Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Published: May 1, 2014 doi: 10.3791/51266
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 4,5,6, 1,7, 1,8
1Department of Orofacial Sciences and Program in Craniofacial and Mesenchymal Biology, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 3Department of Pathology and Research Center, Zhongshan Hospital of Dalian University, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, UMR S872, 5Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie Curie, UMR S872, 6INSERM U872, 7Division of Endodontics, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California, San Francisco, 8Department of Pediatrics and Institute for Human Genetics, University of California, San Francisco

Summary

Sürekli büyüyen fare kesici diş epitel kök hücreler (DESCs) diş dokularının yenilenmesini eğitim için bir model sağlar. Sürekli ve güvenilir bir şekilde kesici bu hücrelerin elde edilmesi ve in vitro ile genişletilmesi için sağlam bir sistem burada bildirilmektedir.

Abstract

Diş yenilenme ve yenileme altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması büyük ilgi 1-4 bir konu haline, ve fare kesici, bu işlemler için bir model sağlar sahiptir. Bu olağanüstü organ hayvanın hayatı boyunca sürekli büyür ve (dil doğru) (dudağa doğru) labial ve lingual servikal döngü (CL) bölgeleri muhafaza yetişkin kök hücrelerin aktif havuzlarından gerekli tüm hücre tiplerini oluşturur. Labiyali CL sadece diş kök hücreler labiyali yüzeyinde emaye, dişlerin dış kaplama oluşturmak ameloblastlar sebebiyet verir. Bu asimetrik mine teşekkülü kesici ucunda aşınma sağlar ve proksimal dişe atalarıdır ve kök hücreler diş dokuları sürekli doldurulan emin olun. Bu in vitro progenitör veya kök hücreleri izole ve büyümek için yeteneğini kendi genişleme sağlar ve saat gibi in vivo elde değil çok sayıda deney, kapılarını açıyorpotansiyel kök hücre düzenleyici faktör üksek throughput testi. Burada, biz tarif ve fare kesici dişin labial CL kültür hücreleri güvenilir ve tutarlı bir yöntem ortaya koymaktadır.

Introduction

Omurgalıların eşsiz özelliklerinden biri diş evrimdir. Moleküler yollar ve bu organın ilgili morfolojik uzmanlık gelişim ve evrimsel biyologlar 5 de dahil olmak üzere, çeşitli açılardan incelenmiştir gibi diş, araştırma birçok alanda önemli bir model sistem haline gelmiştir. Daha yakın zamanda, rejeneratif tıp alanında bir model olarak diş kullanarak değerli bilgiler kazanmaya başladı. Özellikle, diş epitel kök hücrelerin keşif önemli bir ilerleme 6-13 olmuştur.

Tüm kemirgenler erişkin kök hücre yönetmeliği incelemek için, bu dişlere erişilebilir bir model sistemi yapım olan büyüme kök hücreleri tarafından körüklenen sürekli büyüyen kesicilerin sahip. Genetik soy izleme deneylerinde 8,9,12,14 ardından 1970'lerde 10,11 etiketleme deneyleri, DESCs kesici proksimal bölgesinde bulunan olduğunu göstermiştir. KökHücre labiyali servikal döngü (CL) olarak bilinen, varsayılan niş, dışarı labial yan hareket epitel bölmeye döl ve geçiş yalıtım (TA) hücreleri (Şekil 1) adı verilen bir hücre popülasyonuna katkıda bulunur. Özellikle, DESCs dış mine epiteli (OEE) ve Stellate retikulum (SR) 8,9,14 ikamet ve iç mine epiteli (IEE) sonra hareket hücre döngüsü sınırlı sayıda ilerlerken TA hücrelere yol açar ve distal kesici uzunluğu (Şekil 1) boyunca. Fare dişe ayırt ameloblastlar tek bir günde 15,16 yaklaşık 350 mikron dikkate değer bir oranda kesici dişin boyunca distale hareket devam ediyor. Onlar hareket ettikçe, hücrelerin olgun ameloblastlar ve stratum intermedium (SI) hücrelerin içine ayırt. Emaye matris tam kalınlık olarak biriktirilmesi sonra ameloblastlar birçok apoptoz geçirir, ve geriye kalan hücreler boyutu küçültmek ve emaye olgunlaşmasını düzenleme <> 17 sup. Gibi SR gibi Labiyal CL, diğer hücre tiplerinin soy daha az açıktır ve mezenşimin 18 ve lingual CL kök hücrelerin ilişkin veriler sadece ortaya çıkmaya başlıyor.

Fare modeli kullanılarak kesici, grup bir dizi genetik yollar ve doğal kök hücre bazlı bir organ yenilenmesine katılan hücre biyolojik süreçleri aydınlatmak için çalıştık. Bununla birlikte, dudak CL 5,000 birincil hücreler zorlu çalışma yapar kesici fare başına olduğu tahmin hücrelerin nispeten küçük bir sayısını ihtiva etmektedir. Bu nedenle, kültür çalışmaları yapılmış ve in vivo olarak elde olmayan deneysel yaklaşımlar için yeni kapılar açmak için in vitro 6,16,19,20 bu hücreleri genişletmek edilmiştir. En son çalışma, bu hücreler, kendini yenileme ve kültürlendiğinde 13 hücreleri ifade Amelogenin içine ayırt hem göstermiştir. Burada, th için bir yöntem tarif etmekte ve açıklamaktadırfare labiyali CL hücrelerin e güvenilir ve tutarlı bir kültürü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Yetişkin Fare 1. Dissect Alt Hemi-altçeneler

  1. Önce bu protokolü gerçekleştirmek için, gerekli kurumsal onay almak ve tüm hayvan bakımı kurallarına uymak emin olun. Standart prosedürler IACUC onaylı kullanılarak hayvan Euthanize. Bu iş için CO 2 boğulma servikal dislokasyon kullanılmıştır.
    1. İSTEĞE BAĞLI: Bir jilet kullanarak vücudun geri kalanından ayrı kafa.
  2. Yaka için alt dudak deri çıkarın.
  3. Bir neşter kullanılarak, gevşek bağlı iki alt ön dişler arasında bir kesi yapmak. Basınç uygulayarak sonra, mandibula iki parçaya bölünecektir.
  4. Çene ayırmak için çene kondil ve altçenedeki eklem ve çene kas yanında kesim arasındaki neşter kama.
  5. Sadece kemik kalana kadar tüm kas, tendon ve bağ çıkarın.

2.. Insizör yalıtmak

  1. Bir # 15 neşter kullanılarakDikkatlice membranöz bölgenin yakın ucuna en uzak ucundan itibaren bir 45 ° açıyla kemik tıraş. Kenarında kemik parçaları da dahil olmak üzere kalan kemik uzağa almak için neşter ucu kullanın. Yavaş yavaş sadece 3. molar altında başlayan, mandibulanın lingual kortikal plaka uzakta almaya başlar.
  2. Kesici CL içeren alanına doğru dikkatli çalışıyor, temiz olana kadar devam edin.
  3. Inferior alveolar sinir desteyi.
  4. İlk CL proksimal kemik ve dokuları temizlemek için temiz kesim olun.
  5. Kabaca 2. molar altında neşter ile distale ikinci bir kesim yapmak. Proksimal kesici bölgesi, daha sonra kemik ile yakın kesici medial yüzeyi arasındaki neşter sokulmasıyla dışarı çıkarılmaktadır. Doku gözyaşı değil, böylece bu dikkatli yapılmalıdır. Kesi hareket proksimal-distal.
    ALTERNATİF ADIM:
    Yukarıdaki alan boyunca mümkün olduğu kadar kemik çıkarmakncisor. Alan temizlendikten sonra, dikkatlice emaye bölümünün, CL bölgeye yakın işlemek için bir boyut 5 forseps kullanarak tüm INCISOR kaldırın.
  6. Düşük yapışma plaka içerisinde 4 ° C'de 3-4 saat boyunca 1X PBS içinde% 2 kolajenaz olarak kesilmiş dokuları (alternatif Aşama 2.5 Şekil 3E olarak izole edilmiş CL, ya da tüm ya da kesici) yerleştirin. 1-10 kesici dişler için, 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 100 ul kullanın. 10 'den daha büyük kesici için, 6-çukurlu düşük yapışkan bir plaka içerisinde oyuk başına 500 ul kullanın.

3.. Microdissect Labial Servikal döngü

  1. Soğuk DMEM/F12 ortamı içinde kolajenaz ve yerden CL bölgesini çıkartın.
  2. Boyutu 5 forseps veya bir insülin şırıngası (1 cc, 28 G ½) kullanılarak CL alt ucunda yavaşça çekin; epitel bozulmadan mesenkimi ayrı düşecek. Bir "kanat-benzeri" bir yapı olarak yanal uzanır CL ve komşu epitel görünür olacaktır.
  3. KaldırmakHer iki tarafta bir V-şekilli bir kesi ve hemen buz üzerinde soğuk DMEM/F12 'de yer ile bitişik epitelden apikal tomurcuk.
  4. 1.5 ml mikrofuge'de tüp toplamak, tüm CLS için tekrarlayın.
  5. , Numuneler ile mikrofuj tüp aşağı Spin ortamları çıkartın, 100 ul hücre dekolmanı çözümü ile değiştirin.
  6. 37 ° C'de 30 dakika boyunca hücre ayırma çözeltisi içinde inkübe dokuları
  7. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 1.000 ul düşük yapışma pipet kullanarak tek bir hücre süspansiyonu üretmek için dokuları ayırmak. Hücreler, aynı zamanda ayrışma elde etmek için steril bir hücre süzgecinden yerleştirilebilir.
  8. Doku kültürü plastik veya diğer istenen malzeme üzerinde hemositometre, plaka hücreleri saymak.

DESCs 4. İlköğretim Kültür

  1. , 6-çukurlu bir plaka içerisinde Plaka hücreler 1-6 x 10 20 n 'lik bir konsantrasyonda fare EGF rekombinant proteini ile takviye edilmiş DMEM/F12 oluşur TANIM ortam içinde 4 hücre / ml,g / ml, 25 ng / ml 'lik konsantrasyonda, 1X B27 takviyesi, ve% 1 antibiyotik solüsyon (penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 ug / ml) de FGF rekombinant protein.
  2. % 5 CO2 TANIM eden 1 ml'lik ortam içinde 37 ° C 'de bir 6-yuvalı plaka üzerine kaplama hücreler büyür. Hücre yapışması ve koloni oluşumunu sağlamak için kaplama sonrası 5 gün boyunca ilk kültürleri rahatsız etmeyin.
  3. Birinci ortam değişikliği için, yeni medya yarı hacmine (500 ul) ile eski ortam hacmine (500 ul) yarısı değiştirin. Ortam değiştirirken mikroskop altında koloniler edin.
  4. Birinci ortam değişiklik yapıldıktan sonra, her 2 günde bir ortam (1-2 mi) değiştirmek için devam etmektedir. Ortam değiştirirken mikroskop altında koloniler edin.

5.. Passage DESCs

  1. Aspire medya ve yıkama hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile 3x.
  2. Tuzlu su çözeltisi içinde önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve ayırmak için DESCs için 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Tripsin nötralize etmek için DESC medya ekleyin, yavaşça 15 ml konik tüp hücreleri, yer ve toplamak için doku kültürü plaka boyunca pipetle.
  4. 2 dakika boyunca 800 xg'de hücreleri aşağı spin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare hemi-mandibul biri sürekli büyüyen kesici ve üç köklü azı dişini (Şekil 1A) oluşmaktadır. Tüm diş dentin ve emaye, diş taç iki mineralize bileşenleri (Şekiller 1A ve 1 A ') oluşmaktadır. Incisor evler iki kök hücre nişleri labial CL ve lingual CL denir ve emaye labial tarafında (Şekil 1A ') münhasıran oluşturulmuştur. DESCs kesici emaye oluşumundan sorumlu olan ve labial CL, özellikle OEE ve SR (Şekil 1A'') 8,9 yerleştirilmiştir. Labial CL da IEE, TA hücreleri ve SI (Şekil 1A'') içerir. Bizim teknik dudak CL (Şekil 1A'') arasında DESCs ve diseksiyon ve izolasyon odaklanmıştır. KRT14-aktin GFP hemi-çene (Şekil 1B) her epitel türetilmiş hücreler işaretleri ve labiyali CL açıkça görülebilir bir uçtan bir ucaöf mandibula (Şekil 1B ', beyaz ok). Bu, tüm hücre tipleri (Şekiller 1A karşılaştırın 've B'') daha yüksek bir büyütme altında tespit edilebilir olduğu unutulmamalıdır.

Labiyali CL DESCs izolasyonu için prosedür, Şekil 2 'de özetlenmiştir. Kısaca, hemi-çene birinci hayvan kaldırılır, alt çene kemiği labiyali CL açığa çıkarmak için çıkarılır ve daha sonra dudak CL için kollajenaz ile tedavi edilir çevredeki mezenşimin gelen epitel ayırın. CL, microdissected hücre ayrışma tampon maddesi ile muamele edilmiş ve doku kültür plakalarında kaplanmıştır. Temel çene kemiği arasındaki dudak CL ayrılması (Şekil 3) ve uygun bir ortam hacminin eklenmesi, sırasıyla, izolasyon ve kolonilerinin büyümesi için gereklidir. Bu tekniği kullanılarak oluşturulan küçük, sıkı epiteliyal koloniler, 7 günde (Şekil 4A) ile görebilirve bu, 2-3 hafta içinde (Şekil 4B) içinde büyük kolonilere büyüyebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Yetişkin fare kesici dişlerinin Çizimler. (A) yetişkin fare hemi-mandibula mineralize bileşenleri, mine ve dentin ve dişler, azı dişleri ve kesici dişlerin iki türlerini gösteren. DESCs yerleştirilmiştir proksimal kesici bölgesinde A vurgulanır '. (A') 2 kök hücre nişler gösteren proksimal kesici dişlerinin Sajital görünüm, labial ve lingual servikal döngü (lacl ve LiCİ), emaye üretmek ameloblastlar ve dentin oluşturan odontoblastlar. Münhasıran ameloblast atalarıdır hücrelerini üretir ve sonuçta lacl dış emaye epitel gösteren. (A'')'' kesici emaye A vurgulanır oluşturan lacl (OEE), stellate retikulum (SR), iç emaye epitel (IEE), transit yükseltici (TA) bölge ve stratum intermedium (SI). SR farklı yoğunluklarda subpopülasyonunun yansıtmak için mavi ve koyu pembe temsil edilir. Bir floresan muhabiri fare, KRT14-EGFP/Actb kullanarak servikal döngü (B) Görselleştirme. Kemik nispeten autofluorescent ve kemiğin çıkarılması servikal döngü (B ') ve daha sonra kolayca eksize edilebilir epitel, geri kalanını ortaya koyar. (B'') OEE, IEE, TA da dahil olmak üzere servikal döngünün tüm yapıları ve SI kolayca raportör gen ile görselleştirilebilir. Ölçek barlar B ', B "= 2 mm, B" = 50 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Fare kesici dişlerinin prosedürünün. Şematik gösterimi ve CL diseksiyon ve izolasyon Şekil 2.. Bakış. CL mandibular kesici en yakın ucunda yer almaktadır. İlk adım sağlam CL insizör maruz çevresindeki çene kemiği kaldırmaktır. Daha sonra, diş organı mezenşimin ayrı epiteline izole edilir ve% 2 kolajenaz yerleştirilir. 4 saat inkübe edildikten sonra, CL, el ile eksize edilir, tek hücre ayrışması ve standart doku kültürü plakaları üstünde kültürlendi.

Şekil 3,
Yatan CL bölgesini açığa çıkarmak fare mandibula'nın Şekil 3.. Kemik çıkarma. Diseksiyon sürecinin kemik kaldırılması için Visual kontrol noktaları gösterilmiştir. (A) hemi-mandibula a gösterirürkiye'de Adım 1.5, kas, tendon ve bağ kemikten kaldırılır kez. (B) CL içeren bölgeye yönelik proksimale hareket, sadece 3. molar aşağıdan başlayarak, kemik kaldırarak başlamak için bölgeyi gösterir. Adım 2.4 'de not edildiği gibi, CL tüm kemik yakın, (C) çıkarılır. Aşama 2.5 'de belirtildiği gibi, kemiğin geri kalanını kaldırmak için bir sonraki kesi (D)' de gösterilmiştir. Son olarak, CL Adım 2.6 (E) belirtildiği gibi geriye kalan kemik kaldırılır, büyütülmüş görünüm (inset).

Şekil 4,
Şekil 4,. Vitro başarılı koloni oluşumu temsil edici sonuçları. 7 gün boyunca kültür kaplama sonrası DESCs A. faz kontrast mikroskopisi. Sıkı koloni oluşumu başarılı epitel isolatio gösterirn hiçbir mezenkimal kirlenme ile. Ölçü bar = 400 um. B. inkübasyondan 10 gün sonra, koloniler büyük boyutta olan ve hücreler tipik epitel arnavut kaldırımı morfolojiye sahiptir. = 100 mikron Ölçek çubuğu. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitel hücreleri 40 yıl önce 21-24 başarıyla üzerinde ilk kültürlü idi, ve daha yakın zamanda, epitel kök hücrelerin 25-27 başarılı izolasyon epitel biyoloji bilgimizi ilerlemiştir. Biz yetişkin fare kesici dişlerinin DESCs, diş biyoloji ve mine oluşumuna dair önemli bilgiler verim potansiyeline sahip kök hücrelerin nispeten ilgili yeterli nüfusa izole etmek için bir protokol rapor. Bu protokol, ilk olarak kıl folikülü 28 epitel kök hücre izolasyonu daha önceki raporlarda dayanıyordu. Birçok protokolleri epitel kök hücreleri korumak için besleyici katmanları ve serum kullanmak ise, bizim yöntem besleyici ücretsiz, serum serbest sistemidir. Ancak, büyüme ortamı, EGF, FGF2 ve B27 ek bir karışımı içinde kullanılmasını gerektirir. EGF uzun farklılaşmamış hücreler 29 korumak için kullanılmıştır. B27 ile birlikte EGF ve FGF2'nin kokteyl kültürü saç folikülü kök hücre 27 için daha önce kullanılan edildi ve B27 yaygın kültür 30,31 nöral kök hücreleri korumak için kullanılır. Ayrıca, daha önce plastik doku kültürü üstünde ve ECM çeşitli substratlar üzerinde DESCs canlılığı ve büyüme hızı özelliklerine ölçtük, ve herhangi bir fark yayılması 19 oranlarında tespit edilmiştir. Hücreler en çok 10 seri pasajlar 19 boyunca muhafaza edilebilir.

Biz bu üst ön dişlerin kıyasla çıkarılması kolaylığı Bu prosedür için, alt kesicilerin kullanımı. Izolasyonu sırasında bizim protokolü içinde en önemli adımlar, kollajenaz ve CL temiz Mikrodiseksiyon koymadan önce çene kemiğinden CL alanının tam kaldırma vardır. Proksimal kesici çok hassas olduğundan, labial CL kaybına neden olabilecek, diseksiyon sırasında zarar görmemesi için önemlidir. Eksik kaldırma labialCL kalıntıları ve DESCs düşük bir verim sağlayacaktır. Buna ek olarak, non-C ile kirlenmesini önlemek için önemlidirL epitel hücreleri. Epitel mezenşimin ayrılır sonra böylece, temiz bir V-şekilli kesik komşu epitelden labiyali CL kaldırmak için yapılmalıdır. Son olarak, ml başına 4 x 1 10 hücre üzerinde bir konsantrasyonda bu hücreleri plaka ve birinci ortam değişikliği için kıvamlandırılmış ortamın yarısı bırakmak için gereklidir.

Diş araştırma bu protokolün önemli yararı verimli üretim ve in vitro DESCs manipülasyon izin vermesidir. Fare kesici bir in vivo modelde 7-9,12,32-34, bir in vitro sisteminin geliştirilmesi olarak kurulmuş olmasına rağmen in vivo gerçekleştirmek zor olan deneyleri kapılarını açarak diş araştırma alanını ilerler. Bu sistemin avantajları kolayca çeşitli kültür koşulları, bir ya da birden fazla sinyal yollarının kolay hedefleme hücreleri işlemek için yeteneği, ve TA inhibisyonu veya aktivasyonunusiRNA veya büyüme faktörleri kullanılarak rgeted molekülleri. Bu in vitro sistemde akış aşağısında uygulamalar özellikle tek hücre düzeyinde, işlevsel ve / veya mekanik çalışmalar yapmak için yukarıda belirtilen tekniklerin yanı sıra diğer kesim teknikleri kullanarak içerir.

Genel olarak, in vitro kültürde DESC toplanan bilgiler kök hücre bazlı diş yenilenmesi inceliklerini çözmeye yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Yazarlar AZALAN kültürlerle ilk yardım için Xiu-Ping Wang teşekkür ederim. Yazarlar (OH MGC, K08-DE022377-02 AHJ, K12-GM081266 için K99-DE022059 ve ODK R01-DE021420) Ulusal Sağlık Enstitüleri burs ve hibe tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
  2. D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
  3. Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
  4. Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
  5. Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
  6. Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
  7. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
  8. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
  10. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
  11. Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
  12. Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
  13. Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
  14. Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
  15. Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
  16. Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
  17. Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
  18. Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
  19. Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
  20. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  21. Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
  22. Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
  23. Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
  24. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  25. Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
  26. Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
  27. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  28. Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
  29. Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
  30. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  31. Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
  32. Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
  33. Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
  34. Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).

Tags

Hücre Biyolojisi Sayı 87 Kök epitel Stem Cells Erişkin Kök Hücreler Keser Servikal Loop Hücre Kültürü
Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K.,… More

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter