Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En høy gjennomstrømning MHC II Binding Assay for kvantitativ analyse av peptidepitoper

Published: March 25, 2014 doi: 10.3791/51308
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

ERRATUM NOTICE

Summary

Biokjemiske analyser med rekombinant humant MHC II molekyler kan gi raske, kvantitative innsikt i immunogent epitope identifikasjon, sletting, eller design. Her blir et peptid-MHC II-bindingsanalysen skalert til 384-brønners plater som er beskrevet. Denne kostnadseffektive format bør være nyttige innen protein deimmunization og vaksine design og utvikling.

Abstract

Biokjemiske analyser med rekombinant humant MHC II molekyler kan gi raske, kvantitative innsikt i immunogent epitope identifikasjon, sletting, eller design 1,2. Her blir et peptid-MHC II-bindingsanalysen skalert til 384-brønnformat. Den nedskalert protokollen reduserer reagenvolumer kostnadene med 75% og er høyere gjennomstrømning enn tidligere beskrevet 96-brønners protokoller 1,3-5. Nærmere bestemt tillater den eksperimentelle utforming robust og reproduserbar analyse av opp til 15 peptider mot en MHC II allel pr 384-brønners ELISA-plate. Ved hjelp av en enkelt væskehåndtering robot, gir denne metoden en forsker for å analysere omtrent nitti testpeptider i triplikat over et område av åtte konsentrasjoner og fire MHC II-allel typer i mindre enn 48 timer. Andre som jobber innen protein deimmunization eller vaksine design og utvikling kan finne protokollen til å være nyttig i å tilrettelegge eget arbeid. Spesielt de trinnvise instruksjoner og visuelt formatav Jove bør tillate andre brukere å raskt og enkelt skape denne metodikken i sine egne laboratorier.

Introduction

Proteiner er den raskest voksende klassen av terapeutiske midler 6, og den raske utvidelsen av bioterapeutiske rørledninger har fokusert økende oppmerksomhet på utfordringer knyttet til utvikling og bruk av protein narkotika. En unik faktor stammer fra det faktum at, i en sunn og fungerende immunsystem blir alle ekstracellulære proteiner samplet av antigen-presenterende celler (APCer). Når internalisert av APC, er et protein spaltes i små peptid fragmenter, og antatte immunogene segmenter er lastet inn i sporet i klasse II store histocompatibility komplekse proteiner (MHC II). De peptid-MHC II-kompleksene blir deretter vist på APC overflate, og sann immunogene peptider, betegnet T-celle-epitoper, danner ternære II MHC-peptid-T-celle-reseptor-komplekser med beslektede CD4 T-celleoverflatereseptorer 7. Denne kritiske molekylær anerkjennelse hendelsen initierer en kompleks signalering kaskade, noe som resulterer i T-celleaktivering, utgivelsen av cytokins, CD4 T-celle-mediert B-celle modning, og til slutt produksjon av sirkulerende IgG antistoffer som binder seg til og fjerne den fornærmende eksogene protein. Dermed kan immunogene proteiner bli deimmunized ved å identifisere konstituerende T-celle epitoper og mutere viktige rester ansvarlige for MHC II kompleks formasjon. Det bærer bemerker imidlertid at T-celle epitoper kan være mange og bredt fordelt gjennom immunogene proteiner, og de fleste av epitop-sletting mutasjoner vil sannsynligvis føre til en utilsiktet tap av proteinfunksjon eller stabilitet. Derfor, engineering deimmunized biotherapies kan være en kompleks og teknisk utfordrende mål, men det finnes flere eksempler på vellykkede T celle epitop sletting prosjekter 3,5,8-12. I motsetning til pode-baserte "menneskeliggjøring", som i stor grad begrenset til antistoff legemiddel, kan epitope sletting brukes på omtrent alle tenke protein mål uansett rekkefølge, struktur, funksjon, eller tilgjengeligheten av homologooss menneskelige stillaser. Det første skrittet til å implementere en slik tilnærming er identifisering av viktige peptidepitoper innebygd i målet protein sekvens.

Høy gjennomstrømning biokjemiske analyser ved hjelp syntetiske peptider og rekombinante humane MHC II molekyler kan gi raske foreløpige innsikt i epitop identifisere og redusere 1,3-5. Disse ELISA typen analyser kan være et kraftig supplement til andre protein / vaksine design og utviklingsverktøy. For eksempel, en godt etablert eksperimentell tilnærming til epitop kartlegging er avhengig av tid, arbeid og ressurskrevende ex vivo celleproliferasjon analyser 15. I korthet blir den primære sekvens av et målprotein først delt inn i et panel av overlappende peptider, ofte 15-mers med 12 rester overlapping mellom tilstøtende peptider. Peptidet panelet blir kjemisk syntetisert og immunogenisiteten av hvert peptid testes i en av flere forskjellige immunologiske målinger som anvender perifere blood mononukleære celler (PBMC) ble isolert fra humane givere 13,14. For å gi større tillit til resultatene, er peptider vanligvis testet i replikere med PBMC fra 50 eller flere ulike givere. I tilfeller der deimmunization er det ultimate målet, er arbeidet forsterkes ytterligere av behovet for å produsere flere paneler av muterte peptider og teste de nye peptid paneler i PBMC analyser før innføring eventuelle deimmunizing mutasjoner i full lengde protein for påfølgende funksjonsanalyse 10. Selv om disse cellulære analyser forblir gullstandarden for vurdering av immunogene potensial i humane pasienter, kan effektiviteten av en slik metode uttømmende forbedres ved prefiltering putative immunogene epitoper ved hjelp av en hurtig og høy gjennomstrømning II MHC-peptid-bindingsanalyse.

På samme måte kan biokjemiske peptid-MHC II-bindingsanalyser kombineres med prediktiv in silico metoder for å radikalt akselerere epitop identifikasjonsprosessen.Det finnes en rekke dataverktøy for T-celle epitop prediksjon; eksempler inkluderer ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-align 20, NetMHCIIpan 21 samt proprietære verktøy som EpiMatrix etter EpiVax 22. Likeledes har epitop prediktorer nylig blitt kombinert med andre bioinformatikk og molekylær modelleringsverktøy for å vike integrerte protein deimmunization algoritmer designet for å redusere risikoen for at deimmunizing mutasjoner kan forstyrre protein struktur og funksjon 23-26. Mens flere epitop prediktorer har vist seg å være rimelig nøyaktig 27,28, beregningsresultatene alltid kreve eksperimentell validering. Rapid, høy gjennomstrømning, og kostnadseffektive eksperimentelle metoder som er best egnet som en foreløpig filter for i silikofluorid epitope spådommer.

På samme måte, kan epitop prediktorer kjøre antigen utvalg for omvendt vaccinology 29,30. For eksempel, har fremskritt innen bioinformatikk ga hele genomet skjermer som raskt identifiserer vaksinekandidater i form av hele proteiner eller peptidepitoper hentet fra patogen proteomes. Selv om dette slik teknologi er omforme oppdagelse og utvikling av beskyttende vaksiner, introduserer det en ny utfordring i form av intractably store lister over immunogene vaksinekandidater. Høy gjennomstrømming peptid-MHC II bindingsanalyser kan veilede epitope valg ved å tallfeste peptid bindingsaffiniteten og bindende promiskuitet blant flere MHC II alleler. Som med protein deimmunization, er slike eksperimentelle metoder til slutt nødt til å validere beregnings prediksjon av lovende vaksine fører.

Her blir et peptid-MHC II-bindingsanalysen skalert til 384-brønnformat beskrevet. Protokollen er svært parallelliserte og reduserer reagenvolumer kostnadene med 75% sammenlignet med tidligere beskrevet 96-brønns plate formater 1,3-5. Ved hjelp av et enkelt avviklingd håndtering robot, gir denne metoden en forsker å enkelt analysere omtrent nitti test peptider i tre eksemplarer over et utvalg av åtte konsentrasjoner og fire MHC II allel typer i mindre enn 48 timer. Denne artikkelen beskriver oppsett av en 384-brønnen ELISA-plate for analyse av syv eksperimentelle peptider mot en MHC II allel, men regneark kalkulatorer er gitt som supplerende materiale, slik at det enkelt kan skalere eksperimentet til en rekke ønskede peptider og / eller MHC II molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fire store aktiviteter omfatter peptid-MHC II bindende analysen: 1-Binding: Test peptider konkurrere med merkede kontroll peptider for løsning fase binding av løselig MHC II proteiner. Binding blir målt over et bredt område av peptid-konsentrasjoner test. 2-Capture: Etter binding reaksjonen nærmer seg likevekt, har peptid-MHC II-komplekser fanget og skilt fra ubundet peptid-og protein ved konformasjon avhengig gjenkjenning med et immobilisert antistoff. 3-Detection: Captured kontroll peptid er kvantitativt oppdaget ved hjelp av tid-løst fluorescens. 4-analyse: Spektroskopiske data blir behandlet, plottet og analysert for å fastslå en doseavhengig bindende egenskaper til test-peptid og MHC II-proteinene.

På forskjellige trinn i fremgangsmåten nedenfor, er bruken av en flytende håndtering robot anbefales dersom en slik er tilgjengelig. Spesielt i en 384-brønnen format, automatisert dosering og fortynning av væsker reduserer brukerfeil, resultater i merkonsistente godt-til-brønn volumer, og gir smalere 95% konfidensintervall for IC 50-verdier i forhold til manuell 96-brønns analyser (data ikke vist). Hvis en væske håndtering robot ikke er tilgjengelig, er fremgangsmåten kommenterte med "(flytende håndtering robot)" kan gjøres for hånd. Tilsvarende, hvis det er mulig, er en automatisk platevasker som er kompatibel med den 384-brønnformat anbefalt. Dette standardiserer effektivt platen vaskeprosessen. Hvis en plate vaskemaskinen ikke er tilgjengelig, er fremgangsmåten kommenterte med "(plate vaskemaskin)" kan gjøres for hånd.

En. Coat ELISA Plate (Dag 1)

  1. Fortynn L243 antistoff lager (0,5 mg / ml) i boratbuffer til en arbeidskonsentrasjon på 10 ug / ml.
    1. For å belegge en enkelt 384-brønn plate, tilsett 200 pl av lager antistoff til 9,8 ml av borat-buffer. (Se supplerende regneark kalkulator for alternativ skalering).
  2. Tilsett 25 pl av den L243-antistoff-løsning til hver brønn i en 384-well høy-bindende hvit ELISA-plate. (Væskehåndtering robot)
  3. Forsegl plate med en polyesterfilm og inkuberes over natten ved 4 ° C.
    Merk: Hver 384-brønnen ELISA-plate kan romme opp til 15 test peptider på åtte fortynninger for ett MHC II allel, samt de positive og negative kontroller. Dette vil til slutt gi tredoble målinger.

2. Gjør Test Peptide fortynninger (Dag 1)

  1. Fra og med en 10 mM stock i hver test peptidet i DMSO, blir følgende fortynningsserie i sitrat fosfatbuffer ved hjelp av 384-brønns plater av polypropylen (tabell 1). (Væskehåndtering robot)
    Merk: En full 384-vel polypropylen plate krever tre separate ELISA plater. En tredjedel av en polypropylen-plate vil kreve bare en ELISA-plate (fig. 1).
Fortynning Antall Volume to ta fra før fortynning / lager Volume citratbuffer å legge Kons. Utvannings Kons. i bindingsreaksjon Kons. i Nøytralisert ELISA
(Il) (Il) (Mikrometer) (Mikrometer) (Mikrometer)
1 0,7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28.7 19,389 9,695 4,847
4 14.3 14.3 9,695 4,847 2,424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0,481
6 14.3 14.3 0.961 0,481 0,24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Fjern og kast 7,1 mL av peptid løsning fra fortynning nummer åtte.

Tabell 1. Utarbeidelse av test peptid fortynning serien.

Figur 1
Figur 1. Plate Kart over Peptide Binding analysen. (A) Kart over peptid fortynninger i polypropylen 384-brønners plater. Hver polypropylen plate kan romme tre grupper på 15 peptider i konkurranse bindende reaksjoner mot en synge le MHC II allel. (B) Etter at bindingsreaksjon nærmer seg likevekt, blir hvert peptid gruppe overføres i tre eksemplarer, til en separat 384-brønners ELISA-plate som er blitt forbelagt med anti-MHC II antistoff.

Tre. Forbered MHC II Master Mix (Dag 1)

  1. Gjør reaksjonsbuffer
    1. Tilsett 80 pl 1 mM Pefa Bloc og 60 mg av oktyl-β-D-glucopyranaside til 3,920 mL av sitrat fosfatbuffer. (Se supplerende regneark kalkulator for alternativ skalering).
  2. Fortynn utvalgte MHC II-stamløsninger til 101 nM i reaksjonsbuffer ved hjelp av et 15 ml konisk rør (tabell 2).
    Bemerk: MHC II-konsentrasjon vil i siste instans være 50 nM i bindingsreaksjon, og 25 nM i den nøytraliserte ELISA-analysen. De MHC II arkiv konsentrasjoner vil variere avhengig av produsent partinummer. (Se supplerende regneark kalkulator).
"> MHC II Allele DRB1 *: 1501 MHC II Stock Konsentrasjon (mg / ml) 1.3 MHC II Stock Konsentrasjon (mm) 20 Vol. MHC II Stock å legge (ml) 14.65 Vol. Reaksjonsbuffer å legge (ml): 2885,35 MHC II Master Mix Konsentrasjon (nM) 101

Tabell 2. Utarbeidelse av MHC II mester mix.

4. Forbered de negative og positive kontroller (Dag 1)

  1. Til 21,5 ul av sitrat fosfatbuffer med "negative kontroll" brønn av 384-brønns polypropylenplate fra trinn 2.1 (figur 1A).
  2. Til 21,5 ul av sitrat fosfatbuffer til "positiv kontroll" brønn av 384-brønns polypropylenplate.
    Merk: "positive kontroll "vil være ferdig i punkt 5 nedenfor.
  3. Fjern 49,5 mL av MHC II Master Mix fra trinn 3,2 og pipette til et 1,5 ml Eppendorf tube.
  4. Tilsett 0,5 mL av citratbuffer til 49,5 ul av MHC II Master Mix fra trinn 4.3.
  5. Legg 21,5 mL av konsentrasjonen justert MHC II Master Mix fra trinn 4.4 til "negativ kontroll" godt over 384-brønnen polypropylen plate (figur 1A).
    Merk: denne prøven representerer null-signal negativ kontroll inneholder MHC II protein, ingen kontroll peptid, og ingen test peptid.

5. Legg til de aktuelle kontroll Peptide til MHC II Master Mix (Dag 1)

MHC II Allele DRB1 * Biotinylated Kontroll Peptide (Rester) Sequence
0101 Flu-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid
0301 Myoglobin (137-148) Biotin-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotin-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotin-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Flu-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid
1501 MBP-B (84-102) Biotin-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Vi anbefaler at du bestiller 10 mg skala for økonomien.
Tabell 3. Kontroll Peptider for ulike MHC II alleler. *

  1. Fortynn kontroll peptid (lagret ved 400 uM i DMSO) 1:20 i friskt DMSO for å gi en fortynnet lager ved 20 uM.
    1. Legg 25 mL 400 mikrometer kontroll peptid til475 mL DMSO. Merk: Dette er et stort overskudd, men tillater nøyaktig håndtering av viskøse DMSO-løsninger.
  2. Videre fortynne kontroll Peptide fra trinn 5.1 (20 mM) 1:100 inn i MHC II Master Mix fra trinn 3.2.
    1. Til 28,8 ul av kontroll Peptide fortynnet i trinn 5.2 til de gjenværende 2,850.5 pl av MHC II Master Mix.
  3. Til 21,5 ul av MHC II Master Mix med kontroll peptidet (trinn 5.2) til en positiv kontrollbrønn i 384-brønns polypropylenplate (trinn 4.2) (fig. 1A). Merk: Denne prøven representerer høy-signal positiv kontroll inneholdende MHC II-protein, kontroll peptid, og ingen test peptid.

6. Gjør Binding Reaction (Dag 1)

  1. Tilsett MHC II Master Mix innehold Kontroll Peptid (trinn 5.2) til hver av test Peptide fortynninger (trinn 2.1) i forholdet 1:1 for å skape den bindingsreaksjon.
    1. Legg 21,5 mL av MHC II Master Mix inneholder Conkontroll Peptide fra trinn 5,2 til 21,5 mL av hver Test Peptide fortynning fra trinn 2.1. (Væskehåndtering robot)
  2. Forsegl bindingsreaksjon med en polyesterfilm og inkuberes 12-24 timer i en ikke-CO 2-styrt inkubator ved 37 ° C uten risting.

7. Nøytralisere og Overfør Binding Reaction (Dag 2)

  1. Fjern det 384-brønns polypropylenplate som inneholder bindingsreaksjon (trinn 6.2) fra 37 ° C inkubator.
  2. Fortynne Binding Reaction 01:01 med Neutralization Buffer. (Væskehåndtering robot)
    1. Legg 43 mL av nøytralisering buffer til hver bindingsreaksjon godt.
  3. Fjern ELISA-plate (trinn 1.3) fra 4 ° C og vaskes 3 ganger med 60 ml / brønn av PBS-0,05% Tween 20. (Plate vaskemaskin)
  4. Overføring 25 mL av hver nøytralisert bindingsreaksjon fra trinn 7,2 til tredoble brønner av antistoff-belagte 384-brønners ELISA-plate fra trinn 7.3. (Figur 1
  5. Dekk ELISA-plate med en polyesterfilm og plasseres i en 37 ° C inkubator i 2,5 timer eller i et 4 ° C kjøleskap over natten.

8. ELISA Development (dag 2 eller 3)

  1. Fjern ELISA-plate fra trinn 7.5, vaskes 3 ganger med 60 ul / brønn av PBS-0,05% Tween. (Plate vaskemaskin)
  2. Fortynne Streptavidin-europium stamløsning (0,1 mg / ml streptavidin, 7 Eu 3 + / streptavidin) 1000-fold i Delfia analysen Buffer.
    1. For en 384-brønners plate, fortynne 10 mL Streptavidin-europium i 10 ml Assay Buffer.
  3. Tilsett 25 pl av den fortynnede Streptavidin-Europium til hver brønn av 384-brønns ELISA-plate fra trinn 8.1. (Væskehåndtering robot)
  4. Dekk plate med en polyesterfilm og plasser i mørke ved romtemperatur i 1 time. Merk: Under en time inkubasjon fjerne Enhancement Solution fra kjøleskapet og sette av 10 ml / plate i mørket på roOM-temperatur.
  5. Etter en-timers inkubasjon vaskes det 384-brønners ELISA-plate fra trinn 8.3 3x med 60 ul / brønn av PBS-0,05% Tween. (Plate vaskemaskin)
  6. Tilsett 25 pl av Enhancement løsning i hver brønn av 384-brønns ELISA-plate fra trinn 8.5. (Væskehåndtering robot)
  7. Dekk til 384-brønners ELISA-plate med en polyesterfilm og at platen kan sitte i mørket ved romtemperatur i 10-15 min.
  8. Etter 10-15 min inkubasjon, lese fluorescens av 384-brønnen ELISA-plate fra trinn 8.7 bruker en tids løst fluorescerende plate leseren med Europium innstillinger (for eksempel Start-Int: 200, Stop Int:. 1000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Ingen, PMT: Auto, Leser / Well: 50).

9. Data Analysis

  1. Skriv inn data i XY-format graf med tre replikat verdier i side-ved-side-kolonner (X = test peptid konsentrasjon, Y = fluorescens måling).
  2. Logg transformere x-verdiene for alle data: X = log (X)
  3. Monter logg transformed data med den ene-side konkurrerende bindingsmodell for å ekstrahere IC 50 verdi.
  4. Begrense bunnverdien til den gjennomsnittlige negative kontrollverdi.
  5. Globalt passer toppverdi, og sørge for at den globale fit parameteren er under eller lik den positive kontrollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den modne peptidsekvensen av Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) ble analysert med ProPred 16 for putative peptid bindemidler til MHC II allele DRB1 * 1501 (tabell 4). ProPred identifisert 117 nonamer peptider med en obligatorisk P1 anker residuum (dvs. en M, L, I, V, F, Y, W or i stilling 1, som er nødvendig for MHC II-bindende 31). På en 5% grensen, peptider bare med score større enn eller lik 2,6 er sannsynlige bindemidler. Dermed, på 5% grensen, er det bare de beste 11 peptider spådd å binde MHC II DRB1 * 1501.

Tabell 4
Tabell 4. Top-scoring ProPred spådommer for BLA peptider og MHC II allel DRB1 * 1501.

Et representativt panel av spådd epitopes ble valgt ut for analyse i vår MHC II bindingsanalyse (Tabell 4, dristige oppføringer). BLA peptid fragmenter av femten rester ble kjemisk syntetisert slik at antatte nonamer MHC II epitoper ble integrert i de syntetiske proteinfragmenter. Mens MHC II-bindende rillen seg ​​rommer bare ni aminosyrer, antyder bevis for at flankerende sekvenser kan påvirke peptid-MHC II-interaksjoner, og syntetiske peptider av 15-20 rester er derfor vanligvis blir anvendt for 15. For å representere den komplekse overlappende epitoper som kan oppstå i biologisk behandlede proteinfragmenter, testet vi syntetiske sekvenser som inneholdt (i) én forutsagte bindemidler, (ii) én forutsagte nonbinders, (iii) multiple predikert bindemidler, (iv) multiple predikerte nonbinders, eller (v) en blanding av predikerte bindemidler og nonbinders (Tabeller 4 og 5).

Tabell 5 Tabell 5. Liste over kjemisk syntetisert Peptider.

Kapasiteten av disse syntetiske peptider til å konkurrere med biotinylert MBP-B-kontroll peptidet (tabell 3) for binding til MHC II DRB1 * 1501 ble analysert som beskrevet i protokollen ovenfor. Konkurrerende bindingskurvene for de syntetiske peptider er vist i figur 2. IC-50-verdier ble beregnet ved å tilpasse log-transformerte data ved å bruke den en-stedet konkurrerende binding, ikke-lineær tilpasning funksjon av Prism (tabell 6). Som vist i figur 2, er de peptider naturligvis fordeles i tre grupper: sterke bindemidler med IC50 <1 pM (peptider 2 og 10), moderate bindemidler med 1 mM ≤ IC 50 <100 pm (peptider 4, 9, 11, og 24 ); svake bindemidler med IC 50 ≥ 100 μ; M (peptid 31).

Fig. 2
Figur 2. Konkurranse Binding Curve av BLA Peptider for MHC II allele DRB1 * 1501. Tight bindemidler er passe med oransje linjer, moderate bindemidler grønne linjer, og den svake bindemiddel en rødbrun linje.

Peptide Rank IC 50 (mikrometer) 95% CI for IC 50 (mikrometer) Quality of Fit (R 2)
2 0,1199 0,09404 til 0,1529 0,98
4 15.1 11,83 til 19,28 0,87
9 17.11 13,39 til 21,88 0,81
10 0,2743 0,2149 til 0,3502 0,98
11 10.49 8,252 til 13,34 0,98
24 4.787 3,769 til 6,082 0,96
31 190,6 137,7 til 263,9 0,80

Tabell 6. Beregnet IC 50 verdier av BLA peptid fragmenter for DRB1 * 1501.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biotherapeutics har etablert seg som en hjørnestein i moderne medisin, som representerer fire av de fem som selger narkotika i 2012 32. Sektoren Biopharmaceutics har vist vedvarende vekst i flere år 6, og den pågående utviklingen av nye midler, samt fremveksten av biosimilars har utvidet biofarmasøytisk rørledninger. Se fremover, vurdere og dempe immunogenisitet av protein legemiddelselskap vil bli en integrert del av tidlig stadium biotherapeutic utvikling. For å lette denne prosessen, kan biotechnologists benytte seg av beregningsmetoder for epitope prediksjon 16-22 samt integrerte protein utforming algoritmer som søker å redusere immunogenisitet og samtidig opprettholde funksjon 3,23-26. Likeledes kan vaksine design og utvikling utnytte kraften av prediktive algoritmer 4, og den fortsatte modning av omvendt Vaccinology forventes å gi beskyttendeVaksiner til et bredt spekter av smittestoffer som har slått igjennom tidligere innsats 33. Mens disse dataverktøy har kapasitet til å radikalt akselerere narkotika og vaksine utviklingsprosesser, må resultatene av i silico spådommer slutt filtreres ytterligere slik til å identifisere en medgjørlig rekke topp resultater kandidater. Nylige fremskritt innen kvantitativ peptid-MHC II analyse har tatt utviklingen av konstruerte gjærcelleoverflaten display systemer 34 og microbead basert Selvlysende Oxygen Kanalisering Immunoassays 35, men in vitro ELISA typen analyser forbli arbeidshesten for kvantifisering binding mellom bestemte MHC II og peptid parene. Her blir en mikroliter skala fremgangsmåte for hurtig, kvantitativ, og kostnadseffektiv analyse av peptid-epitop-binding til humane MHC II-immun-molekyler er beskrevet. Disse metodene kan bli brukt som et tidlig stadium eksperimentelt verktøy i trakt for prosessen.

For den purposes av demonstrasjon, ble sekvensen av BLA analysert for antatte MHC II-bindende peptider ved hjelp av ProPred webserver. Sju av disse peptidene ble kjemisk syntetisert og eksperimentelt testet for binding til humant MHC II DRB1 * 1501. I likhet med andre analyser av prediktor nøyaktighet 28, ProPred bindende prediksjon korrelert rimelig godt med eksperimentelt målt IC 50 for DRB1 * 1501 MHC II allel. Det er også viktig å merke seg at resultatene er følsomme for variasjoner i konsentrasjoner og omsorg bør tas for å sikre nøyaktige fortynninger av MHC, kontroll peptider, og test peptider. Likeledes er en begrensning ved denne metoden er at IC 50 verdier er i forhold til konsentrasjonen av MHC og kontrollpeptider. Blant BLA peptid test sett, den høyest rangerte ProPred epitope utstilt den sterkeste bindingen til rekombinant DRB1 * 1501. På samme måte alle andre spådde epitop permer utstilt moderat til høy MHC II slektskap. Som ventetsyntetiske peptider som inneholder overlappende forutsagte bindings epitoper og ikke-bindende epitoper ble funnet å binde MHC II i alle tilfeller. Peptid 31, som strakte to av de lavest rangerte predikerte epitoper, viste seg å være det svakeste MHC II bindemiddel. Peptid 24 ble imidlertid funnet å binde MHC II med moderat affinitet til tross for at det bare høyt rangert bestanddel epitop (epitop 24) var ikke en predikert bindemiddel på 5%-terskelen. Interessant, epitop 24 ble identifisert i en tidligere studie rettet mot deimmunizing BLA 10. I disse eksperimenter ble det syntetiske peptid 24 vist seg å være meget immunogene i humane PBMC-analyser. Derfor, i dette ene tilfellet, viste vår MHC II bindende analysen skal være forutsigbare for immunogenisitet mens ProPred gjorde ikke. I samlet resultatene demonstrere nytten av beregnings spådommer i guiding forskere mot sannsynlige immunogene epitoper, men de også understreke betydningen av høy gjennomstrømming eksperimentelle metoder som en integrert del avprotein / vaksine designprosessen.

Viktigere, er dette 384-godt eksperimentelt design svært parallelliserte og tillater grundig analyse av opp til 15 peptider og ett MHC II allel per 384-brønnen ELISA-plate. Ved hjelp av en enkelt væskehåndtering robot, gir denne metoden en forsker å analysere nitti test peptider mot fire MHC II allel typer i mindre enn 48 timer. Denne utformingen omfatter åtte forskjellige test peptid konsentrasjoner og trippel-måling ved hver konsentrasjon. Derfor er du sikret robuste og reproduserbare kvantitative resultater. Andre som jobber innen protein legemiddelselskap eller vaksine design og utvikling kan finne denne protokollen for å være nyttig i å tilrettelegge sitt arbeid i protein deimmunization eller immunogenisitet analyse.

Sitratfosfat Buffer (22,2 mM sitronsyre, 55,6 mM Dibasic Na 2 HPO 4, pH 5,4)
222 ml 0,1 M sitronsyre
278 ml 0,2 M dibasic Na 2 HPO 4
500 ml MilliQ H 2 O
Bland sitronsyre, natriumfosfat og 450 ml MilliQ H2O Juster pH til 5,4 og Qs til en L.
Denne oppløsning er stabil ved romtemperatur.
Binding reaksjonsbuffer
Citrat-fosfatbuffer, pH 5,4 med 2% v / v 1 mM PefaBloc
1,5% w / v Octyl-β-D-glucopyranaside
Bruke med en gang.
1 mM PefaBloc
1 ml MilliQ H 2 O
25 mg PefaBloc SC (pulver)
Gjør alikvoter og oppbevar ved -20 ˚ C.
Boratpuffer Formula (12,5 mm Sodium tetradekahydrat, pH 8,2)
1,19 g natrium tetraborate decahydrate (Sigma)
250 ml MilliQ H 2 O
Oppløse natrium tetraborate decahydrate i 225 ml MilliQ H 2 O. Juster pH til 8,2 og qs til 250 ml.
Denne oppløsning er stabil ved romtemperatur.
PBS-Tween (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH PO 2 til 4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na HPO 2 4 • 7H 2 O, 0,05% Tween, pH 7,4)
4,5 L MilliQ H 2 O 500 ml 10x Dulbeccos PBS (DPBS)
2,5 ml Tween 20
Denne oppløsning er stabil ved romtemperatur.
Nøytralisering buffer (50 mM Trizma-HCl, pH 8,0)
475 ml MilliQ H 2 O
25 ml 1 M Trizma HCl
Bland og justere pH til 8,0
Denne oppløsning er stabil ved 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Leonard Moise er ansatt og har opsjoner i EpiVax, Inc., et privateid bioteknologiselskap lokalisert i Providence, RI. Arbeidet i denne forskningsrapporten er fri for eventuelle skjevheter som måtte være forbundet med de kommersielle mål for selskapet.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01-GM-098 977 og R21-AI-098122 til CBK og KEG. RSS ble støttet delvis av en Luce Foundation Fellowship og delvis av en Thayer Innovation Program Fellowship fra Thayer School of Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Tags

Biokjemi Immunoassay Protein Immunogenisitet MHC II T-celle epitop høy gjennomstrømning Screen Deimmunization Vaccine Design

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
En høy gjennomstrømning MHC II Binding Assay for kvantitativ analyse av peptidepitoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L.,… More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter