Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Published: March 25, 2014 doi: 10.3791/51308
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

ERRATUM NOTICE

Summary

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Abstract

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp 1,2. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes. De verkleinde protocol vermindert reagens met 75% en is hoger doorvoer dan eerder beschreven 96-well protocollen 1,3-5. Specifiek proefopzet maakt robuuste en reproduceerbare analyse tot 15 peptiden tegen een MHC allel per 384-well ELISA-plaat. Met een vloeistofverwerking robot, deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur geanalyseerd. Anderen werken op het gebied van eiwit deimmunization of vaccin ontwerp en ontwikkeling vinden het protocol om nuttig zijn in hun eigen werk vergemakkelijken zijn. Met name de stap-voor-stap instructies en visueel formaatvan Jupiter moet het mogelijk maken dat andere gebruikers deze methode snel en eenvoudig vast te stellen in hun eigen laboratoria.

Introduction

Eiwitten zijn de snelst groeiende klasse van therapeutische middelen 6, en de snelle expansie van biotherapeutic pijpleidingen heeft steeds meer aandacht gericht op de uitdagingen in verband met de ontwikkeling en het gebruik van eiwit drugs. Een unieke behandeling voort uit het feit dat in een gezond en functionerend immuunsysteem, alle extracellulaire eiwitten worden bemonsterd door antigeen presenterende cellen (APC's). Eenmaal geïnternaliseerd door APCs, is een eiwit gesplitst in kleine peptidefragmenten en vermeende immunogene segmenten in de groef van klasse II major histocompatibility complex eiwit (MHC II) geladen. De peptide-MHC complexen worden dan weergegeven op de APC oppervlak en waar immunogene peptiden, aangeduid als T-celepitopen vormen ternaire II MHC-peptide-T-cel receptor complexen cognate CD4 T-cel oppervlakte receptoren 7. Deze kritische moleculaire gebeurtenis herkenning een complexe signaalcascade, waardoor T-cel activatie, het vrijkomen van cytokines, CD4 T-cel gemedieerde B-cel rijping, en uiteindelijk de productie van circulerende IgG-antilichamen die binden aan en duidelijk het overtredende exogene eiwit. Zo zouden immunogene eiwitten worden deimmunized door identificatie van delen T cel epitopen en mutatie sleutelresten verantwoordelijk voor MHC II complexvorming. Het draagt ​​niettemin opmerkend dat T-celepitopen talrijk en breed verspreid immunogene eiwitten kunnen zijn, en de meerderheid van epitoop verwijderen mutaties waarschijnlijk een onopzettelijk verlies van eiwitfunctie of stabiliteit veroorzaken. Daarom techniek deimmunized biotherapies kan een complexe en technisch uitdagende doelstelling, maar er bestaan ​​verschillende voorbeelden van succesvolle T-cel epitoop verwijdering projecten 3,5,8-12. Unlike-enten based "vermenselijking", die grotendeels beperkt tot antistoffen kunnen epitoop deletie worden toegepast in wezen elk eiwit doelwit ongeacht sequentie, structuur, functie of de beschikbaarheid van homologoons menselijk steigers. De eerste stap naar de uitvoering van een dergelijke aanpak is de identificatie van de belangrijkste peptide epitopen ingebed in de doelwiteiwitsequentie.

Hoge doorvoer biochemische analyses met behulp van synthetische peptiden en recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle voorlopige inzichten in identificatie en mitigatie 1,3-5 epitoop. Deze ELISA soort testen kan een krachtige aanvulling op andere eiwit / vaccins voor ontwerp en ontwikkeling zijn. Bijvoorbeeld, een gevestigde experimentele benadering van epitoop kartering voert tijd, arbeid en geld kosten ex vivo celproliferatie assays 15. In het kort wordt de primaire sequentie van een doeleiwit eerst verdeeld in een panel van overlappende peptiden, vaak 15-meren met 12 residuen overlap tussen aangrenzende peptiden. Het peptide paneel chemisch gesynthetiseerd en immunogeniciteit van elk peptide getest in een van de verschillende immunoassays die perifere bloe dienstd mononucleaire cellen (PBMC) geïsoleerd uit menselijke donoren 13,14. Een groter vertrouwen in de resultaten te bieden, worden peptiden meestal getest in duplo met PBMC van 50 of meer verschillende donoren. In gevallen waarin deimmunization is het uiteindelijke doel, is het werk nog verergerd door de noodzaak om extra panelen van gemuteerde peptiden produceren en testen van de nieuwe peptide panelen in PBMC testen vóór de invoering van elke deimmunizing mutaties in het eiwit van volledige lengte voor verdere functionele analyse 10. Hoewel deze cellulaire bepalingen blijven de gouden standaard voor de beoordeling immunogeen potentieel in menselijke patiënten, kan de efficiëntie van een exhaustieve benadering worden verbeterd door voorfilteren vermoedelijke immunogène epitopen met een snelle hoge doorvoer MHC-peptide bindingstest.

Evenzo kan biochemische peptide-MHC II bindingsproeven worden gecombineerd met voorspellende in silico methoden om radicaal te versnellen het epitoop identificatieproces.Er bestaan ​​verschillende computationele gereedschappen voor T-cel epitoop voorspelling; voorbeelden zijn ProPred 16, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, SMM-lijn 20, NetMHCIIpan 21 evenals eigen tools zoals EpiMatrix door EpiVax 22. Ook hebben epitoop voorspellers onlangs gecombineerd met andere bio-informatica en moleculaire modeling tools om geïntegreerde eiwit deimmunization algoritmen ontwikkeld om het risico dat deimmunizing mutaties eiwit structuur en functie 23-26 kan verstoren verzachten opleveren. Terwijl verscheidene epitoop voorspellers hebben bewezen redelijk accuraat 27,28, computationele resultaten steevast vereisen experimentele validatie. Snelle, high throughput, en kosteneffectieve experimentele methoden het meest geschikt zijn als een voorfilter voor het in silico epitoop voorspellingen.

In dezelfde geest, kan epitoop voorspellers antigeen selectie rijden voor omgekeerde vaccinology 29,30. Zo hebben ontwikkelingen in de bioinformatica gehele genoom schermen die snel vaccinkandidaten in de vorm van gehele eiwitten of peptide-epitopen afkomstig van pathogeen proteomen identificeren opgeleverd. Hoewel deze enabling technology is de omvorming van ontdekking en ontwikkeling van beschermende vaccins, het introduceert een nieuwe uitdaging in de vorm van intractably grote lijsten van immunogeen vaccin kandidaten. Hoge doorvoer peptide-MHC II bindingsbepalingen kan epitoop selectie begeleiden door het kwantificeren van peptide bindingsaffiniteit en bindend promiscuïteit tussen meerdere allelen MHC II. Zoals bij proteïne deimmunization, worden dergelijke experimentele methoden uiteindelijk nodig om computationele voorspelling van veelbelovende vaccin leads te valideren.

Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes beschreven. Het protocol is zeer parallel verlopende en vermindert reagens met 75% in vergelijking met eerder beschreven 96-well plaat formaat 1,3-5. Met behulp van een enkele Liquid handlingrobot Deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud gemakkelijk geanalyseerd over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur. Dit artikel beschrijft de installatie van een 384-wells ELISA-plaat voor de analyse van zeven experimentele peptiden tegen een MHC II allel, maar spread sheet rekenmachines worden als aanvullend materiaal om zo gemakkelijk uitbreiden het experiment om een ​​aantal gewenste peptiden en / of MHC II moleculen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vier belangrijkste activiteiten bestaan ​​uit het peptide-MHC II bindingtest: 1-Binding: Test peptiden concurreren met gelabelde controle peptiden voor oplossing fase binding van oplosbare MHC II-eiwitten. Binding wordt gemeten over een breed scala van testpeptide concentraties. 2-Capture: Na de binding reactie benaderingen evenwicht, zijn peptide-MHC II-complexen opgevangen en gescheiden van niet-gebonden peptide en proteïne door conformatieafhankelijke erkenning met een geïmmobiliseerd antilichaam. 3-Detectie: Gevangen controle peptide wordt kwantitatief gedetecteerd met behulp van time-resolved fluorescentie. 4-Analyse: spectroscopische gegevens worden verwerkt, uitgezet en geanalyseerd dosisafhankelijk bindingseigenschappen van testpeptide en MHC II-eiwitten bepalen.

Op verschillende stappen in de onderstaande procedure wordt de toepassing van een vloeibare handlingrobot aanbevolen indien beschikbaar. Vooral in een 384-well formaat, geautomatiseerde doseer-en verdunning van vloeistoffen minimaliseert gebruikersfouten, leidt tot meerconsistente well-to-well volumes en levert smaller 95% betrouwbaarheidsintervallen voor IC50 waarden vergeleken met handmatige 96-well assays (gegevens niet getoond). Als een vloeistof handlingrobot niet beschikbaar is, de stappen geannoteerde met "(liquid handling robot)" kan worden met de hand gedaan. Evenzo, indien mogelijk, een geautomatiseerde plaatwasser die met de 384-well formaat is aanbevolen. Dit effectief standaardiseert de plaat wasproces. Als een plaatwasser niet beschikbaar is, de stappen geannoteerde met "(plaatwasser)" kan worden met de hand gedaan.

1. Coat de ELISA-plaat (dag 1)

  1. Verdun L243 antilichaam voorraad (0,5 mg / ml) in boraatbuffer een werkende concentratie van 10 ug / ml.
    1. Het coaten van een 384-wells plaat, voeg 200 ul van voorraad antilichaam tot 9,8 ml boraatbuffer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine voor alternatieve scaling).
  2. Voeg 25 ul van het L243 antilichaam oplossing in elk putje van een 384-well high-bindend witte ELISA-plaat. (Liquid handling robot)
  3. Sluit de plaat met een polyester film en incubeer overnacht bij 4 ° C.
    Opmerking: Elke 384-wells ELISA-plaat is geschikt voor maximaal 15 testpeptiden op acht verdunningen voor een MHC II allel, evenals de positieve en negatieve controles. Dit zal uiteindelijk opleveren drievoud metingen.

2. Maak de Test Peptide Verdunningen (dag 1)

  1. Beginnend met een 10 mM voorraadoplossing van elke test peptide in DMSO, de volgende verdunningsreeks in citraat fosfaatbuffer met 384-well polypropyleen platen (Tabel 1). (Liquid handling robot)
    Opmerking: Een volledige 384-well polypropyleen plaat vereist drie afzonderlijke ELISA platen. Een derde van een polypropyleen plaat slechts een ELISA plaat (Figuur 1) vereist.
Verwatering Nummer Volume to te nemen van voorafgaande verdunning / voorraad Volume citraat buffer toe te voegen Conc. van Verwatering Conc. in bindingsreactie Conc. in geneutraliseerd ELISA
(Pl) (Pl) (UM) (UM) (UM)
1 0.7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28.7 19,389 9,695 4,847
4 14.3 14.3 9,695 4,847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Verwijder en gooi 7,1 ul van peptide-oplossing van verdunning nummer 8.

Tabel 1. Bereiding van testpeptide verdunningsreeks.

Figuur 1
Figuur 1. Plaat Kaart van peptide bindingsassay. (A) Kaart van de peptide verdunningen polypropyleen platen met 384 putjes. Elke polypropyleen plaat is geschikt voor drie groepen van 15 peptiden in concurrentie bindingsreacties tegen een zingen le MHC allel. (B) Na de bindingsreactie zal evenwicht wordt elke peptide fractie overgebracht in drievoud een afzonderlijke 384-wells ELISA plaat die is tevoren met anti-MHC II-antilichaam.

3. Bereid de MHC II Master Mix (dag 1)

  1. Maak de Reaction Buffer
    1. Voeg 80 ul van 1 mM Pefa Blok en 60 mg octyl-β-D-glucopyranaside tot 3.920 gl citraat fosfaatbuffer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine voor alternatieve scaling).
  2. Verdun geselecteerd MHC II voorraadoplossingen tot 101 nM in Reaction Buffer met een 15 ml conische buis (Tabel 2).
    Opmerking: zal MHC II concentratie uiteindelijk 50 nM in de bindingsreactie en 25 nM in de geneutraliseerde ELISA assay. De MHC II voorraad concentraties zullen variëren afhankelijk van de fabrikant lotnummer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine).
"> MHC II Allele DRB1 *: 1501 MHC II Stock Concentratie (mg / ml) 1.3 MHC II Stock Concentratie (mm) 20 Vol. MHC II Stock toevoegen aan (ml) 14.65 Vol. Reaction Buffer aan toevoegen (ml): 2.885,35 MHC II Master Mix Concentratie (nM) 101

Tabel 2. Voorbereiding van MHC II master mix.

4. Bereid de negatieve en positieve controles (dag 1)

  1. Voeg 21,5 ul van citraatfosfaatbuffer om de "negatieve controle" putje van de 384-well polypropyleen plaat uit stap 2.1 (Figuur 1A).
  2. Voeg 21,5 ul van citraatfosfaatbuffer aan de "controle" en van het 384-well polypropyleen plaat.
    Opmerking: de "positietieve controle "zal in hoofdstuk 5 worden afgerond, hieronder.
  3. Verwijder 49,5 ul van de MHC II Master Mix uit stap 3.2 en pipet in een 1,5 ml Eppendorf buis.
  4. Voeg 0,5 ul van citraat buffer om de 49,5 ul van de MHC II Master Mix vanaf stap 4.3.
  5. Voeg 21,5 ul van de concentratie aangepast MHC II Master Mix van stap 4.4 naar de "negatieve controle" putje van de 384-well polypropyleen plaat (Figuur 1A).
    Opmerking: deze steekproef de nul-signaal negatieve controle met MHC II eiwit, GEEN controle peptide, en NO testpeptide vertegenwoordigt.

5. Voeg de juiste controle peptide aan de MHC II Master Mix (dag 1)

MHC II Allele DRB1 * Gebiotinyleerd Controle Peptide (Residuen) Sequentie
0101 Griep-HA-B (306-318) Biotine-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide
0301 Myoglobine (137-148) Biotine-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotine-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotine-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Griep-HA-B (306-318) Biotine-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide
1501 MBP-B (84-102) Biotine-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Wij raden het bestellen van 10 mg schaal voor de economie.
Tabel 3. Controle Peptiden voor verschillende MHC II allelen. *

  1. Verdun de controle peptide (opgeslagen bij 400 uM in DMSO) 1:20 in vers DMSO een verdunde voorraad leveren bij 20 uM.
    1. Voeg 25 ul 400 uM controle peptide475 ul DMSO. Let op: dit is een groot risico, maar maakt nauwkeurige afhandeling van viskeuze DMSO oplossingen.
  2. Verder te verdunnen de controle peptide van stap 5.1 (20 mm) 1:100 in de MHC II Master Mix vanaf stap 3.2.
    1. Voeg 28,8 ul van controle peptide verdund in stap 5.2 om de resterende 2,850.5 ul van de MHC II Master Mix.
  3. Voeg 21,5 ul van de MHC II Master Mix met controle peptide (stap 5.2) naar de positieve controle en van het 384-well polypropyleen plaat (stap 4.2) (Figuur 1A). Opmerking: deze steekproef de high-signaal positieve controle met MHC II eiwit, controle peptide, en NO testpeptide vertegenwoordigt.

6. Maak de Binding Reactie (dag 1)

  1. Voeg de MHC II Master Mix met controle peptide (stap 5.2) aan elk van de test Peptide verdunningen (stap 2.1) in een 1:1 verhouding aan de bindingsreactie te maken.
    1. Voeg 21,5 ul van MHC II Master Mix met Control Peptide van stap 5,2-21,5 pi van elke Test Peptide verdunning vanaf stap 2.1. (Liquid handling robot)
  2. Dicht de bindingsreactie met een polyester film en incubeer 12-24 uur in een niet-gecontroleerde CO 2 incubator bij 37 ° C zonder schudden.

7. Neutraliseren en Breng de Binding Reactie (Dag 2)

  1. Verwijder de 384-well polypropyleen plaat met de bindingsreactie (stap 6.2) van de 37 ° C incubator.
  2. Verdun de bindingsreactie 1:1 met Neutralization Buffer. (Liquid handling robot)
    1. Voeg 43 ul van de neutralisatiebuffer aan elk Binding Reaction goed.
  3. Verwijder de ELISA-plaat (stap 1.3) bij 4 ° C en wassen 3x met 60 ml / putje van PBS-0,05% Tween 20. (Plaatwasser)
  4. Overdracht 25 ul van elke geneutraliseerd Binding Reactie van stap 7.2 in drievoud putjes van de antilichaam-gecoate 384-wells ELISA-plaat uit stap 7.3. (Figuur 1
  5. Bedek de ELISA-plaat met een polyester film en plaats in een 37 ° C incubator gedurende 2,5 uur of in een 4 ° C koelkast 's nachts.

8. ELISA Ontwikkeling (dag 2 of 3)

  1. Verwijder de ELISA-plaat uit stap 7.5, was 3 keer met 60 ul / putje van PBS-0,05% Tween. (Plaatwasser)
  2. Verdun Streptavidine-Europium voorraadoplossing (0,1 mg / ml streptavidine, 7 Eu 3 + / streptavidine) 1000-voudig in de DELFIA assaybuffer.
    1. Voor een 384-wells plaat, verdunnen 10 ul Streptavidine-Europium in 10 ml Assay Buffer.
  3. Voeg 25 ul van de verdunde streptavidine-Europium aan elk putje van de 384-well ELISA plaat uit stap 8.1. (Liquid handling robot)
  4. Bedek de plaat met een polyesterfilm en donkere plaats bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Opmerking: Tijdens de 1 uur incubatie, verwijder de Enhancement Solution uit de koelkast en zet opzij 10 ml / plaat in het donker bij roOM temperatuur.
  5. Na de 1-uur incubatie, was de 384-well ELISA-plaat uit stap 8.3 3x met 60 ul / putje van PBS-0,05% Tween. (Plaatwasser)
  6. Voeg 25 ul van Enhancement oplossing aan elk putje van de 384-well ELISA plaat uit stap 8.5. (Liquid handling robot)
  7. Bedek de 384-well ELISA-plaat met een polyesterfilm en laat de plaat te zitten in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
  8. Na de 10-15 min incubatie, lees de fluorescentie van de 384-wells ELISA-plaat uit stap 8.7 het gebruik van een time-resolved fluorescerende plaat reader met Europium instellingen (bijvoorbeeld Start Int: 200, Stop Int:. 1000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Geen, PMT: Auto, Leest / Well: 50).

9. Data Analysis

  1. Gegevens invoeren in XY-formaat grafiek met 3 repliceren waarden in de side-by-side kolommen (X = testpeptide concentratie; Y = fluorescentie meting).
  2. Log transformeren de X-waarden voor alle gegevens: X = log (X)
  3. Plaats de log transformed gegevens met een competitieve binding-plaats model om de IC50 waarde te halen.
  4. Beperk de onderste waarde naar de gemiddelde negatieve controlewaarde.
  5. Wereldwijd passen bij de top waarde en verzekeren dat de wereldwijde fit parameter is dan of gelijk aan de positieve controle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De volgroeide peptidesequentie van Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) werd geanalyseerd met ProPred 16 naar mogelijke peptide bindmiddelen MHC allel DRB1 * 1501 (Tabel 4). ProPred geïdentificeerd 117 nonameer peptiden met aangegeven P1 anker residu (dwz een M, L, I, V, F, Y of W op positie 1, vereist voor MHC binding 31). Bij een drempel 5%, alleen peptiden met scores groter dan of gelijk aan 2,6 waarschijnlijk bindmiddelen. Aldus, bij de 5%-drempel, alleen de bovenste 11 peptiden voorspeld MHC II DRB1 * 1501 binden.

Tabel 4
Tabel 4. Hoogst scorende ProPred voorspellingen voor BLA peptiden en MHC II allel DRB1 * 1501.

Een representatief panel van voorspelde epitopes werd geselecteerd voor analyse in onze MHC II binding assay (Tabel 4, gewaagde inzendingen). BLA peptidefragmenten vijftien residuen werden chemisch gesynthetiseerd zodat nonameer vermoedelijke MHC epitopen waren ingebed in de synthetische eiwitfragmenten. Terwijl de MHC II bindingsgroef zelf herbergt slechts negen aminozuren zijn er aanwijzingen dat flankerende sequenties interacties peptide-MHC II kan beïnvloeden, en synthetische peptiden van 15-20 residuen zijn daarom vaak gebruikt 15. Om de complexiteit van overlappende epitopen die zich kunnen voordoen in biologisch verwerkte eiwitfragmenten vertegenwoordigen, testten we synthetische sequenties die (i) enige voorspelde bindmiddelen, (ii) enig voorspeld nonbinders, (iii) meerdere voorspelde bindmiddelen, (iv) verschillende voorspelde nonbinders bevatte, of (v) een mengsel van bindmiddelen en voorspelde nonbinders (tabellen 4 en 5).

Tabel 5 Tabel 5. Lijst van chemisch gesynthetiseerde peptiden.

De capaciteit van deze synthetische peptiden concurreren met het gebiotinyleerde MBP-controle peptide B (tabel 3) voor binding aan MHC II DRB1 * 1501 werd geanalyseerd zoals beschreven in het protocol hierboven. Competitieve bindingskrommen voor de synthetische peptiden worden weergegeven in figuur 2. IC50 waarden werden berekend door het aanbrengen van de log-getransformeerde gegevens via de een-plaats competitieve binding, lineaire fit functie van Prism (tabel 6). Zoals gezien in figuur 2, de peptiden van nature verdelen in drie groepen: sterke bindmiddelen IC50 <1 uM (peptiden 2 en 10), matig bindmiddelen met 1 uM ≤ IC50 <100 uM (peptiden 4, 9, 11 en 24 ); zwakke binders met IC 50 ≥ 100 μ, M (peptide 31).

Figuur 2
Figuur 2. Competitieve binding Curve van BLA peptiden voor MHC II allel DRB1 * 1501. Tight bindmiddelen zijn fit met oranje lijnen, matige bindmiddelen groene lijnen, en de zwakke bindmiddel een kastanjebruine lijn.

Peptide Rank IC50 (uM) 95% CI voor IC50 (uM) Kwaliteit van Fit (R2)
2 0,1199 ,09404-0,1529 0,98
4 15.1 11,83-19,28 0.87
9 17.11 13,39-21,88 0.81
10 0,2743 0,2149-0,3502 0,98
11 10.49 8,252-13,34 0,98
24 4.787 3,769-6,082 0.96
31 190.6 137,7-263,9 0.80

Tabel 6. Berekende IC50 waarden van BLA peptidenfragmenten voor DRB1 * 1501.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biotherapeutics hebben zich gevestigd als een hoeksteen van de moderne geneeskunde, die vier van de top vijf van de verkoop van drugs in 2012 32. De sector biofarmaceutische heeft aangetoond aanhoudende groei voor meerdere jaren 6, en de voortdurende ontwikkeling van nieuwe agenten, evenals de opkomst van biosimilars heeft biofarmaceutische pijpleidingen uitgebreid. Kijkend naar de toekomst, het beoordelen en het inperken van de immunogeniciteit van therapeutische eiwitten zal een integraal onderdeel van de vroege stadium biotherapeutic ontwikkeling. Om dit proces te vergemakkelijken, kan biotechnologen zich van computationele methoden voor het epitoop voorspelling 16-22 evenals geïntegreerde eiwit ontwerp algoritmen die streven naar immunogeniciteit verlagen met behoud van functie 3,23-26 baten. Evenzo kunnen vaccins ontwerp en ontwikkeling profiteren van de kracht van voorspellende algoritmen 4 en de verdere rijping van reverse vaccinologie levert naar verwachting beschermendeVaccins voor een breed scala van ziekteverwekkers die eerdere pogingen 33 zijn ontgaan. Hoewel deze computationele gereedschappen hebben de capaciteit om drugs-en vaccinontwikkelingsprocessen radicaal versnellen, de resultaten van in silico voorspellingen uiteindelijk moet worden verder om zo een handelbaar aantal best presterende kandidaten identificeren gefilterd. Recente ontwikkelingen in de kwantitatieve peptide-MHC II analyse hebben opgenomen voor de ontwikkeling van gemanipuleerde gistcel oppervlak display systemen 34 en microbead gebaseerd Lichtende Oxygen Channeling Immunoassays 35, maar in vitro ELISA soort testen nog steeds het werkpaard voor het kwantificeren van binding tussen specifieke MHC II en peptide paren. Hier wordt een microliter schaal procedure voor snelle, kwantitatieve en kosteneffectieve analyse van peptide-epitoop binding aan humane MHC II moleculen immune beschreven. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt als vroegtijdig experimentele rol in het proces trechtervorming.

Voor de purposes van demonstratie, de sequentie van BLA werd geanalyseerd op vermoedelijke MHC bindende peptiden met de ProPred server. Zeven van deze peptiden werden chemisch gesynthetiseerd en experimenteel getest op binding met oplosbare humane MHC II DRB1 * 1501. Net als bij andere analyses van predictor nauwkeurigheid 28, ProPred bindend voorspelling correleerde redelijk goed met experimenteel gemeten IC50 voor de DRB1 * 1501 MHC II allel. Het is ook belangrijk op te merken dat de resultaten gevoelig voor variaties in concentraties en zorg moeten worden genomen om nauwkeurige verdunningen van MHC, controle peptiden en testpeptiden waarborgen. Ook een beperking van deze methode is dat de IC50 waarden hebben betrekking op de concentratie van MHC en controle peptiden. Onder de BLA peptide test set, de hoogst gerangschikte ProPred epitoop exposeerde de sterkste binding aan recombinant DRB1 * 1501. Ook alle andere voorspelde epitoop bindmiddelen vertoonde matige tot hoge affiniteiten MHC II. Zoals verwacht,synthetische peptiden die overlappen voorspelde bindende epitopen en bindende epitopen bleken MHC II in alle gevallen binden. Peptide 31, waarbij twee van de laagste overspande gerangschikt voorspelde epitopen, bleek de zwakste MHC bindmiddel. Peptide 24 werd echter gevonden dat MHC binden met matige affiniteit hoewel het alleen zeer volgorde bestanddeel epitoop (epitoop 24) niet een voorspelde bindmiddel bij de 5%-drempel. Interessant epitoop 24 werd geïdentificeerd in een vorige studie gericht op deimmunizing BLA 10. In deze experimenten, synthetisch peptide 24 werd aangetoond dat het zeer immunogeen in menselijke PBMC assays. Dus in dit geval, onze MHC II bindingsassay bleek voorspellend te immunogeniciteit terwijl ProPred niet. In totaal de resultaten tonen het nut van computationele voorspellingen in het begeleiden van onderzoekers naar waarschijnlijk immunogene epitopen, maar zij onderstrepen ook het belang van hoge doorvoer experimentele methoden als een integraal onderdeel vanhet eiwit / vaccin ontwerpproces.

Belangrijk is dat deze 384-well experimenteel ontwerp is zeer parallel verlopende en maakt grondige analyse van tot 15 peptiden en een MHC allel per 384-well ELISA-plaat. Met behulp van een enkele liquid handling robot, deze methode kan een onderzoeker tot negentig testpeptiden tegen vier MHC II allel typen in minder dan 48 uur te analyseren. Dit ontwerp omvat acht verschillende test-peptide concentraties en drievoud meting bij elke concentratie. Daarom wordt de gebruiker gewaarborgd robuuste en reproduceerbare kwantitatieve resultaten. Anderen werken op het gebied van therapeutische eiwitten of vaccin ontwerp en ontwikkeling vinden dit protocol om nuttig zijn in hun werk te vergemakkelijken met het eiwit deimmunization of immunogeniciteit analyse.

Citraatfosfaatbuffer (22,2 mM citroenzuur, 55,6 mM Dibasische Na 2 HPO 4, pH 5,4)
222 ml 0,1 M citroenzuur
278 ml 0,2 M dibasisch Na 2 HPO 4
500 ml MilliQ H2O
Meng citroenzuur, natriumfosfaat en 450 ml MilliQ H2O Breng de pH tot 5,4 en QS tot 1 L.
Deze oplossing is stabiel bij kamertemperatuur.
Binding Reaction Buffer
Citraat fosfaatbuffer, pH 5,4 met 2% v / v 1 mM Pefabloc
1,5% w / v Octyl-β-D-glucopyranaside
Gebruik meteen.
1 mM Pefabloc
1 ml MilliQ H2O
25 mg Pefabloc SC (poeder)
Maak porties en bewaar bij -20 ˚ C.
Boraatbuffer Formula (12,5 mM Natriumtetraboraatdecahydraat, pH 8,2)
1,19 g natrium decahydraat (Sigma)
250 ml MilliQ H2O
Los natriumsulfaat decahydraat in 225 ml MilliQ H2O Breng de pH op 8,2 en qs tot 250 ml.
Deze oplossing is stabiel bij kamertemperatuur.
PBS-Tween (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2PO 4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% Tween, pH 7.4)
4,5 L MilliQ H 2 O 500 ml 10x Dulbecco's PBS (DPBS)
2,5 ml Tween 20
Deze oplossing is stabiel bij kamertemperatuur.
Neutralisatie Buffer (50 mM Trizma HCl, pH 8,0)
475 ml MilliQ H2O
25 ml 1 M Trizma HCl
Meng en breng de pH op 8,0
Deze oplossing is stabiel bij 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Leonard Moise is in dienst van en houdt aandelenopties in EpiVax, Inc, een particulier biotechnologiebedrijf gevestigd in Providence, RI. De werkzaamheden in dit onderzoeksrapport is vrij van vooroordeel dat kan worden geassocieerd met de commerciële doelstellingen van het bedrijf.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01-GM-098977 en R21-AI-098122 naar CBK en KEG. RSS werd mede ondersteund door een Luce Foundation Fellowship en voor een deel door een Thayer Innovation Program Fellowship van de Thayer School of Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Tags

Biochemie Immunoassay Protein immunogeniciteit MHC II T-cel epitoop High Throughput Screen Deimmunization Vaccine Ontwerp

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L.,… More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter