Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Published: March 25, 2014 doi: 10.3791/51308
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

ERRATUM NOTICE

Summary

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Abstract

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב 1,2. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC II ישתנה לפורמט 384 גם. פרוטוקול scaled למטה מפחית עלויות מגיב על ידי 75% ותפוקה גבוהה יותר מאשר שתואר קודם לכן פרוטוקולי 96 היטב 1,3-5. באופן ספציפי, תכנון הניסוי מאפשר ניתוח חזק ושחזור של עד 15 פפטידים נגד אחד אלל MHC II לכל צלחת ELISA 384 גם. באמצעות רובוט טיפול נוזל יחיד, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד כדי לנתח כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. אחרים עובדים בתחומי deimmunization חלבון או עיצוב ופיתוח חיסון עשויים למצוא את הפרוטוקול כדי להיות שימושי בהנחיית העבודה שלהם. בפרט, הוראות והפורמט ויזואלי צעד אחר צעדשל יופיטר צריך לאפשר למשתמשים אחרים, כדי לקבוע במהירות ובקלות במתודולוגיה זו במעבדות שלהם.

Introduction

חלבונים הם ברמת הצמיחה המהירה ביותר של סוכנים טיפוליים 6, וההתרחבות המהירה של צינורות biotherapeutic התמקדה תשומת לב הולכת וגובר על האתגרים הקשורים בהתפתחות ושימוש בתרופות חלבון. שיקול אחד ייחודי נובע מהעובדה כי במערכת חיסונית בריאה ומתפקדת, כל החלבונים תאיים נדגמים על ידי תאי המציגים אנטיגנים (נגמ"שים). הפנים פעם על ידי נגמ"שים, חלבון הוא ביקע לרסיסי פפטיד קטנים, ומגזרי immunogenic משוערים נטענים לתוך החריץ של הכיתה השנייה חלבונים עיקריים histocompatibility המורכבים (MHC II). פפטיד-MHC II מתחמים לאחר מכן מוצגים על פני APC, ופפטידים immunogenic אמיתיים, המכונים אפיטופים תא T, יצירת קומפלקסי קולטן תא משולש MHC II-peptide-T עם קולטנים בתא שטח מאותו מקור T מסוג CD4 7. אירוע הוקרה זה קריטי מולקולרי יוזם מפל מורכב איתות, שהתוצאה של הפעלת תאי T, את שחרורו של ציטוקיניםים, התבגרות תא T מסוג CD4 תא בתיווך ב ', וסופו של דבר ייצור של מחזורי נוגדני IgG אשר נקלטות על ידי ולנקות את חלבון אקסוגני הפוגע. לפיכך, חלבוני immunogenic עשויים להיות deimmunized ידי זיהוי אפיטופים תא T מכונן ומוטצית שאריות מרכזיות שהיו אחראיות להיווצרות מורכבת MHC II. זה ראוי לציין, עם זאת, כי אפיטופים תא T יכולים להיות רבים ורחב בפריסת חלבוני immunogenic, והרוב המכריע של מוטציות מחיקה-epitope עלול לגרום לאובדן לא מכוון של תפקוד חלבון או יציבות. לכן, הנדסת deimmunized biotherapies יכול להיות אובייקטיבי מורכבת ומאתגרת מבחינה טכנית, אך קיימות מספר דוגמאות לפרויקטים המוצלחים T epitope תא מחיקה 3,5,8-12. שלא כמו "האנשה" המבוסס על השתלה, אשר מוגבלת במידה רבה לרפויות נוגדן, מחיקת epitope יכולה להיות מיושמת למעשה כל יעד חלבון ללא קשר לרצף, מבנה, תפקוד, או הזמינות של homologoשלנו פיגומים אנושיים. הצעד הראשון ליישום גישה כזו הוא זיהוי של אפיטופים פפטיד מפתח מוטבעים בתוך רצף חלבון המטרה.

מבחני ביוכימיים תפוקה גבוהה באמצעות פפטידים סינטטיים ומולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות ראשוניות מהירה לזיהוי אפיטופ והפחתה 1,3-5. מבחני מסוג ELISA אלה יכולים להיות חזק כדי להשלים כלי עיצוב ופיתוח חלבון / חיסון אחרים. לדוגמא, אחד גישה ניסויית מבוססת היטב למיפוי epitope מסתמכת על זמן, עבודה ומשאבי מבחני אינטנסיביים vivo לשעבר התפשטות תאי 15. בקצרה, הרצף הראשוני של חלבון מטרה מחולק ראשונה לפנל של פפטידים חופפים, לעתים קרובות 15 מרס עם 12 שאריות חפיפה בין פפטידים סמוכים. פנל פפטיד הוא סינתזה כימית וimmunogenicity של כל הפפטיד נבדק באחד מכמה immunoassays שונה המעסיקות bloo ההיקפיתאים מונונוקלארים ד (PBMC) מבודדים מתורמים אנושיים 13,14. כדי לספק ביטחון רב יותר בתוצאות, פפטידים שנבדקו בדרך כלל בלשכפל עם PBMC מ50 או יותר תורמים שונים. במקרים בהם deimmunization הוא המטרה הסופית, העבודה מורכבת עוד יותר על ידי הצורך לייצר פנלים נוספים של פפטידים שעברו מוטציה ולבדוק את לוחות פפטיד החדשים במבחני PBMC לפני החדרת כל מוטציות deimmunizing לחלבון באורך מלא עבור הניתוח פונקציונלי הבא 10. בעוד מבחני הסלולריים אלה נשארים תקן הזהב להערכת פוטנציאל immunogenic בחולים אנושיים, את היעילות של גישה כזו ממצה ניתן לשפר על ידי prefiltering אפיטופים immunogenic משוערת באמצעות תפוקה מהירה וגבוהה assay מחייב MHC II-peptide.

כמו כן, ניתן לשלב מבחני פפטיד-MHC II ביוכימיים מחייבים עם חזוי בשיטות סיליקו כדי להאיץ את תהליך זיהוי אפיטופ באופן קיצוני.קיים מגוון רחב של כלים חישוביים לחיזוי epitope תא T; דוגמאות כוללות 16 ProPred, 17 MHCPred, 18 SVRMHC, ARB 19, SMM ליישר 20, NetMHCIIpan 21 כמו גם כלים קניינית כגון EpiMatrix ידי 22 EpiVax. כמו כן, מנבאי epitope לאחרונה בשילוב עם ביואינפורמטיקה וכלים אחרים הדמיה מולקולריות להניב אלגוריתמי deimmunization משולבים חלבון שנועדו לצמצם את הסיכון שמוטציות deimmunizing עלולות לשבש את מבנה חלבון ותפקוד 23-26. בעוד כמה מנבאי epitope הוכיחו להיות 27,28 מדויק למדי, תוצאות חישובית תמיד דורשות אימות ניסיוני. שיטות ניסיוניות מהיר, תפוקה גבוהה, וחסכונית הם מתאימים ביותר כמסנן ראשוני לתחזיות epitope סיליקו.

ברוח דומה, מנבאי epitope יכולים לנהוג בחירת אנטיגן לvaccinolo ההפוךGY 29,30. לדוגמא, התקדמות ביואינפורמטיקה הניבה מסכי הגנום כולו, כי במהירות לזהות מועמדי חיסון בצורה של חלבונים שלמים או אפיטופים פפטיד המופקים מproteomes הפתוגן. בעוד טכנולוגיה שמאפשרת את זה הוא עיצוב מחדש גילוי ופיתוח של חיסוני מגן, הוא מציג אתגר חדש בצורה של רשימות גדולות intractably של מועמדי חיסון immunogenic. מבחני מחייבים תפוקה גבוהה פפטיד-MHC II יכולים להדריך את בחירת epitope ידי כימותי זיקה מחייבת פפטיד ומחייב הפקרות בין אללים MHC II מרובים. כמו עם deimmunization חלבון, שיטות ניסיוניות כאלה סופו של דבר נדרשו כדי לאמת את הניבוי חישובית של מוביל חיסון מבטיח.

הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לפורמט 384 גם הוא תאר. הפרוטוקול הוא למקבל ביותר ומפחית את העלויות מגיב על ידי 75% בהשוואה שלתואר קודם לכן 96 היטב פורמטי צלחת 1,3-5. שימוש של נוזלים אחתד טיפול ברובוט, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד לנתח בקלות כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. מאמר זה מתאר את ההתקנה של צלחת 384 גם ELISA אחד לניתוח של שבעה פפטידים ניסיוניים נגד אחד אלל MHC II, אבל מחשבוני גיליון להפיץ מסופקים כחומר משלים כדי להתרחב בקלות את הניסוי לכל מספר של פפטידים ו / או MHC רצויים השני מולקולות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ארבע פעילויות עיקריות מרכיבות את assay מחייב פפטיד-MHC II: 1-איגוד: פפטידים מבחן להתחרות עם פפטידים שליטה שכותרתו עבור שלב פתרון מחייב של חלבוני MHC II מסיסים. כריכה נמדדת על פני טווח רחב של ריכוזי פפטיד בדיקה. 2-Capture: לאחר התגובה מחייבת גישות שיווי משקל, פפטיד-MHC II מתחמים נלכדים ומופרד מפפטיד מאוגד וחלבון על ידי הכרת קונפורמציה תלויה עם נוגדן משותק. 3 איתור: פפטיד שליטה שנתפס הוא כמותית זוהה באמצעות הקרינה זמן נפתר. 4 ניתוח-: נתונים ספקטרליים מעובדים, זממו ונותחו כדי לקבוע מאפיינים המחייבים תלוי מינון של הפפטיד מבחן וחלבונים MHC II.

בשלבים שונים בהליך שלהלן, השימוש ברובוט טיפול נוזל מומלץ אם הוא זמין. במיוחד בפורמט 384 גם, מחלק ודילול של נוזלים אוטומטיים ממזער שגיאת משתמש, תוצאות יותרכרכים עקביים היטב היטב, ומניב רווחי סמך 95% צרים עבור IC 50 ערכים בהשוואה למבחני מדריך ל96 היטב (מידע לא מוצג). אם רובוט טיפול נוזלי אינו זמין, הצעדים מבואר עם "(רובוט נוזל טיפול)" ניתן לעשות זאת באופן ידני. בדומה לכך, אם אפשר, מכונת כביסה צלחת אוטומטית שתואמת לפורמט 384 גם מומלצת. זה למעשה סטנדרטיזציה תהליך הכביסה הצלחת. אם מכונת כביסה צלחת אינה זמינה, הצעדים מבואר עם "(מכונת כביסה צלחת)" ניתן לעשות זאת באופן ידני.

1. מעיל פלייט ELISA (יום 1)

  1. לדלל L243 מניית נוגדן (0.5 מ"ג / מיליליטר) בBorate הצפת לריכוז עבודה של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
    1. למעייל צלחת 384 גם יחידה, להוסיף 200 μl של נוגדן המניה ל9.8 מיליליטר של Borate הצפת. (ראה מחשבון גיליון אלקטרוני נוסף לקנה מידה חלופית).
  2. הוסף 25 μl של פתרון L243 הנוגדן היטב בכל 384-well גבוה מחייב צלחת ELISA לבנה. (רובוט טיפול נוזלי)
  3. חותם את הצלחת עם סרט פוליאסטר ודגירת הלילה בשעה 4 ° C.
    הערה: כל צלחת ELISA 384 גם יכולה להכיל עד 15 פפטידים מבחן בשמונה דילולים לאחד אלל MHC II, כמו גם בקרות החיוביות ושליליות. זה סופו של דבר יניבו מדידות בשלושה עותקים.

2. הפוך בדיקת פפטיד הדילולים (יום 1)

  1. החל עם מניית 10 מ"מ של כל פפטיד מבחן בDMSO, להפיק את סדרת הדילול הבאה בציטראט פוספט הצפת באמצעות צלחות 384 גם פוליפרופילן (טבלת 1). (רובוט טיפול נוזלי)
    הערה: צלחת פוליפרופילן 384 גם מלאה דורשת שלוש צלחות ELISA נפרדות. שליש מצלחת פוליפרופילן ידרוש רק אחד צלחת ELISA (איור 1).
מספר דילול לא נפחo לקחת מדילול / המניה לפני נפח ציטראט הצפת להוסיף קונצרט כלשהו. של דילול קונצרט כלשהו. בתגובה המחייבת קונצרט כלשהו. בנטרלתי ELISA
(Μl) (Μl) (מיקרומטר) (מיקרומטר) (מיקרומטר)
1 0.7 35.1 195.531 97.765 48.883
2 14.3 14.3 97.765 48.883 24.441
3 7.1 28.7 19.389 9.695 4.847
4 14.3 14.3 9.695 4.847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
להסיר ולסלק 7.1 μl של פתרון פפטיד ממספר דילול 8.

טבלת 1. הכנת סדרת דילול פפטיד מבחן.

איור 1
איור 1. פלייט מפה של פפטיד עקידת Assay. () מפה של דילולים פפטיד בצלחות 384 גם פוליפרופילן. כל צלחת פוליפרופילן יכולה להכיל שלוש קבוצות של 15 פפטידים בתגובות מחייבות תחרות מול שיר אלל le MHC II. (ב) לאחר התגובה מחייבת גישות שיווי משקל, כל קבוצת פפטיד מועברת, בשלושה עותקים, לצלחת 384 גם ELISA נפרד שכבר precoated עם נוגדנים נגד MHC II.

3. הכן את MHC II מיקס מאסטר (יום 1)

  1. הפוך מאגר התגובה
    1. הוסף 80 μl של 1 מ"מ Pefa גוש ו60 מ"ג octyl-β-D-glucopyranaside ל3,920 μl של ציטראט פוספט הצפת. (ראה מחשבון גיליון אלקטרוני נוסף לקנה מידה חלופית).
  2. לדלל פתרונות מניות MHC II נבחרו ל101 ננומטר בתגובת הצפת באמצעות צינור 15 מיליליטר חרוטי (טבלה 2).
    הערה: ריכוז MHC II סופו של דבר להיות 50 ננומטר בתגובה מחייבת ו25 ננומטר בassay ELISA נוטרל. ריכוזי מניית MHC II ישתנו בהתאם למספר הרבה של יצרן. (ראה מחשבון גיליון אלקטרוני משלימה).
"> MHC II אלל DRB1 *: 1501 ריכוז MHC II במלאי (מ"ג / מיליליטר) 1.3 ריכוז מניות MHC II (מ"מ) 20 כרך ב '. המלאי השני MHC להוסיף (מיליליטר) 14.65 כרך ב '. תגובת הצפת להוספה (מיליליטר): 2885.35 ריכוז MHC II מיקס מאסטר (ננומטר) 101

טבלה 2. הכנת תערובת ההורים MHC II.

4. הכן את הבקרה שלילית וחיובית (יום 1)

  1. הוספת 21.5 μl של ציטראט פוספט הצפת אל באר "ביקורת שלילית" של צלחת פוליפרופילן 384 גם משלב 2.1 (איור 1 א).
  2. הוספת 21.5 μl של ציטראט פוספט הצפת אל באר "השליטה חיובית" של צלחת פוליפרופילן 384 גם.
    הערה: "חיובישליטה מופרזת "תושלם בסעיף 5, בהמשך.
  3. הסר 49.5 μl של MHC II מיקס מאסטר משלב 3.2 וטפטפו לתוך צינור 1.5 מיליליטר Eppendorf.
  4. הוסף 0.5 μl של ציטראט הצפת ל49.5 μl של MHC II מיקס מאסטר משלב 4.3.
  5. הוספת 21.5 μl של הריכוז הותאם MHC II מיקס מאסטר מצעד 4.4 אל באר "ביקורת שלילית" של צלחת פוליפרופילן 384 היטב (איור 1 א).
    הערה: מדגם זה מייצג את הביקורת שלילית אפס האות המכילה חלבון MHC II, פפטיד אין שליטה, ואין פפטיד הבדיקה.

5. הוסף את בקרת פפטיד המתאים לMHC II מיקס מאסטר (יום 1)

MHC II אלל DRB1 * Biotinylated הבקרה פפטיד (שאריות) רצף
0101 שפעת HA-B (306-318) ביוטין (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT-אמיד
0301 מיוגלובין (137-148) ביוטין (AHX) - (AHX)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 יאר-B (1-14) ביוטין (AHX) (AHX) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) ביוטין (AHX) (AHX) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 שפעת HA-B (306-318) ביוטין (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT-אמיד
1501 MBP-B (84-102) ביוטין (AHX) (AHX) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* אנו ממליצים הזמנת 10 קנה המידה מ"ג לכלכלה.
לוח 3. בקרת פפטידים לאללים MHC II שונים. *

  1. לדלל את הפפטיד הבקרה (מאוחסן ב400 מיקרומטר בDMSO) 1:20 בDMSO הטרי להניב מניית בדילול מלא ב20 מיקרומטר.
    1. הוסף 25 μl 400 פפטיד שליטת מיקרומטרDMSO μl 475. שים לב: מדובר בעודף גדול, אבל מאפשר טיפול מדויק של פתרונות DMSO צמיג.
  2. יתר על כן לדלל בקרת פפטיד מצעד 5.1 (20 מ"מ) 1:100 לMHC II מיקס מאסטר משלב 3.2.
    1. הוספת 28.8 μl השליטה פפטיד מדולל בשלב 5.2 ל2,850.5 μl הנותר של MHC II מיקס מאסטר.
  3. הוספת 21.5 μl של MHC II מיקס מאסטר עם פפטיד שליטה (צעד 5.2) ולביקורת החיובית של צלחת פוליפרופילן 384 היטב (שלב 4.2) (איור 1 א). הערה: מדגם זה מייצג את הבקרה החיובית גבוהה אות המכילה חלבון MHC II, פפטיד שליטה, ואין פפטיד הבדיקה.

6. הפוך תגובה המחייבת (יום 1)

  1. הוסף את MHC II מאסטר המיקס המכיל בקרת פפטיד (שלב 5.2) לכל אחד מדילולי הבדיקה פפטיד (שלב 2.1) ביחס של 1:1 כדי ליצור את התגובה מחייבת.
    1. הוספת 21.5 μl של MHC II מיקס מאסטר מכיל קוןTrol פפטיד מצעד 5.2-21.5 μl של דילול כל הבדיקה פפטיד משלב 2.1. (רובוט טיפול נוזלי)
  2. חותם את התגובה המחייבת עם סרט פוליאסטר ודגירת 12-24 שעות בחממה שאינו CO 2 נשלטה על 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד.

7. לנטרל והעבר את התגובה המחייבת (יום 2)

  1. הסר את צלחת פוליפרופילן 384 גם מכילה את התגובה המחייבת (שלב 6.2) מחממת 37 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל את 01:01 תגובה המחייבת עם נטרול הצפת. (רובוט טיפול נוזלי)
    1. הוספת 43 μl של הצפת ניטרול לכל תגובה מחייבת היטב.
  3. הסר את צלחת ELISA (שלב 1.3) מ4 מעלות צלזיוס ולשטוף 3x עם 60 מיליליטר / טוב של PBS-0.05 Tween% 20. (מכונת כביסה צלחת)
  4. העברה 25 μl של כל תגובה מחייבת מנוטרלת מצעד 7.2 לתוך בארות בשלושה עותקים של צלחת 384 גם ELISA נוגדן מצופה מצעד 7.3. (איור 1
  5. מכסה את צלחת ELISA עם סרט פוליאסטר ומקום ב37 מעלות צלזיוס חממה ל2.5 שעה או במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

8. ELISA פיתוח (יום 2 או 3)

  1. הסר את צלחת ELISA מצעד 7.5, לשטוף 3 פעמים עם 60 μl / טוב של PBS-0.05 Tween%. (מכונת כביסה צלחת)
  2. לדלל פתרון streptavidin-אירופיום המניה (0.1 מ"ג / מיליליטר streptavidin, 7 Eu 3 + / streptavidin) 1,000 פי בDELFIA Assay הצפת.
    1. לצלחת אחת 384 גם, לדלל 10 μl Streptavidin-אירופיום ב10 מיליליטר Assay הצפת.
  3. הוסף 25 μl של Streptavidin-אירופיום המדולל היטב בכל צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.1. (רובוט טיפול נוזלי)
  4. מכסה את הצלחת עם סרט פוליאסטר ומקום בחושך בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הערה: במהלך הדגירה 1 שעות, להסיר את פתרון שיפור מהמקרר ומניח בצד 10 ​​מיליליטר / צלחת בחושך בroטמפרטורת אום.
  5. לאחר הדגירה 1-HR, לשטוף את צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.3 3x עם 60 μl / טוב של PBS-0.05 Tween%. (מכונת כביסה צלחת)
  6. הוסף 25 μl של שיפור פתרון היטב בכל צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.5. (רובוט טיפול נוזלי)
  7. מכסה את צלחת ELISA 384 גם עם סרט פוליאסטר ולאפשר את הצלחת לשבת בחושך בטמפרטורת חדר למשך 10-15 דקות.
  8. לאחר הדגירה דקות 10-15, קרא את הקרינה של צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.7 באמצעות זמן לפתור קורא ניאון צלחת עם הגדרות אירופיום (לדוגמא, התחל Int: 200, עצור Int:. 1,000, אקס 340, Em . 615, מפסק: אין, PMT: אוטומטי, קורא / ובכן: 50).

9. ניתוח נתונים

  1. הזן את הנתונים בגרף בפורמט XY עם 3 ערכים לשכפל בעמודות Side-by-צד (X = ריכוז הפפטיד בדיקה; Y = מדידת הקרינה).
  2. התחבר להפוך את ערכי X עבור כל הנתונים: X = יומן (X)
  3. התאם את טרה היומןnsformed נתונים עם המודל מחייב התחרותי אחד באתר כדי לחלץ את ערך IC 50.
  4. להגביל את הערך התחתון לשווי השליטה השלילי הממוצע.
  5. בעולם להתאים את הערך העליון ולבטח שפרמטר הכושר העולמי הוא מתחת או שווה לביקורת החיובית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רצף פפטיד הבוגר של Enterobacter P99 cloacae בטא lactamase (BLA) (# X07274.1 GenBank ID) נותח עם ProPred 16 לקלסרים פפטיד המשוערת לMHC II אלל DRB1 * 1501 (לוח 4). ProPred זיהה 117 פפטידים nonamer עם שאריות עוגן P1 חובה (כלומר, M, L, I, V, F, Y או W בעמדה 1, אשר נדרש עבור MHC II מחייב ביום 31). בסף של 5%, פפטידים עם ציונים גבוהים או שווה ל2.6 צפויים קלסרים בלבד. לפיכך, על סף 5%, רק 11 פפטידים העליונים הם חזו לאגד DRB1 MHC II * 1501.

טבלה 4
ניקוד למעלה טבלה 4. ProPred תחזיות לפפטידים BLA וDRB1 אלל MHC II * 1501.

פנל מייצג של epitop חזהes נבחר לניתוח בassay מחייב MHC השני שלנו (הטבלה 4, ערכים מודגשים). שברי פפטיד BLA של חמישה עשר שאריות היו מסונתזים באופן שאפיטופים nonamer המשוער MHC II היו מוטבעים בתוך שברי החלבון הסינתטי כימי. בעוד החריץ המחייב MHC II עצמה להכיל רק תשע חומצות אמינו, הראיות מצביעות על כך שרצפי איגוף יכולים להשפיע על אינטראקציות פפטיד-MHC II, ופפטידים סינטטיים של 15-20 שאריות ולכן הם מועסקים 15 נפוצים. כדי לייצג את המורכבות של חופף אפיטופים שעלולים להתרחש שבברי חלבון מעובד מבחינה ביולוגית, שבדקנו רצפים סינטטיים שהכילו קלסרים (i) אחד חזו, (ii) nonbinders חזה יחיד, (iii) מרובים חזה קלסרים, (iv) מרובים חזה nonbinders, או (v) תערובת של קלסרים חזו וnonbinders (לוחות 4 ו -5).

לוח 5 לוח 5. רשימה של פפטידים מסונתזים כימי.

הקיבולת של פפטידים סינטטיים אלה כדי להתחרות עם פפטיד biotinylated MBP-B השליטה (לוח 3) על התקשרות לMHC II DRB1 * 1501 נותחה כמפורט בפרוטוקול לעיל. עקומות מחייבות תחרותיות לפפטידים סינטטיים מוצגות באיור 2. IC 50 ערכים חושבו על ידי התאמת הנתונים הפכו יומן באמצעות פונקציה חד אתר התחרותי מחייבת, לא קוי בכושר של פריזמה (לוח 6). כפי שניתן לראות בתרשים 2, פפטידים לחלק באופן טבעי לשלוש קבוצות: קלסרים חזקים עם 50 IC <1 מיקרומטר (פפטידים 2 ו10); קלסרים מתונים עם 1 מיקרומטר ≤ IC 50 <100 מיקרומטר (פפטידים 4, 9, 11, ו24 ;) קלסרים חלשים עם IC 50 ≥ 100 μ; M (פפטיד ביום 31).

איור 2
איור 2. Curve עקידה התחרותי של BLA פפטידים לMHC II אלל DRB1 * 1501. קלסרים הדוקים בכושר עם קווים כתומים, קווים ירוקים קלסרים מתונים, וקלסר החלש קו חום.

פפטיד דירוג 50 IC (מיקרומטר) 95% CI ל50 IC (מיקרומטר) איכות Fit (R 2)
2 .1199 0.09404-.1529 0.98
4 15.1 11.83-19.28 0.87
9 17.11 13.39-21.88 0.81
10 0.2743 .2149-.3502 0.98
11 10.49 8.252-13.34 0.98
24 4.787 3.769-6.082 0.96
ביום 31 190.6 137.7-263.9 0.80

לוח 6. מחושבים IC 50 ערכים של שברי פפטיד BLA לDRB1 * 1501.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biotherapeutics הקימו את עצמם כפינה של רפואה המודרנית, המייצג את ארבעה מחמש התרופות הנמכרות ביותר בשנת 2012 32. Biopharmaceutics המגזר הראה צמיחה מתמשכת במשך כמה שנות 6, והפיתוח המתמשך של סוכני רומן, כמו גם את הופעתה של biosimilars הרחיב צינורות ביולוגיות. במבט לעתיד, הערכה ומקלי immunogenicity של חלבון הרפוי תהפוך לחלק בלתי נפרד מפיתוח biotherapeutic שלב מוקדם. כדי להקל על התהליך, biotechnologists יכול להיעזר בשיטות חישוביות לחיזוי epitope 16-22, כמו גם אלגוריתמי עיצוב חלבון משולבים המבקשים להפחית immunogenicity תוך שמירה על תפקוד 3,23-26. כמו כן, עיצוב ופיתוח חיסון עשוי לנצל את כוחם של אלגוריתמים חזוי 4, וההבשלה המתמשכת של vaccinology ההפוכה צפויה להניב מגןחיסונים למגוון רחב של חומרים מזהמים שחמק מן המאמצים קודמים 33. אמנם יש לי כלים חישוביים אלה את היכולת להאיץ באופן קיצוני תהליכי סמים ופיתוח חיסון, שהתוצאות בסופו של דבר תחזיות סיליקו חייבים להיות מסוננות נוסף על מנת לזהות מספר צייתן של מועמדים מובילים. ההתקדמות שחלה באחרונה בניתוח פפטיד-MHC II הכמותי כללה פיתוח של מערכות מהונדסות משטח תא שמרי תצוגת 34 וmicrobead מבוסס חמצן פלורסנט תקשור Immunoassays 35, אבל במבחני חוץ גופית סוג ELISA יישאר סוס העבודה לכימות מחייבות בין הספציפי MHC II וזוגות פפטיד. כאן, הליך בקנה מידה microliter לניתוח מהיר, כמוני, ועלות אפקטיבי של epitope פפטיד מחייב מולקולות חיסון MHC II אדם מתואר. שיטות אלה עשויות לשמש כבמת כלי ניסיוני בשלב מוקדם של תהליך התיעול.

לpurposes של הפגנה, הרצף של BLA נותח לפפטידים MHC II משוערים מחייבים באמצעות שרת האינטרנט ProPred. שבע של פפטידים אלה היו מסונתזים כימיים וניסוי נבדקו עבור מחייב MHC II DRB1 אדם מסיס * 1501. בדומה לניתוחים אחרים של דיוק מנבא 28, חיזוי מחייב ProPred קורלציה בצורה סבירה עם IC נמדד בניסוי 50 לאלל MHC II DRB1 * 1501. כמו כן, חשוב לציין כי תוצאות הן רגישות לשינויים בריכוזים ובטיפול יש לנקוט כדי להבטיח דילולים מדויקים של MHC, פפטידים שליטה, ופפטידים בדיקה. כמו כן, מגבלה של שיטה זו היא שIC 50 הערכים ביחס לריכוזים של MHC ופפטידים שליטה. בין ערכת בדיקת פפטיד BLA, הגבוה ביותר מדורג epitope ProPred הציג החזק מחייב * DRB1 רקומביננטי 1501. באופן דומה, כל קלסרים epitope חזו אחרים הציגו בינוניים עד זיקות MHC II גבוהות. כצפוי,פפטידים סינטטיים המכילים חזו אפיטופים מחייבים חופפים ואפיטופים לא מחייבים נמצאו להיקשר MHC II בכל המקרים. פפטיד ביום 31, שנמשך שניים מהנמוכים ביותר מדורגות אפיטופים חזו, הוכיח את עצמו קלסר MHC השני החלש ביותר. 24 פפטיד, לעומת זאת, נמצא להיקשר MHC II עם זיקה מתונה למרות שepitope מדורג רק מאוד מכונן (אפיטופ 24) לא היה קלסר חזה על הסף של 5%. מעניין, epitope 24 זוהה במחקר קודם שנועד deimmunizing BLA 10. בניסויים אלה, הפפטיד סינטטי 24 הוצג להיות immunogenic מאוד במבחני PBMC אנושיים. כך, במקרה אחד זה, assay מחייב MHC השני שלנו הוכיח את עצמו חזוי של immunogenicity תוך ProPred לא עשה זאת. במצטבר התוצאות להדגים את התועלת של תחזיות חישובית במנחים חוקרים כלפי אפיטופים immunogenic סביר, אבל הם גם מדגישים את החשיבות של שיטות ניסיוניות תפוקה גבוהה כמרכיב בלתי נפרד שלתהליך עיצוב חלבון / חיסון.

חשוב לציין, עיצוב 384 גם ניסוי זה הוא למקבל ביותר ומאפשר ניתוח קפדני של עד 15 פפטידים ואחד אלל MHC II ל384 גם צלחת ELISA. באמצעות רובוט טיפול נוזל יחיד, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד כדי לנתח תשעים פפטידים מבחן נגד ארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. עיצוב זה כולל שמונה ריכוזים שונים פפטיד בדיקה ומדידה בשלושה עותקים בכל ריכוז. לפיכך, המשתמש מובטח תוצאות כמותיות חזקות ושחזור. אחרים עובדים בתחומי חלבון הרפוי או עיצוב ופיתוח חיסון עשויים למצוא בפרוטוקול זה כדי להיות שימושי בהנחיית עבודתם בdeimmunization חלבון או ניתוח immunogenicity.

ציטראט פוספט חוצץ (22.2 מ"מ חומצה ציטרית, מ '55.6M dibasic Na 2 HPO 4, pH 5.4)
222 מיליליטר 0.1 M חומצת לימון
278 מיליליטר 0.2 M Na 2 HPO 4 dibasic
500 מיליליטר MilliQ H 2 O
מערבבים חומצה ציטרית, פוספט נתרן, ו450 מיליליטר של MilliQ H 2 O. התאם ל-pH 5.4 וQS ל1 ל '
פתרון זה הוא יציב בטמפרטורת חדר.
מאגר תגובה מחייב
ציטראט פוספט חיץ, pH 5.4 עם 2% v / v 1 מ"מ PefaBloc
1.5% w / v octyl-β-D-glucopyranaside
להשתמש מייד.
1 מ"מ PefaBloc
1 מיליליטר MilliQ H 2 O
SC PefaBloc 25 מ"ג (אבקה)
הפוך aliquots ולאחסן ב -20 ˚ C.
פורמולה borate חוצץ (tetraborate נתרן 12.5 מ"מdecahydrate, pH 8.2)
decahydrate tetraborate נתרן 1.19 g (Sigma)
250 מיליליטר MilliQ H 2 O
ממיסים decahydrate tetraborate נתרן ב225 מיליליטר של MilliQ H 2 O. התאם ל-pH 8.2 וQS 250 מיליליטר.
פתרון זה הוא יציב בטמפרטורת חדר.
PBS-Tween (2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH 2 PO 4, 136.9 mM NaCl, 8.9 מ"מ Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, Tween 0.05%, pH 7.4)
4.5 L MilliQ H 2 O 500 מיליליטר 10x של Dulbecco PBS (DPBS)
2.5 מיליליטר Tween 20
פתרון זה הוא יציב בטמפרטורת חדר.
נטרול חוצץ (50 מ"מ Trizma HCl, pH 8.0)
475 מיליליטר MilliQ H 2 O
ז 25 1 מיליליטר Trizma HCl
לערבב ולהתאים את pH 8.0
פתרון זה הוא יציב ב 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאונרד מואיז הוא מועסק על ידי ומחזיק באופציות מניות בEpiVax, Inc, חברת הביוטכנולוגיה בבעלות פרטית הממוקמת בפרובידנס, רוד איילנד. העבודה הכלולה בדוח מחקר זה היא חופשי מכל הטיה שעלולה להיות קשורות למטרות מסחריות של החברה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-GM-098,977 וR21-AI-098,122 לCBK וחבית. RSS נתמך בחלקו על ידי לוס קרן מלגה ובחלקו על ידי מלגת תייר חדשנות תכנית מבית הספר תאייר להנדסה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 85 Immunoassay immunogenicity חלבון MHC II epitope תא T מסך תפוקה גבוה Deimmunization חיסון עיצוב

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L.,… More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter