- Fortsätt tills framtand är ren, arbeta försiktigt mot det område som innehåller CL.
- Ta sämre alveolär nerv bunt.
- Gör ett rent snitt att först ta bort ben och vävnader proximal till CL.
- Gör en andra skär distalt med skalpell, ungefär under 2: a molar. Den proximala framtand regionen därefter dissekerades ut genom att sätta in skalpell mellan benet och den mediala ytan av den proximala framtand. Detta måste noggrant gjort, för att inte riva vävnaden. Snittet rörelse är proximal-distal.
ALTERNATIV STEG:
Ta bort så mycket ben som möjligt på området ovanför incisor. När området rensas försiktigt bort hela framtand med hjälp av en storlek 5 pincett för hantering emaljen delen närmast CL-regionen. - Placera dissekerad vävnad (antingen isolerad CL som i fig 3E, eller hela framtand som i alternativ Steg 2,5) i 2% kollagenas i 1 x PBS under 3-4 h vid 4 ° C i en låg vidhäftning platta. För 1-10 framtänder, använder 100 l per brunn i en 12-brunnar. För mer än 10 framtänder, använd 500 | il per brunn i en 6-brunnars låg vidhäftning platta.
3. Microdissect den Labial Cervical Loop
- Ta CL region från kollagenas och plats i kallt DMEM/F12 media.
- Dra försiktigt i den nedre änden av CL antingen storlek 5 pincett eller en insulinspruta (1 cc, 28 G ½); mesenkymet kommer att falla sönder under det att epitelet förblir intakt. CL och den intilliggande epitel som sträcker sig i sidled som en "vingliknande" struktur kommer att vara synlig.
- Ta bortden apikala knoppen från intilliggande epitel genom att ge ett V-format snitt på vardera sidan, och placera omedelbart i kallt DMEM/F12 på is.
- Upprepa för alla CLS, samla in 1,5 ml mikrofugrör.
- Spinn ner mikrofugrör med prover, ta bort media, ersätta med 100 ^ cell lossnar lösning.
- Inkubera vävnader i cell lossnar lösning under 30 min vid 37 ° C.
- Dissociera vävnaderna för att producera en enda cellsuspension genom att försiktigt pipettera upp och ned med hjälp av en 1.000 l lågvidhäftände pipettspetsen. Celler kan också placeras genom ett sterilt cellfilter för att uppnå dissociation.
- Räkna celler med hemocytometer, platta på vävnadsodlingsplast eller annat önskat material.
4. Primär kultur av DESCs
- Plate celler i en 6-brunnars platta vid 1-6 x 10 4 celler / ml i DESC medier, som består av DMEM/F12 kompletterat med mus-EGF rekombinanta proteinet vid en koncentration av 20 ng / ml, FGF rekombinanta proteinet vid en koncentration av 25 ng / ml, 1 x B27 supplement och 1% antibiotikalösning (penicillin, 100 U / ml streptomycin, 50 pg / ml).
- Odla celler utstrukna på en 6-brunnsplatta vid 37 ° C i 5% CO2 i 1 ml av DESC medier. Stör ej initiala kulturer för 5 dagar efter utstrykning för att tillåta cellvidhäftning och kolonibildning.
- För den första medieförändringar, ersätta hälften av volymen (500 ^ il) av gamla medier med halv volym (500 | il) av nya medier. Kontrollera kolonier under mikroskop vid byte av media.
- Efter den första medieförändringen, fortsätter att byta media (1-2 ml) varje 2 dagar. Kontrollera kolonier under mikroskop vid byte av media.
5. Passage DESCs
- Aspirera media och tvätta cellerna 3x med förvärmda PBS.
- Lägg förvärmd 0,25% trypsin-EDTA i koksaltlösning och inkubera vid 37 ° C under 10 till 15 min för de DESCs att lossa.
- Lägg DESC media att neutralisera trypsin, försiktigt pipettera längs vävnadsodlingsplatta för att samla in de celler och plats i en 15 ml koniska rör.
- Centrifugera ner cellerna vid 800 x g under 2 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen hemi-käken består av en ständigt växande framtand och tre rotade molarer (Figur 1A). Alla tänder består av dentin och emalj, de två mineraliserade komponenterna i tandkronan (figur 1A och 1A). De framträder och husen två stamcells nischer kallas labial CL och lingual CL, och emalj bildas uteslutande på den labiala sidan (Figur 1A). DESCs ansvarar för framtand emaljbildning och är inrymt i den labial CL, specifikt OEE och SR (Figur 1A'') 8,9. Den labial CL innehåller också IEE, TA-celler, och SI (Figur 1A''). Vår teknik är inriktad på dissekering och isolering av DESCs av labial CL (Figur 1A''). Krt14-aktin GFP markerar alla epithelial härledda celler av hemi-käken (Figur 1B) och den labiala CL kan tydligt ses through underkäken (Figur 1B ', vit pil). Det bör noteras att alla typer av celler kan identifieras i enlighet med högre förstoring (jämför figurerna 1A '' och B'').
Förfarandet för isolering av DESCs från labiala CL sammanfattas i figur 2. Kortfattat är hemi-käken först avlägsnas från djuret, är mandibular ben avlägsnas för att exponera den labiala CL och sedan den labiala CL behandlas med kollagenas för att separera epitel från den omgivande mesenkym. CL är microdissected, behandlades med cell dissociation buffert, och ströks ut i vävnadsodlingsplattor. Separation av labial CL från det underliggande käkbenet (Figur 3) och tillsats av tillräcklig mängd medier är avgörande för isolering och tillväxt av kolonierna, respektive. Små, trånga epitelceller kolonier som bildats med hjälp av denna teknik är synliga efter 7 dagar (Figur 4A),och dessa växer till stora kolonier inom 2-3 veckor (fig 4B).
Figur 1. Illustrationer av den vuxna musen framtand. (A) Den vuxna musen hemi-käken visande de mineraliserade komponenter, emalj och dentin, och de två typerna av tänder, molarer och framtänder. Den proximala framtand region där DESCs är inrymda markeras i A '. (A') sagittalvy av den proximala framtand som visar de två stamcells nischer, den labiala och linguala livmoderhalscancer slinga (LaCl och LiCl), ameloblasts som genererar emalj, och de odontoblaster som bildar dentin. Den LaCl, som enbart genererar ameloblast progenitorceller och slutligen bilda framtand emalj markeras i A''. (A'') Den LaCl visar den yttre emalj epitel (OEE), stellate reticulum (SR), inre emalj epitel (IEE), transit-förstärkande (TA)-regionen, och stratum intermedium (SI). SR är representerat i blått och mörkrosa för att återspegla de subpopulationer med olika densiteter. (B) Visualisering av halsslingan med hjälp av en fluorescerande reporter mus, KRT14-EGFP/Actb. Ben är relativt autofluorescent, och avlägsnande av ben utsätter cervical slinga (B ') och resten av epitelet, som sedan lätt kan skäras ut. (B'') Alla strukturer i halsslingan inklusive OEE, IEE, TA och SI kan lätt visualiseras med reportergenen. Skala barer B ', B "= 2 mm, B" = 50 pm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Översikt av dissekering och isolering av CL hos musen framtand. Schematisk representation av förfarandet. CL är belägen vid den proximala änden av den mandibular framtand. Det första steget är att avlägsna omgivande käkbenet för att exponera den framtand med CL intakt. Därefter placeras tanden organ isolerades och placerades i 2% kollagenas till separat epitel från mesenkym. Efter 4 timmars inkubering, är CL manuellt exciderades, dissocieras till enskilda celler och odlades ovanpå standardvävnadsodlingsplattor.
Figur 3. Bone avlägsnande av mus käken för att exponera den underliggande CL-regionen. Visuella kontrollpunkter för benet avlägsnande av dissektion process anges. (A) visar den halvkäke enfter Steg 1.5, när muskler, senor och ligament tas bort från benet. (B) Anger området för att börja ta bort ben, från strax under 3: e molar, rör sig proximalt mot regionen innehåller CL. Därefter är alla ben proximalt om CL bort (C), som i steg 2.4. Nästa snitt för att ta bort resten av benet såsom anges i Steg 2,5 är visad i (D). Slutligen CL avlägsnas från den återstående ben såsom anges i Steg 2,6 (E), förstorad vy (infälld).
Figur 4. Representativa resultat av framgångsrik kolonibildning in vitro. A. faskontrastmikroskopi av DESCs, efter plätering i odling under 7 dagar. Tight kolonibildning indikerar lyckad epitelial isolation med ingen förorening mesenkymala. Scale bar = 400 | im. B. Efter 10 dagars inkubation kolonier är större i storlek och celler en typisk epitelial gatsten morfologi. Skala bar = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelceller var först framgångsrikt odlade över 40 år sedan 21-24, och på senare tid, har framgångsrikt isolering av epitelceller stamceller 25-27 fram vår kunskap om epitelial biologi. Vi redovisar ett protokoll för att isolera DESCs av den vuxna musen framtand, en relativt understudied population av stamceller som har potential att ge viktiga insikter i tand biologi och emaljbildning. Detta protokoll var ursprungligen baserad på tidigare rapporter från epitelceller stamceller isolering från hårsäcken 28. Medan många protokoll använder matarskikt och serum för att upprätthålla epitelstamceller är vår metod en matare fritt, serumfritt system. Men gör vår tillväxtmedier kräver användning av en cocktail av EGF, FGF2 och B27 tillskott. EGF har länge använts för att bibehålla odifferentierade celler 29. En cocktail av EGF och FGF2 tillsammans med B27 användes tidigare till kultur hårsäcken stamceller 27, och B27 används i stor utsträckning för att upprätthålla neurala stamceller i kultur 30,31. Vi har också tidigare mätt livskraft och tillväxttakten egenskaper DESCs ovanpå vävnadsodling plast och på en mängd olika ECM-substrat, och inga skillnader upptäcktes i andelen spridning 19. Celler kan bibehållas i upp till 10 seriella passager 19.
Vi använder de nedre framtänderna för detta förfarande på grund av lättheten att avlägsna i förhållande till de övre framtänderna. De viktigaste stegen i våra protokoll under isolering är fullständig borttagning av CL-området från den mandibular ben innan du placerar i kollagenas och en ren microdissection av CL. Eftersom den proximala framtand är mycket känslig, är det viktigt att inte skada den under dissektion, vilket kan leda till förlust av labial CL. Ofullständig avskaffande kommer att leda till resterna av labialCL och ett lägre utbyte av DESCs. Dessutom är det viktigt att undvika kontaminering med icke-CL epitelceller. Alltså, efter epitelet har separerats från mesenkym, en ren V-format snitt måste göras för att ta bort den labiala CL från grann epitel. Slutligen är det viktigt att plätera dessa celler i en koncentration av mer än 1 x 10 4 celler per ml och lämnar hälften av det konditionerade mediet för första mediaförändringar.
Den största fördelen med detta protokoll för odontologisk forskning är att den möjliggör effektiv produktion och hantering av DESCs in vitro. Även musen framtand är etablerad som en in vivo-modell 7-9,12,32-34, utveckling av ett in vitro-system avancerar dental forskningsfältet genom att öppna dörrarna till experimenten som är svåra att utföra in vivo. Fördelar med detta system innefattar förmågan att lätt manipulera celler i olika odlingsbetingelser, lätt inriktning av en enda eller ens multipla signalvägar, och hämning eller aktivering av TArgeted molekyler med användning av siRNA eller tillväxtfaktorer. Nedströms tillämpningar av denna in vitro-system innefattar användning av de ovan angivna teknikerna samt andra tekniker skäregg att genomföra funktions-och / eller mekanistiska studier, i synnerhet på enkelcellnivå.
Sammantaget kan information som samlats från DESC in vitro-kultur bidra till att reda ut den invecklade stamcellsbaserad tand förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Xiu-Ping Wang för inledande hjälp med DESC kulturer. Författarna finansieras delvis genom stipendier och bidrag från National Institutes of Health (K99-DE022059 till AHJ, K12-GM081266 till MGC, K08-DE022377-02 till OH och R01-DE021420 till ODK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel |
| Forceps straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
References
- Sharpe, P. T., Young, C. S.
- D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
