Neural progenitor mitos är en kritisk parameter för neurogenes. Mycket av vår förståelse av neurala progenitorceller mitos bygger på analyser av fast vävnad. Live avbildning i embryonala hjärnan skivor är en mångsidig teknik för att bedöma mitos med hög tids-och rumsupplösning i en kontrollerad miljö.
Även om en kort tid, är mitos en komplex och dynamisk process i flera steg av avgörande betydelse för utvecklingen av organ, inklusive hjärnan. I utvecklings hjärnbarken, kan abnorm mitos av neurala stamceller orsakar defekter i hjärnans storlek och funktion. Därför finns det ett kritiskt behov av verktyg för att förstå mekanismerna bakom neurala progenitorceller mitos. Kortikal utveckling hos gnagare är en enastående modell för att studera denna process. Neural progenitor mitos som brukar granskas i fasta hjärnsektioner. Detta protokoll kommer att i detalj beskriva ett tillvägagångssätt för live-avbildning av mitos i ex vivo embryonala hjärnan skivor. Vi kommer att beskriva de kritiska stegen för detta förfarande, som innefattar: hjärna utvinning, hjärna inbäddning, vibratome sektionering av hjärnan skivor, färgning och odling av skivor, och time-lapse avbildning. Vi kommer då att demonstrera och i detalj beskriva hur man utför efter förvärvsanalys av mitos. Vi inkluderar representativa resultat frOM denna analys med hjälp av det vitala färgämnet Syto11, transgena möss (histon H2B-EGFP och centrin-EGFP), och i livmodern elektroporering (mCherry-α-tubulin). Vi kommer att diskutera hur detta förfarande kan bäst optimeras och hur den kan modifieras för studier av genetiska regleringen av mitos. Live avbildning av mitos i hjärnan skivor är en flexibel metod för att bedöma effekterna av ålder, anatomi, och genetisk störning i en kontrollerad miljö, och för att generera en stor mängd data med hög tids-och rumsupplösning. Därav detta protokoll kommer att komplettera befintliga verktyg för analys av neurala progenitorceller mitos.
Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva hur man ska spela live avbildning av neurala progenitorceller mitos i embryonala hjärnan skivor. Med hjälp av live-avbildning av hjärnan skivor i kultur, ger detta protokoll en enkel metod för att analysera olika aspekter av mitos i neurala stamceller i en miljö som i hög grad liknar en in vivo-miljö. Den kan tillämpas på hjärnan hos muterade djur och / eller hjärnor som har manipulerats med i livmodern elektroporering) 1-5. Denna teknik är också idealiskt för att testa effekten av farmakologiska medel på neurala prekursorer "mitos genom att helt enkelt tillsätta ett medel till odlingsmediet. Sammanfattningsvis kommer den här artikeln att göra ett tekniskt utmanande protokoll tillgänglig för dem som studerar neurogenes.
Under neurogenes, distinkta neurala stamceller populationer genomgår noggranna divisioner att generera nervceller som så småningom bidrar till de sex kortikala skikt av den vuxna neocortex 6-8. Tidigt i kortikal utveckling, det neurala föregångare poolen expanderar som neuroepiteliala (NE) celler delar symmetriskt att själv förnya. NE celler omvandlar därefter in i radiella gliaceller (RGC). Inledningsvis RGC dela symmetriskt att producera två nya RGC, men under större delen av neurogenes, är asymmetrisk RGC främsta läge för division. I asymmetrisk uppdelning ger en RGC upphov till en ny RGC och antingen en post-mitotiska neuron, eller en mer specialiserad progenitor (antingen en kort neural prekursor (SNP), en yttre radiell glia (ORG), eller en mellanprodukt progenitor (INP) 2,3,7,9. INPS SNPs och Orgs kan sedan generera nervceller på sub-ventrikulära, ventrikulär och basala regionerna av cortex, respektive. Därför är celldelning av progenitorer en grundläggande process för att generera nervceller i neocortex.
Ett flertal studier pekar på ett samband mellan specifika mitotiska drag av RGC: er och ödet av dotterceller. Haydar et al. Och Takahashi et al.har visat att RGC mitotiska varaktighet och cellcykel ökad längd som neurogenesis fortskrider, ekade en slutsats i uppföljningsstudier 10-13. Ett antal studier har visat att mitotiska spindeln orientering i förhållande till kammaren påverkar aspekter av neurogenes och corticogenesis, däribland typer av nervceller genereras och placering av avkomma i hjärnan, respektive 3,10,14-16. Oavsett om klyvning plan orientering påverkar direkt cell öde är kontroversiell, men slutsatsen kvarstår att detta mitotiska parameter effekter neurogenes. Vidare understryker vikten av mitos är iakttagelsen att många gener som är involverade i mekaniken i mitos är avgörande för neurogenes och för korrekt hjärnans utveckling 17-20.
Mitos är en dynamisk process, men hittills mest studier som beskriver neurala progenitorceller mitos utnyttja analys av sektioner eller avbildning av neurala stamceller fast vävnad via cellodling in vitro. Således, de traditionella metoder för att utvärdera mitos bara ge en ögonblicksbild av denna process och misslyckas med att avslöja hur celler beter sig i en vävnad. Live avbildning av neurala progenitorceller mitos har allt mer blivit ett viktigt verktyg för att förstå neural progenitor funktion. För exempel hänvisas till dessa referenser 4,8,10,21-25. Flera framstående protokoll har publicerats för förberedelse och avbildning av hjärnan skivor 26,27. Men till dags dato har ett omfattande protokoll för avbildning och analys av mitosen inte beskrivits eller visats i videon.
Denna teknik ger flera viktiga fördelar jämfört med fasta analys av hjärnsektioner. Time-lapse analys av hjärnan skivor möjliggör generering av betydligt fler datapunkter som kan analyseras på ett flexibelt sätt. För det första är data som samlats in vid enskilda tidpunkter under loppet av flera minuter eller flera timmar. Man kan analysera enskilda tidpunkter (för att skapa en statisk montage) ellerkan kombinera olika tidpunkter i filmer. För det andra, konfokal avbildning av skivor gör det möjligt att ta fram uppgifter på olika Z-sektioner i hjärnan skivor. Som ett resultat kan de enskilda sektionerna skall analyseras. Alternativt kan högar av enskilda avsnitt kombineras till en maximal intensitet projektion. För det tredje, är analys görs i samband med en vävnad, avslöjar hur celler delar i förhållande till angränsande celler och strukturer. För det fjärde är den idealisk för analys av mutanter som visar vissa tecken på mitotiska defekter. Tillsammans detta protokoll kommer att bidra till att klargöra viktiga steg för att hjälpa utredarna som vill utföra live-avbildning av neurala progenitorceller mitos i sina egna laboratorier.
Den stora fördelen med det protokoll som vi har beskrivit är att den tillhandahåller en dynamisk tidsupplösning av mitos av neurala stamceller. Normalt är analyser för att visualisera mitos i den växande hjärnan utförs med hjälp av immunofluorescens sektioner fast vävnad. Men denna metod ger endast en ögonblicksbild av mitos vid en tidpunkt.
Det finns flera steg som är mest kritiska för avbildning mitos i hjärnan skivor: 1) De hjärnan skivor bör sitta kvar i agaros, för att…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiering från NINDS / NIH, R00-NS064197 och NINDS / NIH, R01NS083897 (både till DLS).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
EGF | for culture medium | ||
10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
petri dishes | for dissection of the embryos | ||
digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
spatula | to transfer brains | ||
paintbrush | alternative to transfer brains | ||
vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |