Neural митоза предшественников является критическим параметром нейрогенеза. Большая часть нашего понимания нейронной митоза предшественников на основе анализа основного ткани. Онлайн изображений в эмбриональных срезах мозга является универсальный метод для оценки митоза с высоким временным и пространственным разрешением в контролируемой среде.
Хотя непродолжительны, митоз является сложной и динамичной многоступенчатый процесс основополагающее значение для развития органов, включая мозг. В развивающихся коры головного мозга, нарушение митоза нейронных клеток-предшественников может вызвать дефекты в размере мозга и функции. Таким образом, существует острая необходимость в инструментах, чтобы понять механизмы нервной митоза предшественников. Развития коры у грызунов является выдающимся моделью для изучения этого процесса. Neural митоза предшественников обычно рассматриваются в фиксированных срезов головного мозга. Этот протокол будет подробно описать подход к живого изображения митоза в бывших естественных условиях эмбриональных срезах мозга. Мы опишем важные шаги для этой процедуры, которые включают в себя: добычу мозга, мозг вложение, Vibratome секционирования срезах мозга, окрашивание и культивирование срезов и покадровой обработки изображений. Затем мы продемонстрировать и подробно описывают, как выполнять анализ после приобретения митоза. Мы включаем Представитель Результаты фром этот анализ с использованием жизненно красителя Syto11 трансгенные мыши (гистонов H2B-EGFP и ЦентрИН-EGFP) и внутриутробное электропорации (mCherry-α-тубулина). Мы обсудим, как эта процедура может быть лучше оптимизирован и как он может быть изменен для изучения генетической регуляции митоза. Живая съемка митоза в срезах мозга является гибкий подход к оценке влияния возраста, анатомии, и генетической возмущения в контролируемой среде, и генерировать большое количество данных с высоким временным и пространственным разрешением. Поэтому этот протокол будет дополнять существующие инструменты для анализа нейронной митоза предшественников.
Общая цель этого протокола заключается в описании, как выполнять Живая съемка нервной митоза предшественников в эмбриональных срезах мозга. Использование живых изображений срезах мозга в культуре, этот протокол обеспечивает простой метод для анализа несколько аспектов митоза в нейронных клеток-предшественников в среде высоко аналогичной обстановке в естественных условиях. Он может быть применен к мозгу мутантных животных и / или мозгов, которые были изменены с внутриутробное электропорации) 1-5. Этот метод также идеально подходит для проверки эффекта фармакологических агентов на митоз нейронных предшественников, путем простого добавления агента к культуральной среде. В целом, эта статья будет сделать технически сложный протокол доступным для тех, кто учится нейрогенез.
Во время нейрогенеза, различные нервные популяции предшественников пройти точные подразделения генерировать нейроны, которые в конечном итоге способствуют шести корковых слоев взрослого неокортекс 6-8. В начале развития коры, нейронная бассейн предшественником расширяется нейроэпителиальные (NE) клетки делятся симметрично самообновлению. NE клетки затем конвертировать в радиальных глиальных клеток (РГК). Первоначально РГК разделить симметрично производить два новых РГК, однако во время навалом нейрогенеза, основным видом РГК "деления является асимметричной. В асимметричных делений, 1 РГК приводит к новому РГК и либо постмитотических нейрона, или более специализированный прародителя (либо короткий нейронная предшественника (SNP), внешней радиальной глии (ORG), или промежуточного прародителя (ИЯФ) 2,3,7,9. INPS, ОНП, и Orgs может генерировать нейроны в суб-желудочка, желудочка и базальных отделах коры, соответственно. Таким образом, деление клетки из клеток-предшественников является фундаментальным процессом генерации нейронов неокортекс.
Многочисленные исследования указывают на корреляции между конкретными митоза черт РГК и судьбе дочерних клеток. Хайдар и др.., А Такахаши и др..показали, что продолжительность митотического РГК и длина клеточного цикла увеличение как нейрогенез доходов, нахождение отражение в последующих исследованиях 10-13. Ряд исследований показали, что митотического веретена ориентации по отношению к желудочка влияет аспекты нейрогенеза и corticogenesis, в том числе типов нейронов, генерируемых и месте потомства в мозгу, соответственно 3,10,14-16. Будь декольте самолет ориентация напрямую влияет судьбы клеток является спорным, но вывод остается, что это митотический воздействие параметров нейрогенез. Далее подчеркивает важность митоза является наблюдение, что многие гены, участвующие в механике митоза имеют решающее значение для нейрогенеза и для правильного развития мозга 17-20.
Митоз представляет собой динамический процесс, но на сегодняшний день большинство исследований подробно нейронной митоза предшественников используют анализ разделов фиксированных тканей или изображений нейронных клеток-предшественников через в пробирке культуре клеток. Таким образом, способы господствующие для оценки митоза только дают представление о данном процессе и не в состоянии раскрыть, как клетки ведут себя в ткани. Живая съемка нервной митоза предшественников все чаще становится важным инструментом для понимания нейронной функции предшественников. Примеры см. эти ссылки 4,8,10,21-25. Несколько выдающихся протоколы были опубликованы для подготовки и обработки изображений срезов мозга 26,27. Однако до настоящего времени, комплексный протокол для обработки изображений и анализа митоза не было описано и не показано в видео.
Этот метод имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с фиксированной анализа срезов головного мозга. Покадровый анализ срезах мозга позволяет поколение значительно более точек данных, которые могут быть проанализированы в гибкой форме. Во-первых, данные собираются в отдельных точках времени в течение нескольких минут или нескольких часов. Можно анализировать отдельные моменты времени (для создания статического монтаж) илиможно совмещать различные моменты времени в кино. Во-вторых, конфокальной микроскопии срезов позволяет генерировать данные на разных Z секций в срезах мозга. В результате отдельные секции могут быть проанализированы. Кроме того, стеки отдельных секций могут быть объединены в максимальной проекции интенсивности. В-третьих, анализ выполняется в контексте ткани, показывая, как клетки делятся относительно соседних ячеек и сооружений. В-четвертых, он идеально подходит для анализа мутантов, которые показывают некоторые признаки митоза дефектов. Вместе этот протокол поможет прояснить важные шаги, чтобы помочь следователям, которые желают осуществлять живую съемку нервной митоза предшественников в их собственных лабораториях.
Основным преимуществом протокола мы описали, что она обеспечивает динамический временное разрешение митоза нейронных клеток-предшественников. Как правило, анализы визуализировать митоза в развивающемся мозге выполняются с помощью иммунофлюоресценции секций фиксированных тканей. ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают, финансирование из NINDS / NIH, R00-NS064197 и NINDS / NIH, R01NS083897 (как в DLS).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
EGF | for culture medium | ||
10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
petri dishes | for dissection of the embryos | ||
digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
spatula | to transfer brains | ||
paintbrush | alternative to transfer brains | ||
vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |