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Biology

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l'analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Published: March 25, 2014 doi: 10.3791/51308
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

ERRATUM NOTICE

Summary

Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Questo formato conveniente, deve risultare utile nel campo della proteina deimmunization e progettazione di vaccini e sviluppo.

Abstract

Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design 1,2. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II viene scalata a 384 pozzetti. Il protocollo ridotta riduce i costi dei reagenti del 75% ed è più alta velocità di quanto precedentemente descritto protocolli da 96 pozzetti 1,3-5. In particolare, il disegno sperimentale permette l'analisi robusta e riproducibile fino a 15 peptidi contro un allele MHC II per 384 pozzetti ELISA. Utilizzando un'unica movimentazione robot liquido, questo metodo consente un ricercatore di analizzare circa novanta peptidi prova in triplice copia in un range di concentrazioni otto e quattro tipi di alleli MHC II in meno di 48 ore. Altri lavorano nei campi di proteine ​​deimmunization o la progettazione di vaccini e sviluppo può trovare il protocollo per essere utile nel facilitare il proprio lavoro. In particolare, le istruzioni passo-passo e il formato visivodi Giove dovrebbe consentire ad altri utenti di stabilire rapidamente e facilmente questa metodologia nei propri laboratori.

Introduction

Le proteine ​​sono la classe più rapida crescita di agenti terapeutici 6, e la rapida espansione delle condotte biotherapeutic ha focalizzato sempre più l'attenzione sulle sfide connesse con lo sviluppo e l'uso di farmaci proteici. Una considerazione unica deriva dal fatto che, in un sistema immunitario sano e funzionante, tutte le proteine ​​extracellulari sono campionati dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Una volta internalizzato da APC, una proteina viene scissa in piccoli frammenti peptidici, e segmenti immunogenici putativi sono caricati nella scanalatura di classe II principali proteine ​​complessi di istocompatibilità (MHC II). I complessi peptide-MHC II vengono quindi visualizzati sulla superficie APC, e vere peptidi immunogeni, chiamati epitopi delle cellule T, forma ternaria complessi recettore delle cellule MHC II-peptide-T con recettori di superficie delle cellule T CD4 affini 7. Questo evento critico riconoscimento molecolare inizia una cascata di segnalazione complessa, che comporta l'attivazione delle cellule T, il rilascio di citochines, CD4 T cellulo-mediata B maturazione delle cellule, e, infine, la produzione di anticorpi IgG circolanti che si legano e azzera la proteina esogena incriminato. Così, proteine ​​immunogeniche potrebbero essere deimmunized individuando costitutivi epitopi delle cellule T e mutando residui chiave responsabili MHC II formazione del complesso. È notato, comunque, che gli epitopi di cellule T possono essere numerosi e ampiamente distribuiti in tutta proteine ​​immunogeniche, e la maggior parte delle mutazioni-epitopo eliminazione sono suscettibili di provocare una perdita involontaria di una funzione proteica o la stabilità. Pertanto, ingegneria deimmunized bioterapie può essere un obiettivo complesso e tecnicamente impegnativo, ma esistono diversi esempi di successo di T epitopi delle cellule progetti soppressione 3,5,8-12. Diversamente basato sovrainnesti "umanizzazione", che è in gran parte limitato a terapeutica dell'anticorpo, soppressione epitopo può essere applicato a qualsiasi sostanza bersaglio proteina indipendentemente sequenza, struttura, funzione, o la disponibilità di homologoci ponteggi umani. Il primo passo per l'attuazione di un tale approccio è l'identificazione di epitopi peptidici chiave incorporati all'interno della sequenza della proteina bersaglio.

Ad alto rendimento saggi biochimici utilizzando peptidi sintetici e di molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide intuizioni preliminari nella identificazione degli epitopi e mitigazione 1,3-5. Questi saggi tipo ELISA può essere un potente complemento ad altri di progettazione e sviluppo di strumenti di proteine ​​/ vaccino. Per esempio, un approccio sperimentale consolidata di mappatura di epitopi si basa sul tempo, lavoro e notevoli risorse ex vivo saggi di proliferazione cellulare 15. In breve, la sequenza primaria di una proteina bersaglio viene prima divisa in un pannello di peptidi sovrapposti, spesso 15-meri con 12 residui sovrappongono tra peptidi adiacenti. Il pannello peptide è sintetizzato chimicamente e l'immunogenicità di ciascun peptide è testato in uno dei vari test immunologici diversi che impiegano Bloo perifericocellule d mononucleate (PBMC) isolate da donatori umani 13,14. Per garantire una maggiore fiducia nei risultati, i peptidi sono in genere testati in replicato con PBMC da 50 o più donatori diversi. Nei casi in cui deimmunization è l'obiettivo finale, il lavoro è aggravato ulteriormente la necessità di produrre pannelli supplementari di peptidi mutati e collaudare i nuovi pannelli peptidici in saggi PBMC prima di introdurre eventuali mutazioni deimmunizing nella proteina intera lunghezza per la successiva analisi funzionale 10. Mentre questi saggi cellulari rimangono il gold standard per valutare il potenziale immunogenico in pazienti umani, l'efficienza di un approccio esaustivo potrebbe essere migliorata prefiltraggio epitopi immunogeni putativi usando una rapida ed elevata produttività MHC II-peptide saggio di legame.

Analogamente, biochimici saggi di legame peptide-MHC II possono essere combinati con predittiva metodi in silico per accelerare radicalmente il processo di identificazione epitopo.Esistono una varietà di strumenti di calcolo per la previsione epitopo T cellulare; esempi includono ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-align 20, NetMHCIIpan 21, nonché strumenti proprietari come EpiMatrix di EpiVax 22. Allo stesso modo, i predittori epitopi sono stati recentemente associati ad altre bioinformatica e strumenti di modellazione molecolare per produrre proteine ​​algoritmi deimmunization integrati, progettati per ridurre il rischio che le mutazioni deimmunizing potrebbero sconvolgere la struttura e la funzione delle proteine ​​23-26. Mentre diversi predittori epitopi hanno dimostrato di essere ragionevolmente accurata 27,28, risultati computazionali sempre richiedono validazione sperimentale. Rapid, ad alto rendimento, e convenienti metodi sperimentali sono più adatti come filtro preliminare in silico previsioni epitopi.

In modo simile, i predittori epitopi possono guidare la selezione antigene per vaccinolo retromarciaGY 29,30. Ad esempio, i progressi nella bioinformatica hanno dato intere schermate genoma che rapidamente identificare i candidati vaccini in forma di proteine ​​intere o epitopi peptidici estratti da proteomi patogeni. Mentre questa tecnologia consente sta rimodellando scoperta e lo sviluppo di vaccini protettivi, introduce una nuova sfida sotto forma di intractably grandi liste di candidati vaccini immunogenico. Saggi di legame throughput elevato peptide-MHC II possono guidare la selezione degli epitopi quantificando peptide affinità di legame e la promiscuità vincolante tra più alleli MHC II. Come con proteine ​​deimmunization, tali metodi sperimentali sono in ultima analisi necessarie per convalidare la previsione computazionale di porta promettente vaccino.

Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Il protocollo è altamente parallelo e riduce i costi dei reagenti del 75% rispetto al precedentemente descritto 96 pozzetti formati lastra 1,3-5. Utilizzando un unico liquidazioned robot manipolatore, questo metodo consente un ricercatore di analizzare facilmente circa novanta peptidi prova in triplice copia in un range di concentrazioni otto e quattro tipi di alleli MHC II in meno di 48 ore. Questo articolo descrive la configurazione di una piastra da 384 pozzetti ELISA per l'analisi di sette peptidi sperimentali contro un allele MHC II, ma calcolatrici foglio di calcolo sono forniti come materiale supplementare, in modo da scalare facilmente l'esperimento a qualsiasi numero di peptidi e / o MHC desiderati molecole II.

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Protocol

Quattro attività principali comprendono il saggio di legame peptide-MHC II: 1-Rilegatura: peptidi di prova in concorrenza con peptidi marcati di controllo per l'associazione in soluzione di proteine ​​MHC II solubili. Binding è misurata su una vasta gamma di concentrazioni di peptide di prova. 2-Capture: Dopo la reazione di legame avvicina equilibrio, complessi peptide-MHC II vengono catturati e separati dal peptide legato e proteine ​​mediante riconoscimento dipendente dalla conformazione con un anticorpo immobilizzato. 3-Detection: Catturato peptide di controllo è quantitativamente rilevata tramite fluorescenza in tempo risolto. 4-Analisi: i dati spettroscopici sono trattati, tracciati e analizzati per accertare dose-dipendenti proprietà di legame di prova peptidi e le proteine ​​MHC II.

In vari passaggi della procedura sotto, l'uso di un robot liquido gestione è consigliato se uno è disponibile. Soprattutto in un formato 384-bene, erogazione automatizzata e diluizione dei liquidi minimizza errori degli utenti, risultati in piùpozzo alla ben consistenti volumi ei rendimenti strette 95% intervalli di confidenza per valori di IC 50 rispetto ai saggi 96 pozzetti manuali (dati non mostrati). Se un robot di gestione dei liquidi non è disponibile, i passaggi annotati con "(manipolazione liquido robot)" può essere fatto a mano. Allo stesso modo, se possibile, si raccomanda un lavatore automatico che è compatibile con il formato 384 pozzetti. Questo standardizza efficacemente il processo di lavaggio piatto. Se una rondella targa non è disponibile, i passaggi annotati con "(lavatore)" può essere fatto a mano.

1. Rivestire la piastra ELISA (Day 1)

  1. Diluire L243 anticorpo magazzino (0,5 mg / ml) in tampone borato ad una concentrazione di lavoro di 10 mg / ml.
    1. Per rivestire un piatto unico da 384 pozzetti, aggiungere 200 ml di brodo di anticorpi a 9,8 ml di tampone borato. (Vedere calcolatrice foglio supplementare per il ridimensionamento alternativo).
  2. Aggiungere 25 microlitri della soluzione L243 anticorpo a ciascun pozzetto di una 384 well high-binding bianco piastra ELISA. (Manipolazione robot liquido)
  3. Sigillare la piastra con un film di poliestere e incubare una notte a 4 ° C.
    Nota: Ogni piastra ELISA a 384 e può ospitare fino a 15 peptidi di prova, a otto diluizioni per un allele MHC II, nonché i controlli positivi e negativi. Questo in ultima analisi produrre misurazioni triplice copia.

2. Effettuare il test Peptide diluizioni (1 ° giorno)

  1. Partendo da uno stock 10 mM di ciascun peptide prova in DMSO, effettuare la seguente serie di diluizioni in citrato tampone fosfato utilizzando piastre di polipropilene da 384 pozzetti (Tabella 1). (Manipolazione robot liquido)
    Nota: Una piastra in polipropilene pieno 384 pozzetti richiede tre piastre ELISA separati. Un terzo di una piastra di polipropilene richiede solo una piastra ELISA (Figura 1).
Numero di diluizione Volume to prendere da prima diluizione / magazzino Volume tampone citrato per aggiungere Conc. di diluizione Conc. in reazione di legame Conc. in neutralizzato ELISA
(Microlitri) (Microlitri) (Micron) (Micron) (Micron)
1 0.7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28.7 19,389 9,695 4,847
4 14.3 14.3 9,695 4,847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0,961 0,481
6 14.3 14.3 0,961 0,481 0.24
7 7.1 28.7 0,191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Rimuovere e gettare 7.1 ml di soluzione di peptide dalla diluizione numero 8.

Tabella 1. Preparazione di prova serie di diluizioni peptide.

Figura 1
Figura 1. Piastra Mappa del Peptide Binding Assay. (A) Mappa delle diluizioni del peptide in polipropilene 384 pozzetti. Ogni lastra in polipropilene in grado di ospitare tre gruppi di 15 peptidi in concorrenza reazioni di legame nei confronti di un cantare allele le MHC II. (B) Dopo la reazione di legame avvicina equilibrio, ciascun gruppo peptide viene trasferito, in triplice copia, ad una piastra a 384 pozzetti ELISA separato che è stato prerivestita con anticorpo anti-MHC II.

3. Preparare il MHC II Master Mix (Day 1)

  1. Rendere il Reaction Buffer
    1. Aggiungere 80 ml di 1 mM Pefa Bloc e 60 mg di ottile-β-D-glucopyranaside a 3.920 ml di citrato tampone fosfato. (Vedere calcolatrice foglio supplementare per il ridimensionamento alternativo).
  2. Diluire le soluzioni di archivi MHC II selezionati a 101 nm in Reaction Buffer utilizzando un tubo da 15 ml (Tabella 2).
    Nota: concentrazione MHC II alla fine sarà 50 nM nella reazione di legame e 25 nM nel saggio ELISA neutralizzato. Le concentrazioni di archivi MHC II variano a seconda del numero di produttori lotto. (Vedere calcolatrice foglio supplementare).
"> MHC II alleli DRB1 *: 1501 MHC II Stock Concentrazione (mg / ml) 1.3 MHC II Stock Concentration (mm) 20 Vol. II MHC Archivio per aggiungere (ml) 14.65 Vol. Reaction Buffer per aggiungere (ml): 2.885,35 MHC II Master Mix Concentration (nm) 101

Tabella 2. Preparazione del master mix MHC II.

4. Preparare i controlli negativi e positivi (1 ° giorno)

  1. Aggiungere 21.5 ml di citrato tampone fosfato al pozzo "controllo negativo" della piastra in polipropilene 384 pozzetti dal punto 2.1 (Figura 1A).
  2. Aggiungere 21.5 ml di citrato tampone fosfato al pozzo "controllo positivo" della piastra in polipropilene da 384 pozzetti.
    Nota: la "posizionecontrollo effettivo "sarà completato nella sezione 5, in basso.
  3. Rimuovere 49.5 ml di MHC II Master Mix dal punto 3.2 e pipetta in una provetta da 1,5 ml Eppendorf.
  4. Aggiungere 0,5 ml di tampone citrato alle 49.5 ml di MHC II Master Mix dal punto 4.3.
  5. Aggiungere 21.5 ml di concentrazione adeguati MHC II Master Mix dal punto 4.4 al pozzo "controllo negativo" della piastra in polipropilene 384 pozzetti (Figura 1A).
    Nota: questo esempio rappresenta il controllo negativo zero segnale contenente proteine ​​MHC II, NO peptide di controllo, e NO peptide test.

5. Aggiungere il comando appropriato Peptide al MHC II Master Mix (Day 1)

MHC II alleli DRB1 * Biotinilato controllo Peptide (Residui) Sequenza
0101 Flu-HA-B (306-318) Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-ammide
0301 Mioglobina (137-148) Biotina-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotina-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotina-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Flu-HA-B (306-318) Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide
1501 MBP-B (84-102) Biotina-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Si consiglia di ordinare 10 mg scala per l'economia.
Tabella 3. Controllo Peptidi per varie MHC II alleli. *

  1. Diluire il peptide di controllo (conservato a 400 micron di DMSO) 01:20 in DMSO fresca per produrre uno stock diluita a 20 micron.
    1. Aggiungere 25 ml 400 control micron peptide475 microlitri DMSO. Nota: questo è un grande eccesso, ma permette la gestione accurata di soluzioni viscose DMSO.
  2. Diluire ulteriormente il controllo Peptide dal punto 5.1 (20 mm) 1:100 in MHC II Master Mix dal punto 3.2.
    1. Aggiungere 28,8 ml di controllo Peptide diluito nel passaggio 5.2 per i restanti 2,850.5 ml di MHC II Master Mix.
  3. Aggiungere 21,5 ml di MHC II Master Mix con peptide di controllo (passo 5.2) al pozzetto di controllo positivo della piastra polipropilene 384 pozzetti (passo 4.2) (Figura 1A). Nota: questo esempio rappresenta il controllo positivo alto segnale contenente proteine ​​MHC II, controllo peptide, e NO peptide test.

6. Effettuare la reazione di legame (Day 1)

  1. Aggiungere il MHC II Master Mix contenente controllo Peptide (passo 5.2) a ciascuna delle diluizioni test Peptide (passo 2.1) in un rapporto 1:1 a creare la reazione di legame.
    1. Aggiungere 21.5 ml di MHC II Master Mix contenenti Concontrollo Peptide dal punto 5,2-21,5 ml di ogni diluizione di prova Peptide dal punto 2.1. (Manipolazione robot liquido)
  2. Sigillare la reazione di legame con un film di poliestere e incubare 12-24 ore in un incubatore non-CO 2 controllata a 37 ° C senza agitazione.

7. Neutralizzare e Trasferire la reazione di legame (Day 2)

  1. Rimuovere la piastra in polipropilene 384 pozzetti contenente la reazione di legame (punto 6.2) dal termostato 37 ° C.
  2. Diluire 1:1 reazione di legame con la neutralizzazione Buffer. (Manipolazione robot liquido)
    1. Aggiungere 43 ml di tampone di neutralizzazione di ogni reazione di legame bene.
  3. Rimuovere la piastra ELISA (passo 1.3) da 4 ° C e lavare con 3x 60 ml / pozzetto di PBS-0.05% Tween 20. (Lavatore)
  4. Trasferire 25 microlitri di ogni reazione di legame neutralizzato dal punto 7.2 in pozzetti in triplicato del 384 pozzetti ELISA anticorpo piastra rivestita dal punto 7.3. (Figura 1
  5. Coprire la piastra ELISA con un film di poliestere e posto in un incubatore a 37 ° C per 2,5 ore o in un frigorifero a 4 ° C durante la notte.

8. ELISA Development (Day 2 o 3)

  1. Rimuovere la piastra ELISA dal punto 7.5, lavare 3 volte con 60 microlitri / pozzetto di PBS-0.05% Tween. (Lavatore)
  2. Diluire la soluzione streptavidina-Europium magazzino (0,1 mg / ml streptavidina, 7 Eu 3 + / streptavidina) 1,000 volte nel tampone del saggio DELFIA.
    1. Per una piastra da 384 pozzetti, diluire 10 ml streptavidina-Europium in 10 ml di tampone del saggio.
  3. Aggiungere 25 ml di diluito streptavidina-europio a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti ELISA dal punto 8.1. (Manipolazione robot liquido)
  4. Coprire la piastra con un film di poliestere e posto al buio a temperatura ambiente per 1 ora. Nota: Durante l'incubazione 1 ora, rimuovere la soluzione Enhancement dal frigorifero e mettere da parte 10 ml / piastra al buio a rotemperatura om.
  5. Seguendo la incubazione di 1 ora, lavare la piastra a 384 pozzetti ELISA dal punto 8.3 3x con 60 pl / pozzetto di PBS-Tween 0,05%. (Lavatore)
  6. Aggiungere 25 ml di soluzione Enhancement a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti ELISA dal punto 8.5. (Manipolazione robot liquido)
  7. Coprire la piastra ELISA 384 pozzetti con un film di poliestere e lasciare che la piastra di sedersi al buio a temperatura ambiente per 10-15 min.
  8. A seguito del 10-15 min di incubazione, leggere la fluorescenza della piastra a 384 pozzetti ELISA dal punto 8.7 utilizzando un lettore di tempo risolto fluorescente piastra con impostazioni europio (per esempio, Inizio Int: 200, Stop Int:. 1.000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Nessuno, PMT: Auto, Letture / Well: 50).

9. Analisi dei dati

  1. Inserire i dati in formato grafico XY con 3 valori ripetute nelle colonne side-by-side (X = concentrazione di peptide prova; Y = misurazione della fluorescenza).
  2. Log trasformare i valori X per tutti i dati: X = log (X)
  3. Montare i TRA registrodati nsformed con un sito di legame modello competitivo per estrarre il valore di IC 50.
  4. Vincolare il valore inferiore al valore di controllo negativo medio.
  5. Globalmente adattare il valore superiore e assicurare che il parametro di misura globale è inferiore o uguale al controllo positivo.

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Representative Results

La sequenza peptidica matura di Enterobacter cloacae P99 beta-lattamasi (BLA) (GenBank ID # X07274.1) è stato analizzato con ProPred 16 per leganti peptidici putativi per MHC II allele DRB1 * 1501 (tabella 4). ProPred identificato 117 peptidi nonamer considerando un obbligatorio residuo P1 ancoraggio (cioè una M, L, I, V, F, Y, o W nella posizione 1, che è richiesto per MHC II vincolante 31). Ad una soglia del 5%, peptidi solo con punteggi superiori o uguali a 2,6 sono probabili leganti. Così, alla soglia del 5%, solo i primi 11 peptidi si prevede di impegnare MHC II DRB1 * 1501.

Tabella 4
Tabella 4. Top-scoring ProPred previsioni per peptidi BLA e MHC II allele DRB1 * 1501.

Un gruppo rappresentativo di Epitop predettoes è stato selezionato per l'analisi nel nostro saggio di legame MHC II (Tabella 4, le voci in grassetto). BLA frammenti peptidici di quindici residui sono stati sintetizzati chimicamente in modo tale che gli epitopi nonamer putativo MHC II sono stati incorporati all'interno dei frammenti di proteine ​​sintetiche. Mentre il solco di legame MHC II si adegua solo nove amminoacidi, l'evidenza suggerisce che le sequenze fiancheggianti possono influenzare le interazioni peptide-MHC II, e peptidi sintetici di 15-20 residui sono quindi comunemente impiegato 15. Per rappresentare la complessità di epitopi che potrebbero verificarsi in frammenti di proteine ​​biologicamente trasformati sovrapposizione, abbiamo testato le sequenze sintetiche che contenevano (i) leganti singoli previsti, (ii) nonbinders singoli previsti, (iii) multipla predetto leganti, (iv) multipla predetto nonbinders, o (v) una miscela di leganti previsti ei nonbinders (Tabelle 4 e 5).

Tabella 5 Tabella 5. Lista di sintesi chimica peptidi.

La capacità di questi peptidi sintetici di competere con il peptide di controllo MBP-B biotinilato (Tabella 3) per l'associazione a MHC II DRB1 * 1501 è stato analizzato come descritto nel protocollo di cui sopra. Curve di legame competitivo per i peptidi sintetici sono mostrati in Figura 2. Valori di IC 50 sono stati calcolati inserendo i dati di log-trasformata utilizzando un sito competitivo, funzione di legante non lineare in forma di prisma (Tabella 6). Come si vede nella figura 2, i peptidi partizionare naturalmente in tre gruppi: forti leganti con IC50 <1 microM peptidi (2 e 10); leganti moderati con 1 pM ≤ IC 50 <100 um (peptidi 4, 9, 11 e 24 ); leganti deboli con IC 50 ≥ 100 μ, M (peptide 31).

Figura 2
Figura 2. Competitiva Curve Binding of BLA Peptidi per MHC II allele DRB1 * 1501. Leganti stretti sono in forma con le linee arancioni, leganti moderati linee verdi, e il legante deboli di una linea marrone.

Peptide Classifica IC 50 (micron) 95% CI per IC 50 (micron) Qualità della Fit (R 2)
2 0,1199 ,09404-0,1529 0.98
4 15.1 11,83-19,28 0.87
9 17.11 13,39-21,88 0.81
10 0,2743 ,2149-,3502 0.98
11 10.49 8,252-13,34 0.98
24 4,787 3,769-6,082 0.96
31 190,6 137,7-263,9 0.80

Tabella 6. Calcolate IC 50 valori di frammenti peptidici BLA per DRB1 * 1501.

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Discussion

Biotherapeutics si sono affermati come una pietra miliare della medicina moderna, che rappresentano quattro delle prime cinque farmaci più venduti nel 2012 32. Il settore biofarmaceutica ha mostrato una crescita sostenuta per diversi anni 6, e il continuo sviluppo di nuovi agenti, così come l'emergere dei biosimilari ha ampliato condotte biofarmaceutiche. Guardando al futuro, valutare e mitigare l'immunogenicità di terapie proteiche diventerà parte integrante dello sviluppo biotherapeutic fase iniziale. Per facilitare questo processo, i biotecnologi possono avvalersi di metodi computazionali per epitopo previsione 16-22 così come algoritmi di progettazione di proteine ​​integrate che mirano a ridurre l'immunogenicità, pur mantenendo la funzione 3,23-26. Allo stesso modo, la progettazione di vaccini e lo sviluppo possono sfruttare la potenza degli algoritmi predittivi 4, e la continua maturazione di vaccinologia inversa si prevede di cedere protezioneVaccini per una vasta gamma di agenti infettivi che hanno eluso gli sforzi precedenti 33. Mentre questi strumenti computazionali hanno la capacità di accelerare radicalmente i processi di sviluppo di farmaci e vaccini, i risultati delle predizioni in silico devono infine essere filtrato ulteriormente in modo da identificare un numero gestibile di candidati superiore performanti. I recenti progressi nella analisi quantitativa del peptide-MHC II hanno incluso lo sviluppo di ingegneria sistemi di visualizzazione della superficie delle cellule di lievito 34 e microsfere a base di ossigeno luminescenti Channeling Immunoassays 35, ma in vitro ELISA tipo saggi restano il cavallo di battaglia per la quantificazione del legame tra specifici MHC II e coppie peptidici. Qui, una procedura scala microlitri rapido, quantitativo, e costo efficace analisi di legame dei peptidi alle molecole MHC II immunitarie umane epitopo è descritto. Questi metodi possono essere utilizzati come strumento sperimentale fase iniziale del processo di imbutitura.

Per il purposes della manifestazione, la sequenza di BLA stati analizzati per presunti MHC II peptidi leganti utilizzando il server web ProPred. Sette di questi peptidi sono stati sintetizzati chimicamente e sperimentalmente testati per il legame solubile umana MHC II DRB1 * 1501. Simile ad altre analisi di accuratezza predittore 28, ProPred previsione vincolante correlato ragionevolmente bene con misurata sperimentalmente IC 50 per l'MHC II allele DRB1 * 1501. E 'anche importante notare che i risultati sono sensibili alle variazioni di concentrazioni e si deve prestare attenzione a garantire diluizioni accurate di MHC, peptidi di controllo, e peptidi di prova. Analogamente, una limitazione di questo metodo è che i valori di IC 50 sono relative alle concentrazioni di MHC e peptidi di controllo. Tra il peptide insieme di test BLA, la più alta classifica ProPred epitopo esposto il più forte legame con DRB1 * ricombinante 1501. Allo stesso modo, tutti gli altri leganti epitopi previsti esposte da moderati a elevati affinità MHC II. Come previsto,peptidi sintetici contenenti sovrapposte epitopi leganti previsti ed epitopi non vincolante trovata per legare MHC II in tutti i casi. Peptide 31, che ha attraversato due dei più bassi classificato epitopi previsti, ha dimostrato di essere il più debole legante MHC II. Peptide 24, tuttavia, è stato trovato per legare MHC II con moderata affinità nonostante il fatto che il suo epitopo costituente solo altamente classificato (epitopo 24) non era un legante previsto alla soglia del 5%. È interessante notare, epitopo 24 è stato identificato in un precedente studio volto a deimmunizing BLA 10. In questi esperimenti, peptide sintetico 24 ha dimostrato di essere altamente immunogenica in saggi PBMC umani. Così, in questo caso, il nostro saggio di legame MHC II risultato essere predittiva di immunogenicità mentre ProPred no. In totale, i risultati dimostrano l'utilità delle previsioni computazionali nel guidare i ricercatori verso epitopi immunogeni probabili, ma sottolineano anche l'importanza di high throughput metodi sperimentali come parte integrante diil processo di progettazione di proteine ​​/ vaccino.

È importante sottolineare questo motivo 384 pozzetti sperimentale è altamente parallelo e consente un'analisi rigorosa fino a 15 peptidi e un allele MHC II per 384 pozzetti ELISA. Utilizzando un'unica movimentazione robot liquido, questo metodo consente un ricercatore di analizzare novanta peptidi prova contro quattro tipi di alleli MHC II in meno di 48 ore. Questo disegno comprende otto diverse concentrazioni di test e misurazione del peptide triplice copia ad ogni concentrazione. Pertanto, l'utente è assicurata risultati quantitativi affidabili e riproducibili. Altri lavorano nei campi di terapie proteiche o di una progettazione di vaccini e sviluppo può trovare questo protocollo per essere utile nel facilitare il loro lavoro in proteine ​​deimmunization o di analisi immunogenicità.

Citrato tampone fosfato (22,2 mM acido citrico, 55,6 mM bibasico Na 2 HPO 4, pH 5.4)
222 ml 0,1 M di acido citrico
278 ml 0,2 M bibasico Na 2 HPO 4
500 ml MilliQ H 2 O
Mescolare acido citrico, fosfato di sodio e 450 ml di H 2 O. MilliQ Regolare il pH a 5,4 e QS a 1 L.
Questa soluzione è stabile a temperatura ambiente.
Binding Buffer di reazione
Citrato tampone fosfato, pH 5.4 con 2% v / v 1 mM PefaBloc
1,5% w / v Octyl-β-D-glucopyranaside
Utilizzare subito.
1 PefaBloc mM
1 ml MilliQ H 2 O
25 mg PefaBloc SC (polvere)
Preparare delle aliquote e conservare a -20 ˚ C.
Borato Buffer Formula (12,5 mm di sodio tetraboratodecaidrato, pH 8.2)
1.19 g di sodio tetraborato decaidrato (Sigma)
250 ml MilliQ H 2 O
Sciogliere il sodio tetraborato decaidrato in 225 ml di MilliQ H 2 O. Regolare il pH a 8,2 e qs a 250 ml.
Questa soluzione è stabile a temperatura ambiente.
PBS-Tween (KCl 2.7 mM, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% Tween, pH 7.4)
4.5 L MilliQ H 2 O 500 ml 10x PBS di Dulbecco (DPBS)
2,5 ml di Tween 20
Questa soluzione è stabile a temperatura ambiente.
Neutralizzazione buffer (50 mM Trizma HCl, pH 8.0)
475 ml MilliQ H 2 O
25 ml di 1 M HCl Trizma
Mescolare e aggiustare il pH a 8,0
Questa soluzione è stabile a 4 ° C.

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Disclosures

Leonard Moise è impiegato da e detiene stock option in EpiVax, Inc., una società di biotecnologia di proprietà privata si trova a Providence, RI. Il lavoro contenute in questo rapporto di ricerca è libera da ogni pregiudizio che potrebbe essere associato con gli obiettivi commerciali dell'azienda.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01-GM-098977 e R21-AI-098.122 per CBK e KEG. RSS è stato sostenuto in parte da una Luce Foundation Fellowship e in parte da una borsa di studio Thayer Innovation Program presso la Scuola di Ingegneria Thayer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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Tags

Biochimica immunoenzimatico Proteina immunogenicità MHC II epitopo cellule T Schermo High Throughput Deimmunization Vaccino design

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi
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Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

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