Neural progenitor mitose er en kritisk parameter for neurogenese. Meget af vores forståelse af neurale stamfader mitose er baseret på analyse af fast væv. Levende billeddannelse i embryonale hjernen skiver er en alsidig teknik til at vurdere mitose med høj tidslig og rumlig opløsning i et kontrolleret miljø.
Skønt af kort varighed, mitose er et komplekst og dynamisk multi-trins proces grundlæggende for udvikling af organer, herunder hjernen. I udviklingslandene hjernebarken kan unormal mitose af neurale progenitorer forårsage defekter i hjernens størrelse og funktion. Der er derfor et kritisk behov for værktøjer til at forstå de mekanismer, neural stamcelle mitose. Cortical udvikling i gnavere er en fremragende model til at studere denne proces. Neural progenitor mitose er almindeligt undersøgt i faste hjernesnit. Denne protokol vil beskrive i detaljer en metode til billeddannelse af mitose i ex vivo embryonale hjernen skiver. Vi vil beskrive de kritiske trin for denne procedure, som omfatter: hjerne udvinding, hjerne indlejring, vibratome sektionering af hjernen skiver, farvning og dyrkning af skiver, og time-lapse billeddannelse. Vi vil derefter vise og beskrive i detaljer, hvordan at udføre post-erhvervelse analyse af mitose. Vi inkluderer repræsentative resultater frabout denne analyse ved hjælp af vital farvestof Syto11, transgene mus (histon H2B-EGFP og centrin-EGFP), og i livmoderen elektroporation (mCherry-α-tubulin). Vi vil diskutere, hvordan denne procedure kan bedst optimeres, og hvordan den kan modificeres til undersøgelse af genetisk regulering af mitose. Levende billeder af mitose i hjernen skiver er en fleksibel tilgang til at vurdere virkningen af alder, anatomi, og genetisk forstyrrelse i et kontrolleret miljø, og for at skabe en stor mængde data med høj tidslig og rumlig opløsning. Derfor denne protokol skal supplere de eksisterende redskaber til analyse af neurale stamfader mitose.
Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive, hvordan at optræde live billeddannelse af neurale stamfader mitose i embryonale hjernen skiver. Brug af levende billeddannelse af hjernen skiver i kultur, denne protokol giver en enkel metode til at analysere flere aspekter af mitose i neurale stamfædre i et miljø meget lig en in vivo indstilling. Det kan anvendes til hjerner af mutante dyr og / eller hjerner, der er blevet manipuleret med i utero elektroporation) 1-5. Denne teknik er også ideel til at teste virkningen af farmakologiske midler på neurale prækursorer "mitose ved blot at tilføje et middel til dyrkningsmediet. I summen, vil denne artikel lave en teknisk udfordrende protokol tilgængelig for dem, der studerer neurogenesis.
Under neurogenese, adskilte neurale progenitorpopulationer gennemgå præcise divisioner til at generere neuroner, der i sidste ende bidrager til de seks kortikale lag af voksen neocortex 6-8. Tidligt i kortikale udvikling, den neurale forløber pulje udvider som neuroepitelceller (NE) celler deler symmetrisk til selv at forny. NE celler derefter konvertere til radiale gliaceller (rGCS). Oprindeligt rGCS opdele symmetrisk at producere to nye rGCS dog under hovedparten af neurogenese, rGCS 'vigtigste form for opdeling er asymmetrisk. I asymmetrisk opdeling, 1 RGC giver anledning til en ny RGC og enten en post-mitotisk neuron eller en mere specialiseret progenitor (enten en kort neural precursor (SNP), en ydre radial glia (ORG), eller et mellemprodukt progenitor (INP) 2,3,7,9. natur-, SNP'er og ORGS kan derefter generere neuroner på sub-ventrikulær, ventrikulær og basale regioner af hjernebarken, hhv. Derfor celledeling progenitorer er en grundlæggende fremgangsmåde til at generere neuroner i neocortex.
Talrige undersøgelser peger på en sammenhæng mellem specifikke mitotiske træk rGCS og skæbne datterceller. Haydar et al. Og Takahashi et al.har vist, at RGC mitotisk varighed og cellecyklus længde stigning som neurogenese provenu, en konstatering genlyd i opfølgende undersøgelser 10-13. En række undersøgelser har antydet, at mitotiske spindel-orientering i forhold til hjertekammer påvirker aspekter af neurogenese og corticogenesis, herunder typer af neuroner genererede og placering af afkom i hjernen, henholdsvis 3,10,14-16. Uanset om spaltning plane orientering direkte indflydelse celle skæbne er kontroversiel, men konklusionen er, at denne mitotiske parameter påvirkninger neurogenesis. Yderligere understrege vigtigheden i mitosen er den iagttagelse, at mange gener involveret i mekanikken i mitosen er afgørende for neurogenese og for korrekt hjernens udvikling 17-20.
Mitose er en dynamisk proces, men til dato de fleste undersøgelser beskriver neurale stamfader mitose udnytte analyse af faste vævssnit eller billeddannelse af neurale stamfædre via in vitro-cellekultur. Således mainstream metoder til at evaluere mitose kun give et øjebliksbillede af denne proces, og undlader at afdække, hvordan celler opfører sig på en væv. Live-billeddannelse af neurale stamfader mitose i stigende grad blevet et afgørende redskab til at forstå neurale stamfader funktion. For eksempler se disse referencer 4,8,10,21-25. Flere udestående protokoller er blevet offentliggjort til forberedelse og billeddannelse af hjernen skiver 26,27. Men til dato har en omfattende protokol for billedbehandling og analyse af mitose ikke beskrevet eller demonstreret i video.
Denne teknik giver flere væsentlige fordele i forhold fast analyse af hjernens sektioner. Time-lapse-analyse af hjernen skiver muliggør generering af betydeligt flere datapunkter, der kan analyseres på en fleksibel måde. For det første er data indsamlet på de enkelte tidspunkter i løbet af nogle minutter eller flere timer. Man kan analysere de enkelte tidspunkter (at oprette et statisk montage) ellerkan kombinere forskellige tidspunkter i film. For det andet, konfokal imaging skiver muliggør generering af data på forskellige Z-profiler i hjernen skiver. Som et resultat heraf kan de enkelte sektioner analyseres. Alternativt kan stakke af individuelle sektioner kombineres til en maksimal intensitet projektion. For det tredje analyse udført i forbindelse med et væv, der afslører, hvordan celler deler i forhold til de omkringliggende celler og strukturer. For det fjerde er det ideelt til analyse af mutanter, der viser nogle beviser for mitotiske defekter. Sammen denne protokol vil bidrage til at afklare vigtige skridt til at hjælpe efterforskere, der ønsker at udføre levende billeddannelse af neurale stamfader mitose i deres egne laboratorier.
Den største fordel ved protokollen vi har beskrevet, at det giver en dynamisk tidsmæssige opløsning i mitosen af neurale stamceller. Typisk er assays at visualisere mitose i hjernens udvikling udført ved hjælp immunfluorescens af faste vævssnit. Men denne tilgang kun giver et øjebliksbillede af mitose på et tidspunkt.
Der er flere trin, der er mest kritiske for billeddannelse mitose i hjernen skiver: 1) De hjernen skiver skal forblive fastgjort til agarose, for at bevare integr…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkender finansiering fra NINDS / NIH, R00-NS064197 og NINDS / NIH, R01NS083897 (både DLS).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
EGF | for culture medium | ||
10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
petri dishes | for dissection of the embryos | ||
digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
spatula | to transfer brains | ||
paintbrush | alternative to transfer brains | ||
vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |