तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा neurogenesis के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा के बारे में हमारी समझ के ज्यादातर तय ऊतक के विश्लेषण पर आधारित है. भ्रूण मस्तिष्क स्लाइसें में लाइव इमेजिंग एक नियंत्रित वातावरण में उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ पिंजरे का बँटवारा का आकलन करने के लिए एक बहुमुखी तकनीक है.
कम अवधि की है, पिंजरे का बँटवारा मस्तिष्क सहित अंगों के विकास के लिए मौलिक एक जटिल और गतिशील बहु कदम प्रक्रिया है. विकासशील मस्तिष्क प्रांतस्था में तंत्रिका progenitors के असामान्य पिंजरे का बँटवारा मस्तिष्क के आकार और समारोह में दोष पैदा कर सकता है. इसलिए, तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा के तंत्र को समझने के लिए इस उपकरण के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. कृन्तकों में cortical विकास इस प्रक्रिया के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है. तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा सामान्यतः निश्चित मस्तिष्क वर्गों में जांच की है. इस प्रोटोकॉल में विस्तार से पूर्व vivo भ्रूण मस्तिष्क स्लाइसें में पिंजरे का बँटवारा के रहते इमेजिंग के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करेंगे. मस्तिष्क निकासी, मस्तिष्क एम्बेडिंग, मस्तिष्क स्लाइस की vibratome सेक्शनिंग, धुंधला और स्लाइस के संवर्धन, और समय चूक इमेजिंग: हम शामिल है, जो इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन करेंगे. हम तो प्रदर्शन और पिंजरे का बँटवारा के बाद अधिग्रहण विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए विस्तार से वर्णन करेंगे. हम प्रतिनिधि परिणाम fr शामिलओम महत्वपूर्ण डाई Syto11, ट्रांसजेनिक चूहों (histone H2B-EGFP और centrin-EGFP), और utero electroporation में (mCherry-α-ट्यूबिलिन) का उपयोग करते हुए इस परख. हम इस प्रक्रिया का सबसे अच्छा अनुकूलित किया जा सकता है और कैसे यह पिंजरे का बँटवारा की आनुवंशिक विनियमन के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है पर चर्चा करेंगे. मस्तिष्क स्लाइसें में पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग एक नियंत्रित वातावरण में उम्र, शरीर रचना विज्ञान, और आनुवंशिक गड़बड़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए, और उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ डेटा की एक बड़ी राशि उत्पन्न करने के लिए एक लचीला दृष्टिकोण है. इसलिए इस प्रोटोकॉल तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा के विश्लेषण के लिए मौजूदा उपकरणों के पूरक होगा.
इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य भ्रूण मस्तिष्क स्लाइसें में तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन करने के लिए है. संस्कृति में मस्तिष्क के स्लाइस के रहते इमेजिंग का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल एक Vivo में स्थापित करने के लिए अत्यधिक समान वातावरण में तंत्रिका progenitors में पिंजरे का बँटवारा के कई पहलुओं परख के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. यह) utero electroporation में से 1-5 चालाकी से किया गया है कि उत्परिवर्ती जानवरों और / या दिमाग के दिमाग के लिए लागू किया जा सकता है. इस तकनीक को बस संस्कृति के माध्यम से एक एजेंट जोड़कर, तंत्रिका व्यापारियों 'पिंजरे का बँटवारा पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए भी आदर्श है. संक्षेप में, इस लेख न्यूरोजेनेसिस का अध्ययन करने वालों के लिए एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल सुलभ बनाना होगा.
Neurogenesis के दौरान अलग तंत्रिका पूर्वज आबादी अंततः 6-8 neocortex वयस्क के छह cortical परतों के लिए योगदान है कि न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए सटीक डिवीजनों से गुजरना. Neuroepithelial (पूर्वोत्तर) कोशिकाओं स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए संतुलित रूप से विभाजित के रूप में जल्दी cortical विकास में, तंत्रिका अग्रदूत पूल फैलता है. पूर्वोत्तर कोशिकाओं तो रेडियल glial कोशिकाओं (RGCs) में परिवर्तित. प्रारंभ में RGCs हालांकि neurogenesis के थोक दौरान, विभाजन की RGCs 'मुख्य मोड असममित है, दो नए RGCs उत्पादन को संतुलित रूप से विभाजित करते हैं. असममित विभाजन में, 1 RGC एक नया RGC और या तो एक के बाद mitotic न्यूरॉन, या एक अधिक विशिष्ट पूर्वज (या तो एक छोटी तंत्रिका अग्रदूत (SNP), एक बाहरी रेडियल glia (ओआरजी), या एक मध्यवर्ती पूर्वज (INP) को जन्म देता है 2,3,7,9. INPS, SNPs, और orgs तो उप निलय, निलय में न्यूरॉन्स उत्पन्न कर सकते हैं, और प्रांतस्था के बेसल क्षेत्रों, क्रमशः. इसलिए, progenitors की कोशिका विभाजन के न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक बुनियादी प्रक्रिया है neocortex.
कई अध्ययनों से विशिष्ट mitotic RGCs के लक्षण और बेटी की कोशिकाओं के भाग्य के बीच एक संबंध को इंगित करें. हैदर एट अल. और ताकाहाशी एट अल.RGC mitotic अवधि और neurogenesis आय के रूप में सेल चक्र लंबाई बढ़ाने, एक ढूँढने पढ़ाई 10-13 अनुवर्ती कार्रवाई में गूँजती दिखाया है. अध्ययन का एक नंबर निलय को mitotic धुरा उन्मुखीकरण सापेक्ष क्रमश मस्तिष्क में उत्पन्न न्यूरॉन्स के प्रकार और संतान का स्थान, 3,10,14-16 सहित न्यूरोजेनेसिस और corticogenesis के पहलुओं, को प्रभावित करती है कि सुझाव दिया है. दरार विमान अभिविन्यास सीधे सेल भाग्य को प्रभावित करती है चाहे विवादास्पद है, लेकिन निष्कर्ष है कि इस mitotic पैरामीटर प्रभावों न्यूरोजेनेसिस बनी हुई है. इसके अलावा पिंजरे का बँटवारा के महत्व को रेखांकित पिंजरे का बँटवारा के यांत्रिकी में शामिल कई जीनों neurogenesis के लिए और उचित मस्तिष्क विकास 17-20 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि अवलोकन है.
सूत्रीविभाजन एक गतिशील प्रक्रिया है, अभी तक तारीख करने के लिए तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा ब्यौरा ज्यादातर अध्ययनों में इन विट्रो सेल संस्कृति के माध्यम से तय ऊतक वर्गों या तंत्रिका progenitors की इमेजिंग के विश्लेषण का उपयोग. इस प्रकार, पिंजरे का बँटवारा मूल्यांकन करने के लिए मुख्यधारा के तरीकों केवल इस प्रक्रिया का एक स्नैपशॉट प्रदान करने और कोशिकाओं को एक ऊतक में कैसे व्यवहार को उजागर करने में विफल. तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग तेजी से तंत्रिका पूर्वज समारोह को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. उदाहरण के लिए इन संदर्भों को देखने के लिए कृपया 4,8,10,21-25. कई बकाया प्रोटोकॉल तैयारी और मस्तिष्क स्लाइसें 26,27 की इमेजिंग के लिए प्रकाशित किया गया है. हालांकि आज तक, इमेजिंग और पिंजरे का बँटवारा के विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया है और न ही वीडियो में प्रदर्शन किया.
इस तकनीक मस्तिष्क वर्गों की अचल विश्लेषण पर कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. मस्तिष्क के स्लाइस के समय चूक विश्लेषण एक लचीला फैशन में विश्लेषण किया जा सकता है कि काफी अधिक डेटा बिंदुओं की पीढ़ी सक्षम बनाता है. सबसे पहले, डेटा कई मिनट या कई घंटे के कोर्स पर व्यक्तिगत समय बिंदुओं पर इकट्ठे हुए है. एक व्यक्ति समय अंक (एक स्थिर असेंबल बनाने के लिए) या विश्लेषण कर सकते हैंफिल्मों में अलग अलग समय बिंदुओं को जोड़ सकते हैं. दूसरा, स्लाइस की confocal इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइसें में अलग जेड वर्गों में डेटा की पीढ़ी सक्षम बनाता है. नतीजतन, व्यक्तिगत वर्गों का विश्लेषण किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अलग अलग वर्गों के ढेर अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण में जोड़ा जा सकता है. तीसरा, विश्लेषण कोशिकाओं पड़ोसी कोशिकाओं और संरचनाओं के सापेक्ष विभाजित खुलासा कैसे, एक ऊतक के संदर्भ में किया जाता है. चौथा, यह आदर्श mitotic दोषों के कुछ सबूत बताते हैं कि म्यूटेंट के विश्लेषण के लिए अनुकूल है. साथ में इस प्रोटोकॉल उनकी अपनी प्रयोगशालाओं में तंत्रिका पूर्वज पिंजरे का बँटवारा की लाइव इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए जो चाहते हैं जांचकर्ताओं सहायता करने के लिए महत्वपूर्ण कदम स्पष्ट करने में मदद करेगा.
हम वर्णन किया है प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह तंत्रिका progenitors के पिंजरे का बँटवारा की एक गतिशील अस्थायी समाधान प्रदान करता है. आमतौर पर, विकासशील मस्तिष्क में पिंजरे का बँटवारा कल्पना करने के लिए assays तय ऊतक …
The authors have nothing to disclose.
लेखकों NINDS / एनआईएच, R00-NS064197 और NINDS / एनआईएच, R01NS083897 (DLS के लिए दोनों) से धन स्वीकार करते हैं.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
EGF | for culture medium | ||
10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
petri dishes | for dissection of the embryos | ||
digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
spatula | to transfer brains | ||
paintbrush | alternative to transfer brains | ||
vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |