Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 'نهاية الشق من قبل مرنا ركائز Published: May 3, 2014 doi: 10.3791/51309
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

Summary

الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني يجمع على الحمض النووي الريبي السلائف الذي يمتد إلى ما بعد نهاية 3 'من مرنا ناضجة. يتم إنشاء نهاية الحمض النووي الريبي ناضجة cotranscriptionally، في موقع تمليها تسلسل الحمض النووي الريبي، عن طريق النشاط نوكلياز داخلية للمجمع الانقسام. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة لدراسة تفاعلات الانقسام في المختبر.

Abstract

لم يتم تشكيل 3 'نهاية mRNAs والثدييات عن طريق إنهاء المفاجئ من النسخ عن طريق الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (RNPII). بدلا من ذلك، RNPII يجمع السلائف مرنا بعد نهاية الرنا ناضجة، ومطلوب عملية نشطة من النشاط نوكلياز داخلية في موقع معين. الانقسام من الحمض النووي الريبي السلائف يحدث عادة 10-30 الإقليم الشمالي المصب من موقع بوليا الآراء (AAUAAA) بعد dinucleotides CA. البروتينات المعقدة من الانقسام، وهو بروتين معقد سياقاتها حوالي 800 كيلو دالتون، إنجاز هذا النشاط نوكلياز محددة. تسلسل الحمض النووي الريبي محددة المنبع والمصب من موقع بوليا السيطرة على تجنيد مجمع الانقسام. مباشرة بعد الانقسام، ومذيل بعديد الأدينيلات mRNAs وقبل من قبل البلمرة بوليا (PAP) لإنتاج تنضج الرسائل RNA مستقرة.

تجهيز 3 'نهاية محضر RNA يمكن دراستها باستخدام مقتطفات النووية الخلوية مع ركائز محددة RNA رديولبلد. في خلاصة القول، منذ فترة طويلة 32 </ سوب> وحضنت ف المسمى uncleaved السلائف الحمض النووي الريبي مع مقتطفات النووي في المختبر، ويتم تقييم الانقسام من قبل الكهربائي هلام وتصوير الإشعاع الذاتي. عند حدوث الانقسام السليم، وهو أقصر 5 'المشقوق تم الكشف عن المنتج وكميا. هنا، نحن تصف مقايسة الانقسام في التفاصيل باستخدام، على سبيل المثال، وتجهيز 3 'نهاية HIV-1 mRNAs و.

Introduction

التركيب الحيوي لمعظم الرنا رسالة حقيقية النواة ناضجة (mRNAs و) يتطلب العديد من التعديلات بعد النسخي مثل السد، والربط تذييل بعديد الأدينيلات. تقترن هذه التعديلات بشكل عام لضمان المعالجة الصحيحة 1 وزيادة بقوة استقرار مرنا.

"يتم إنشاء تشكيل نهاية الثدييات ما قبل mRNAs والتي تشطر endonucleolytic من الحمض النووي الريبي الوليدة تليها إضافة مخلفات محلقة إلى 5 '3 المشقوق المنتج من قبل بولي (A) البلمرة (PAP) 2-4. في الثدييات، ويتم إنجاز الانقسام من قبل بروتين معقد متعدد المكونات، ما يقرب من 800 كيلو دالتون، والتي تجمع على تسلسل الحمض النووي الريبي محددة مسبقا. بولي (A) تسلسل إشارة، وهو AAUAAA تسلسل hexanucleotide الكنسي حفظا للغاية، يوجه موقع انشقاق في حوالي 10-30 الإقليم الشمالي المصب. ومن المسلم به في هذا الموقع تحديدا من قبل عامل انشقاق وتذييل بعديد الأدينيلات خصوصية (CPSF) و73 دينار كويتي الوحيدات منيحتوي CSPF النشاط نوكلياز داخلية. عامل تحفيز الانقسام (CstF) يربط أكثر المنحطة تسلسل عنصر GU-U أو الغنية المصب من بولي (أ) موقع. مطلوب أيضا للانشقاق هو العامل الانقسام الثدييات الأول (CFIm)، وعامل الانقسام الثدييات الثاني (CFII). CFIm يربط UGUA (N) مواقع محددة في تسلسل العناصر المنبع (يستخدم) التي تم تعريفها لعدد من الجينات، ويبدو أن تشارك في العمليات الفسيولوجية الهامة 5-8.

في المختبر، ويتم تحليل ردود الفعل معالجة RNA عادة عن طريق استخدام الحمض النووي الريبي ركائز رديولبلد 9-12. هذه يمكن توليفها من قبل النسخ جولة الاعادة من المروج T7 عاثية أو SP6. عند دراسة موقع تذييل بعديد الأدينيلات التي لم تتميز من قبل، فمن الضروري استخدام الحمض النووي الجيني بدلا من [كدنا] لتوليد الركيزة الحمض النووي الريبي، وتسلسل المصب هامة قد لا تكون موجودة في كدنا]. ركائز التصميم لتشمل ما لا يقل عن 150 الإقليم الشمالي upstreaم و 50 الإقليم الشمالي المصب من موقع الانقسام / نهاية على مرنا ناضجة. المنتج الانقسام يهاجر أسرع من الركيزة؛ ومع ذلك، لأنه قد تكون ولدت شظايا الآخرين من خلال العمل نوكلياز غير محددة، وخصوصية رد فعل لابد من التحقق من اعتمادها على الصحيح تسلسل معالجة الإشارات. وبالتالي، ركائز RNA مع طفرة نقطة في التسلسل AAUAAA (على سبيل المثال AAGAAA) بمثابة سيطرة سلبية للتفاعل الانقسام.

بالنظر إلى أن كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي رديولبلد يستخدم للتفاعلات الانقسام، يمكن RNases الحاضر في وفرة عالية في معظم مقتطفات النووية أن يكون مشكلة، وتحد من اختيار المواد انطلاق لإعداد استخراج. خلايا هيلا تميل إلى تحتوي على مستويات منخفضة من RNases الذاتية، وبالتالي أداء جيدا في هذه المقايسات.

يتبع الانقسام endonucleolytic من ركائز الحمض النووي الريبي في الجسم الحي في المختبر وعلى الفور من قبل بولي (A) بالإضافة إلى ذلك، خميسق المشقوق وسيطة غير موجود بكميات كشفها. لذلك، إما لدراسة تسلسل الحمض النووي الريبي محددة أو البروتينات المشاركة في رد فعل الانقسام، وتتم التجارب في ظروف منع تذييل بعديد الأدينيلات من الحدوث. ليس هناك من الانقسام الاعتماد على تذييل بعديد الأدينيلات، أو العكس، لذلك يمكن للمرء أن يتوقف تذييل بعديد الأدينيلات دون الإضرار رد فعل الانقسام. وبالتالي، يتم استبدال ATP مع سلسلة إنهاء التماثلية التي تفتقر 3 'مجموعة الهيدروكسيل بحيث يمكن إدراجها سوى النوكليوتيدات واحد في بولي (أ) موقع، ويمكن أن يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي فقط المشقوق.

نظرا لتعقيد ودرجة عالية من خصوصية هذا النوع من الفحص، ونحن تصف بروتوكول الفيديو مفصلة لدراسة الانقسام endonucleolytic من الانقسام / بولي (A) آلات السلائف مرنا في المختبر. ونحن تصف كيفية إعداد مقتطفات النووية المختصة، وتوليد ركائز RNA رديولبلد، تنفيذ رد فعل الانقسام، وتحليل وتفسير النتيجةمنتجات جي. ويبين الشكل 1 مثالا على الرنا الركيزة ترميز ل3 'نهاية HIV-1 قبل mRNAs والتي ستستخدم لفحص الانقسام. ويتألف نهاية 3 'من الحمض النووي الريبي الجينوم فيروس نقص المناعة البشرية من العديد من متواليات التنظيمية الهامة مثل بولي (A) موقع، وهي منطقة غنية G+ U، وعنصر USE، والتي هي كل ما يلزم لنضج كفاءة من النصوص مرنا الفيروسية 13 . في هذا المثال فإننا نتوقع الحمض النووي الريبي الركيزة المدخلات لتكون 338 الإقليم الشمالي والإقليم الشمالي على انشقاق 237. إذا سمح تذييل بعديد الأدينيلات أن يحدث، مسحة من المنتجات سيتم ملاحظتها بين 237 و 437 الإقليم الشمالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التكيف من خلايا منتسب في التعليق

(وهذا هو خطوة اختيارية. خلايا تعليق تجعل عموما مقتطفات النووية على نحو أفضل، ولكن الخلايا المزروعة في لوحات يمكن أن تستخدم أيضا.)

  1. التكيف مع الخلايا الملتصقة للنمو في التعليق باستخدام MEM Joklik لتعديل تستكمل مع 5-10٪ مصل العجل الوليد أو مصل بقري جنيني و 1٪ L-الجلوتامين: البنسلين الستربتوميسين. نشر الخلايا في قوارير الدوار مع غطاء مرشح على 37 درجة مئوية مع 8٪ CO 2.
  2. عندما التكيف مع الخلايا، وتبدأ مع 100 مل في قارورة 500 مل الدوار. الحفاظ على الحد الأدنى من 0.3 × 10 6 خلية / مل واستبدال المتوسط ​​كل 1-2 أيام حتى يتم تحقيق معدل نمو السليم (عادة 2-6 أسابيع). مرة واحدة تكييفها، يجب خلايا هيلا في التعليق يتضاعف تقريبا كل 24 ساعة ملاحظة: خلال مرحلة التكيف، وسوف يستغرق بعض الوقت للحصول على الخلايا للعودة إلى مضاعفة معدل العادية.
  3. الحفاظ على خلايا في دنSITY من 0،5-0،8 × 10 6 خلية / مل في الحجم النهائي المطلوب (عادة 1-10 L)
  4. وعادة ما يتم حصاد الخلايا في مرحلة منتصف سجل (حوالي 0،5 حتي 0،65 × 10 6 خلية / مل و> 90٪ قابلة للحياة). استخدام الدوار قارورة الحجم المناسب للمبلغ المطلوب من وسائل الإعلام الثقافة.

2. مقتطفات النووية

  1. العازلة وإعداد الكاشف
    ملاحظة: يتم تنفيذ الاستخراج بعد تعديل Dignam وآخرون (1983) 14 إجراءات استخراج النووية.
    1. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة 1X، العازلة A، C العازلة، والعازلة D (الجدول 1) قبل الشروع في عمليات الاستخراج وتخزينها في 4 درجات مئوية اليوم
      ملاحظة: يتم تحقيق عوائد العالي عموما مع الطازجة العازلة؛ ومع ذلك، فإن المخزن المؤقت مستقرة لعدة أسابيع. من المهم أن جميع مخازن والأجهزة والمعدات وتبريده قبل وأبقى الباردة لمجمل عمليات الاستخراج.استخدام غرفة باردة للعديد من الخطوات الممكنة و / أو إبقاء كل شيء على الجليد. إضافة DTT وPMSF فورا قبل الاستخدام.
  2. جمع وغسل خلايا
    1. صب الخلايا إلى أربع زجاجات 250 مل المخروطية وتدور في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي مع يتأرجح أو الدوار زاوية ثابتة. supernatants صب وإضافة 250 مل خلية ثقافة وسيلة أخرى لكل زجاجة. تكرار يدور حتى يتم مكعبات جميع الخلايا.
    2. في resuspend الكريات النهائية جنبا إلى جنب في ما مجموعه 250 مل من الجليد الباردة PBS وتجمع في واحدة 250 مل زجاجة المخروطية. تدور الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الدلو المتأرجح.
    3. تخلصي من طاف و resuspend الخلية بيليه في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة وبالتالي فإن إجمالي حجم لا يتجاوز 50 مل. تخفيف بيليه عبر pipetting لونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل المخروطية.
    4. تدور الخلايا مرة أخرى في 500 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الدلو المتأرجح. تخلصي supernatanر والتقدير ونلاحظ حجم الخلية بيليه (CPV) بأكبر قدر ممكن. استخدام الماء في أنبوب مطابقة منفصلة، ​​للمقارنة، إذا كان بيليه هو أقل من حجم علامات على الأنبوب.
  3. تحلل الخلية
    1. إضافة إلى DTT العازلة A. Resuspend وبيليه في المخزن A باستخدام 5 مجلدات من CPV المقدرة. ماصة لتفريق بيليه واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    2. تدور الخلايا في 931 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الدلو المتأرجح.
    3. نضح بعناية طاف بدلا من الصب. حجم بيليه يجب زادت حوالي اثنين أضعاف في حجم بسبب تورم الخلايا.
    4. إضافة 1 CPV من العازلة ألف إلى الخلايا. كسر بلطف صعودا بيليه وإزالة قسامة صغيرة (حوالي 50 ميكرولتر) إلى أنبوب microfuge على الجليد. نقل الخلايا إلى معلق بحجم مناسب الخالط Dounce (عادة 15 مل حجم) المبردة على الجليد.
    5. ليز الخلايا مع 12-15 السكتات الدماغية بطيئة ولكنها ثابتة من نوع B (القصباتحزب التحرير) مدقة. إزالة قسامة صغيرة من المحللة وفحص تحت المجهر للتحلل الكامل (نواة صغيرة مظلمة سليمة مقارنة مع الخلايا تورم) من خلال تلطيخ التريبان الأزرق. خلايا سليمة سوف تكون واضحة). تواصل homogenation حتى يتم تحقيق 90٪ تحلل ونتوقف هنا، على douncing قد تؤثر سلبا على نوعية مقتطفات النووية.
    6. نقل المحللة في أنابيب نابذة فائقة السرعة ultraclear ونلاحظ حجم التداول الكلي. التوازن عن طريق وزن الأنابيب وتدور في 1،069 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم استخدام نابذة فائقة السرعة في هذه الخطوة على الرغم من انخفاض سرعة الدوران لأنه سيتم نسج نفس الأنبوب في سرعة أعلى في الخطوة التالية. وهذا تدور تسفر عن ضيق إلى حد ما بيليه تغطي الجزء السفلي من أنبوب مع طاف غيما أعلاه، والتي يمكن جمعها واستخدامها لمقتطفات S100 عصاري خلوي. إذا كان هناك طبقة الدهون مرئية على الجزء العلوي من الأنبوب، ويمكن إزالتها.
    7. إزالة بعناية طاف مع ماصة وتحويلها إلى عنوت. إيه أنبوب تجنب تعكير صفو بيليه النووي ملاحظة: وسيكون من المهم أن نعرف الحجم النهائي من طاف من أجل تحديد حجم معبأة النووية (PNV).
  4. إعداد مستخلصات النووية
    1. مرة واحدة تمت إزالة طاف بعناية، respin الخام استخراج النووية بيليه في 25453 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في نفس الأنبوب.
    2. إزالة طاف المتبقية (يجب أن تكون كمية صغيرة من السائل واضح) وإضافته إلى جمع طاف السابقة. قياس الحجم النهائي من طاف. حساب PNV بطرح هذا الحجم من الحجم الكلي للالمحللة الأصلي لوحظ سابقا. بدلا من ذلك، إذا كان بيليه هو كبير بما فيه الكفاية، حجمه يمكن تقديرها من خلال مقارنة مع حجم مماثل من الماء في أنبوب متطابقة.
    3. إضافة 1 حجم PNV من العازلة C (حوالي 1 مل / مل من الخلايا). طرد بعناية بيليه مع طرف ماصة ونقل إلى الاشتراكية على نحو ملائمزيد الخالط Dounce. إذا باستخدام نفس الخالط كما كان من قبل، prerinse الخالط مع الماء منزوع الأيونات معقمة.
    4. resuspend الكرية مع ~ 5-10 السكتات الدماغية عن طريق الخالط Dounce باستخدام مدقة ضيقة.
    5. نقل المحللة النووية المتجانس في أنبوب المبردة وتخلط بواسطة قلب لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. وإذا كان حجم كبير بما فيه الكفاية، تستنهض الهمم باستخدام لوحة تحريك مغناطيسي وشريط زيادة ونقصان.
    6. نقل المحللة في أنبوب الطرد المركزي ultraclear جديدة وتدور في 25453 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. يجب أن يكون بيليه المضغوط. حوالي 5 دقائق قبل اكتمال تدور، هيدرات أشرطة غسيل الكلى أو الأنابيب التي لها وزن جزيئي المناسبة بقطع (MWCO) (على سبيل المثال 7،000 كيلو دالتون).
    7. إزالة طاف (استخراج النووية) من أنبوب إلى أنبوب مخروطي المبردة باستخدام ماصة نقل ثم المضي قدما في غسيل الكلى.
  5. غسيل الكلى
    1. حقن مستخلصات إلى أشرطة غسيل الكلى رطب حسب الشركة المصنعةق التعليمات وdialyze مقتطفات النووية في 500 مل من العازلة D 50 لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية مع التحريك.
    2. استبدال العازلة مع 500 مل الطازجة، الجليد الباردة العازلة D 50 و dialyze ل4 ساعة إضافية في 4 درجات مئوية. ويمكن تقسيم هذه الخطوة 4 ساعة في تغييرين 2 ساعة بدلا من ذلك.
    3. إزالة مقتطفات من كاسيت لغسيل الكلى ونقل إلى أنابيب مبردة. تدور مقتطفات لمدة 5 دقائق عند 1،500 XG في 4 درجات مئوية.
    4. قسامة مقتطفات في المبرد، وأنابيب إيبندورف والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل (50-100 ميكرولتر لكل قسامة). المحل في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

3. دقق RNA التجميعي

  1. إعداد قالب
    ملاحظة: قوالب تستخدم في النسخ قد تكون شظايا PCR أو البلازميدات التي تحتوي على T7 أو SP6 المروج المنبع وعلى الفور المتاخمة للتسلسل التحقيق المطلوب. يجب خطي قوالب البلازميد المصب من تسلسل قالب من كثافة العملياتerest. لاحظنا عائدات أعلى من قوالب PCR.
    1. يمكن إدراج المروج T7/SP6 خلال تفاعل PCR. تصميم التمهيدي الشعور مع T7/SP6 مروج المنبع من تسلسل الهدف.
    2. تضخيم التسلسل المطلوب في 2-3 ردود الفعل في قالب عبر PCR فقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام البلمرة عالية الدقة.
    3. الجمع بين ردود الفعل ما يعادلها وتنقية من قبل استخراج الهلام.
    4. تسلسل المنتجات PCR للتحقق من دقة القالب. (اختياري)
  2. RNA النسخ مع 32 P وصفها
    1. أداء في النسخ المختبر من 1 ميكروغرام من القالب مع مجموعة المتاحة تجاريا والتي تتوافق مع المروج (SP6 أو T7) مع إجراء التعديلات التالية. استخدام 1 ميكرولتر من الطازجة 3،000 تسى / ملمول [α-32 P] UTP، 0.5 ميكرولتر من 10 ملي UTP الباردة، 0.1 ميكرولتر من 10 ملي GTP، و 0.9 ميكرولتر من 10 ملي m7G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') G RNA قبعة في ما مجموعه الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: إن G-غطاء يحسن استقرار النصوص الحمض النووي الريبي في مقتطفات النووية (الحد الأقصى: GTP) نسبة 10:01. يتم إضافة UTP الباردة لمنع 32 P-UTP عن كونها كاشف الحد.
    2. توليف الحمض النووي الريبي حجم سلم كما تدل أعلاه دون غطاء G. تتوفر لتوليد حجم الحمض النووي الريبي علامة تجارية القوالب.
    3. احتضان ردود الفعل النسخ عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (للاستخدام SP6 40 ° C). بمجرد الانتهاء، أداء الدناز الهضم من القالب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. بعد الهضم، إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA و 5 ميكرولتر من العازلة تحميل الثاني لركائز الحمض النووي الريبي. إضافة 20 ميكرولتر العازلة التحميل الثاني للعلامة.
    5. تسخين علامة الحمض النووي الريبي وتحقيقات في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم ضع على الجليد.
  3. جل بولي أكريلاميد صب / دقق الكهربائي
    1. تحضير 1 لتر من 6٪ هلام بولي أكريلاميد (PAGE) مزيج و 400 مل من 10٪ PAGE. لجعل 6٪، وخلط 150 مل من 40٪ 19:01 الأكريلاميد: مكرر لcrylamide مع 100 مل من 10X تريس / البورات / EDTA (TBE) و 460 غرام اليوريا. تجلب ما يصل الى 800 مل مع الماء منزوع الأيونات معقمة ويقلب على موقد أثناء تطبيق حرارة منخفضة (حوالي 50-80 درجة مئوية). استكمال ل1 لتر مع الماء منزوع الأيونات.
      ملاحظة: إن رد فعل ماص للحرارة. التدفئة يعزز الانحلالية من اليوريا. إزالة من الحرارة حالما يتم حل اليوريا وتقديم حل ل1 لتر مع الماء منزوع الأيونات. بدلا من ذلك إثارة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها؛ يمكن أن الكثير من الحرارة بدء البلمرة.
    2. حماية PAGE مزيج من الضوء بورق الألمنيوم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. يمزج PAGE يمكن أن تكون على استعداد في وقت سابق ومستقرة لعدة أشهر.
    3. إعداد 400 مل من 10٪ مزيج PAGE من خلال الجمع بين 100 مل من 40٪ 19:01 الأكريلاميد: مكرر الأكريلاميد، 40 مل من 10X TBE و184 ز اليوريا. بعد أن يذوب اليوريا، وجلب ما يصل الى 400 مل مع الماء منزوع الأيونات.
      بدلا من ذلك، وإعداد 20٪ 19:01 حل الأكريلاميد و0٪ محلول مادة الأكريلاميد وايال العازلة واليوريا فقط؛ هذه يمكن أن تكون مختلطة ثم في أي نسبة لإعطاء أي نسبة بين 0 و 20٪؛ اليوريا هو دائما بطيئة في حل.
    4. إعداد 10-50 مل من فوق كبريتات الأمونيوم 10٪ (APS) حل في الماء منزوع الأيونات معقمة اعتمادا على عدد من المواد الهلامية ليتم الإدلاء بها.
    5. غسل 20 سم × 22 سم هلام لوحات الزجاج مع الايثانول 70٪ (ETOH). تجف مع شعر حر مناديل كبيرة.
    6. غسل لوحة منتظمة مع 1 مل من 5 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) ثم rewash مع 70٪ ETOH. معطف لوحة حقق مع الحل هلام صد siliconizing بواسطة مسح لوحة مع Kimwipe الصغيرة المشبعة.
    7. تجميع لوحات من خلال وضع لوحة العادية على ماصة فارغة مربع تلميح أو قطعة من الستايروفوم إلى الارتقاء به من الجدول مع الجانب تنظيفها مواجهة. وضع 0.4 ملم الفواصل على حافة كل جانب طويلة.
    8. وضع بعناية لوحة حقق خلال الفواصل بحيث الجانب المغلفة سيكون في الداخل من هلام. استخدام الحلاقة أو غيرها من أداة رقيقة للتحولالفواصل لمحاذاة دافق في أسفل وجوانب من لوحات هلام ثم تأمين مع مقاطع الموثق على كل جانب من لوحات هلام خلال الفواصل.
    9. إعداد 30 مل من 8٪ مزيج PAGE في جل عن طريق خلط 15 مل من 10٪ و 6٪ يمزج كل في أنبوب 50 مل. بسرعة إضافة 300 ميكرولتر من 10٪ APS تليها 30 ميكرولتر من N، N، N '، N'-رباعي methylethylenediamine (TEMED) إلى مزيج هلام 8٪.
      ملاحظة: يجب أن يتم تحديد النسب المئوية هلام مناسبة لأحجام التحقيق الفردية من قبل المجرب.
    10. قبعة و 2x قلب وتصب الحل في المنطقة حقق لوحات هلام. تأكد من رفع قليلا لوحات من جهة، والحفاظ حتى صب حتى يبدأ المزيج PAGE بالتنقيط للخروج من القاع.
    11. خفض وحات يعود إلى مستوى وتضاف فورا كبيرة 8 جيدا المستطيل مشط ل0.4 ملم × 20 سم هلام. سوف فقاعات صغيرة بالقرب من أسفل لا تؤثر على التوالي، ولكن ينبغي ألا يكون هناك فقاعات في الآبار.
      ملاحظة: </ قوي> مكان المناشف الورقية في الجدول أدناه الجزء السفلي والعلوي من هلام لالتقاط أي تسرب أثناء صب.
    12. السماح للمزيج PAGE لتتبلمر لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    13. نقل الجل بلمرة إلى الغرفة الباردة وتجميع الأجهزة الكهربائي. إضافة العازلة TBE الباردة إلى خطوط التعبئة على الغرف العلوية والسفلية.
    14. إزالة المشط واستخدام شفرة حلاقة لإزالة أي حطام. تعيين الجل في الجهاز واستخدام مقطع الموثق لعقد لوحة لختم. إضافة TBE الباردة إلى غرفة أعلى حتى ان تصب لوحات.
    15. غسل الآبار مع 30 مل syringe/21 G 1-1/2 "إبرة مليئة TBE الباردة فقط قبل تحميل ركائز الحمض النووي الريبي المسمى. وضع لوحة الألومنيوم إلى الجزء الخلفي من الزجاج للمساعدة في توزيع الحرارة حتى أثناء التشغيل.
    16. تحميل 3 ميكرولتر من علامة وكامل 25 ميكرولتر رد فعل النسخ من كل الركيزة الحمض النووي الريبي في آبار منفصلة. ترك جيدا بين النصوص ذات الحجم المماثل عrevent التلوث المتبادل. برموفينول الأصباغ زرقة السيانول والزيلين في المخزن المؤقت التحميل يمكن استخدامها لتقدير حجم الهجرة على هلام.
    17. تشغيل هلام في القوة الكهربائية المناسبة المستمر لحجم تحقيقات الحمض النووي الريبي (مثلا 25 واط لمدة 2 ساعة للتحقيقات من 600 الإقليم الشمالي).
  4. وصفت استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية
    1. التالي الكهربائي، واستنزاف بعناية غرفة العلوي من الجهاز هلام. فإن معظم النشاط الإشعاعي يكون في هلام وغرفة أسفل؛ ومع ذلك، قد يحتوي على بعض المواد العازلة العليا المشعة.
    2. استخدام الدرج لنقل الجل إذا الانتقال إلى منطقة عمل المواد المشعة آخر. إزالة بعناية الفواصل عن طريق سحب قطعة جاحظ جانبية بعيدا عن هلام.
    3. فصل بلطف لوحات. هلام يجب التمسك وحة التي لم siliconized. وضع قطعة من الاغطية البلاستيكية على هلام والزجاج لوحة.
    4. وضع glogos autorad علامة ملصقا على البلاستيك التفاف على مدى لهي(أ) من هلام هذا واضح من أي عينات.
    5. في غرفة مظلمة، ووضع قطعة من فيلم تصوير الإشعاع الذاتي على لوحة كاملة وفضح لا يقل عن 1 دقيقة. تطوير الفيلم.
    6. وضع الفيلم وضعت على سطح الخفيفة. ثم ضع الجانب البلاستيك من هلام وجهه لأسفل على الفيلم ومحاذاة علامة autorad من الجل على علامة يتعرض على الفيلم. مرة واحدة الانحياز، استخدم علامة سوداء للاحتفال موقع نطاقات المطلوب على الزجاج.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، قم بمحاذاة المواد الهلامية / الفيلم بالطريقة التالية لقطع العصابات الحمض النووي الريبي. في غرفة مظلمة، ووضع جل ملفوفة على الطاولة، ووضع الفيلم على أعلى من ذلك ووضع كاسيت (أو الكتاب، الخ) على رأس قطعة من الفيلم. نفض الغبار على مفتاح الضوء في الغرفة لفترة وجيزة، ثم تتحول في حالة الخروج. هذا سوف 'بريفلاش' الفيلم توليد مخطط من جميع الآبار على الفيلم بسبب الضغط / الحماية من الضوء الذي الكاسيت على رأس يقدمها. هذا يجعل من السهل لمحاذاة الفيلم على هلام وقطعمن الفرقة دون استخدام علامات الفلورسنت.
    7. إزالة بعناية الاغطية البلاستيكية واستخدام مشرط أو شفرة حلاقة جديدة لكل الركيزة الحمض النووي الريبي واستئصال العصابات من الجل ومكان في منفصلة 1.7 مل أنابيب microfuge. استخدام nutator لطيف خلال الثورات شطف.
    8. إضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي شطف العازلة (0.5 M خلات الأمونيوم، 10 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA، 0.2٪ SDS) لكل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ليغرق جزء هلام. يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 3-16 ساعة تبعا لحجم التحقيق.
    9. نقل كامل 500 ميكرولتر من المواد مزال في أنبوب جديد. تجنب نقل أي قطعة هلام لأنها سوف تتداخل مع تنقية. إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين (20 ملغ / مل) مع 500 ميكرولتر من البرد، حمضية الفينول كلوروفورم (لRNA).
    10. لفترة وجيزة الدوامة، يجب أن يظهر الحل غائم. تدور في درجة حرارة الغرفة في سرعة قصوى (~ 16،000 x ج) لمدة 5-6 دقيقة.
    11. عبر بعنايةفر الأعلى (مائي) طبقة جديدة لأنابيب جمع أكبر قدر ممكن مع تجنب أي حطام من الطور البيني. إضافة مبلغ مساو من الكلوروفورم إلى الطبقة المائية نقلها. كرر الخطوة 3.4.10 ونقل العلوي (مائي) طبقة لأنبوب جديد. إضافة 1 مل من الجليد الباردة 95-100٪ ETOH إلى المواد التي تم جمعها. احتضان عند -80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ملاحظة: إن الحمض النووي الريبي يمكن تخزينها بين عشية وضحاها اذا شئت.
    12. بيليه الحمض النووي الريبي لمدة 30 دقيقة في 16،000 XG في 4 درجات مئوية. صب بعناية قبالة طاف في حاوية النفايات المشعة وإضافة 1 مل من الصف الجزيئية الجليد الباردة ETOH 70٪ لكل بيليه.
    13. بيليه الحمض النووي الريبي في 16،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتصب قبالة طاف، وتدور مرة أخرى لمدة 1 دقيقة وإزالة أي ETOH المتبقية عن طريق ماصة وترك في درجة حرارة الغرفة مع قبعات مفتوحة للسماح للتبخر في أي ETOH المتبقية.
    14. resuspend والكريات في 20-30 ميكرولتر من الماء الخالي من ريبونوكلياز. قد يتم تخزين الحمض النووي الريبي المسمى في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب استخدام المسح متر المشعة في جميع أنحاء الداخلي استخراج كامل للتحقق من أن الحمض النووي الريبي وصفت لم تغب خلال أي خطوة.
  5. الكميات من الحمض النووي الريبي وصفت لتفاعل ما قبل مرنا 3 'مرنا الشق
    1. تقريب المولية من ركائز الانقسام باستخدام الإجراء التالي.
      1. خذ على سبيل المثال، 1 ميكرولتر من 3،000 تسى / ملمول [α-32 P] UTP وزارة التجارة والصناعة 10 / مل. (في التاريخ المرجعي التسمية، والتركيز الكيميائي لهذا الحل الأسهم سيكون 3.3 ميكرومتر UTP. قبل ذلك التاريخ هو أعلى ونصف حياة واحدة (~ 13 يوما) من تاريخ ذلك هو ~ 1.6 ملم، الخ) والمسمى مساهمة UTP إلى تركيز النهائي رد فعل لا يكاد يذكر عادة عند استخدام تركيز UTP الباردة النهائية فوق UTP K م. وT7 RNAP K م للUTP هو 114 ملم 15.
      2. تمييع ميكرولتر 1 في 39 ميكرولتر من الماء. ثم إضافة 1 ميكرولتر من المخفف [α- (ملاحظة: ليست هناك حاجة السائل التلألؤ في الواقع لهذا النشاط محددة من 32 P كما كيرينكوف العد سيعطي القيم الكلفة لكل ألف موثوقة جدا تحقق من التلألؤ دليل مضاد لاختيار القناة الصحيحة لكيرينكوف العد والعد حجم 1 مل لمدة 1 دقيقة).
    2. تمييع 1 ميكرولتر من كل الركيزة الحمض النووي الريبي المسمى في قوارير منفصلة مع مبلغ مساو من السائل التلألؤ المستخدمة في الخطوة السابقة. تأكد من أن يكون قارورة التلألؤ السائل مع فقط لحساب الخلفية. Quantitate النشاط الإشعاعي في عداد التلألؤ.
    3. تتكاثر التهم لكل دقيقة (CPM) ل[α-32 P] عينة UTP بنسبة 40 إلى عامل في التخفيف الأولية وطرح الخلفية التي حصل عليها السائل التلألؤ وحدها. تتكاثر التهم لكل مسبار الحمض النووي الريبي من كمية المياه ريبونوكلياز خالية (20-30 ميكرولتر) المستخدمة ل resuspend RNA تحقيقات. هذا يعطي مجموع الكلفة لكل ألف من الحمض النووي الريبي المنقى.
      مثال: ماكس الكلفة لكل ألف = (CPM [α-32 P] UTP - الخلفية) × 40 إعتبر RNA نموذج 1 = 20،000 نسخة في الدقيقة × 20 = 400،000 نسخة في الدقيقة (20 ميكرولتر إذا استخدمت لإعادة تعليق)
    4. إذا تم استخدام مبلغ غير 1 ميكرولتر من [α-32 P] UTP لجعل النصوص، ثم عامل هذا الحجم في نسخة في الدقيقة الأخيرة من [α-32 P] UTP بضرب الكلفة لكل ألف ل[α-32 P] عينة UTP من الكمية المستخدمة.
      يستخدم 2 ميكرولتر من [α-32 P] UTP لجعل النصوص: المثال. الاجتماع التحضيري للمؤتمر المحسوبة ل1 ميكرولتر [α-32 P] UTP هو 500،000 نسخة في الدقيقة. تتكاثر 500،000 * 2 = 1،000،000 نسخة في الدقيقة
    5. تقسيم الكلفة لكل ألف حساب المسمى الحمض النووي الريبي من الكلفة لكل ألف حساب ل[α-32 P] UTP وحدها. وهذا تقدير ما يقرب من نسبة UTP المسمى يدمج.
      مثلا: 400،000 / 1،000،000 = 0.40 أو 40٪أدرجت
    6. منذ انزيم لا يمكن التمييز بين النظائر، أدرج نفس النسبة المئوية من وصفت وغير المسماة UTP في الحمض النووي الريبي خلال النسخ. حساب كمية UTP الباردة في الشامات التي يتم إضافتها إلى رد فعل النسخ (0.5 ميكرولتر من حل 10 ملم = 5.0 × 10 -9 مولات UTP).
    7. مضاعفة UTP الشامات في رد فعل من قبل في المئة أدرجت (المعروف من UTP الساخنة عد أعلاه)، ثم تقسيم هذا من قبل عدد من uridines في تسلسل الحمض النووي الريبي.
      مثلا: 5.0 × 10 -9 مولات UTP 0.40 س = 2 × 10 -9 الشامات UTP
      2 × 10 -9 الشامات UTP / 73 U في نص = 2.7 × 10 -11 مول من الحمض النووي الريبي
    8. تحويل مولات الحمض النووي الريبي لالمولية بقسمة حجم الحل RNA إعادة تعليق استردادها.
      مثلا: 2.7 × 10 -11 مول من الحمض النووي الريبي / 20 ميكرولتر = 1،370 نانومتر الحمض النووي الريبي. للمحاضر T7 RNAP مصنوعة من حوالي 1 ميكروغرام الخطيةأوتوماتيكية البلازميد ومعلق في 20 ميكرولتر المياه، والقيم بين 200 و 1،400 نانومتر هي نموذجية.
      ملاحظة: يتم استخدام التركيز المولي من الحمض النووي الريبي للتأكد من أن ما قبل مرنا تركيز الركيزة النهائية في رد فعل الانقسام في المختبر أقل من 5 نانومتر في رد فعل الانقسام. انشقاق يمكن أن تقلل كفاءة إذا تم رفع تركيز الحمض النووي الريبي أعلى بكثير 5 نانومتر.

4. 3 'مرنا الشق رد الفعل

  1. انشقاق رد الفعل الكاشف إعداد
    1. إعداد جميع الكواشف اللازمة للتفاعل الانقسام. جعل 10٪ بولي فينيل الكحول (PVA) بواسطة الماء المغلي وببطء بإضافة المبلغ الصحيح من مسحوق PVA. وسوف يكون 10٪ PVA لزج ويتطلب بعض الوقت لتذوب. تخزينها في درجة حرارة الغرفة أو -20 درجة مئوية.
    2. إعداد 1 M فوسفات الكرياتين (CP) وتخزينها في -80 درجة مئوية. من المهم أن استخدام 1 M CP التي هي أقل من 4 أشهر من العمر.
    3. إعداد 1 M DTT وتخزينفي -20 درجة مئوية. جعل الطازجة 0.2 M DTT التخفيف من 1 M DTT فقط قبل القيام رد فعل الانقسام.
    4. إعداد ETS (انشقاق الحل محطة و): 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.8، 10 ملي EDTA، 0.5٪ SDS. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. انشقاق رد الفعل
    1. تسخين الحمض النووي الريبي المسمى إلى 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم ضع على الجليد.
    2. دوامة بلطف ثم تدور PVA 10٪ في سرعة قصوى لمدة 2-3 دقيقة لإزالة الفقاعات.
    3. مزيج الرئيسي 1: للحصول على رد فعل واحد، والجمع بين 3.125 ميكرولتر 10٪ PVA، 0.625 ميكرولتر 1 M CP، 0.25 ميكرولتر 0.5 M الحمض الريبي النووي النقال، 0.125 ميكرولتر 100 ملي dATP، 0.13 ميكرولتر 40 U / ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 0.25 ميكرولتر 0.1 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8 ، 0.1 ميكرولتر 0.2 M DTT، و0.645 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز. الاستغناء 5.25 ميكرولتر مزيج الرئيسي 1 في أنبوب على الجليد.
    4. مزيج الرئيسي 2: استخدام 6.25 ميكرولتر / رد فعل مقتطفات النووية بتركيزات أعلى من 2 ملغ / مل. يمكن أن تضعف مقتطفات النووية مع العازلة D 50 إذا نيدائرة التنمية الاقتصادية.
    5. الجمع بين 6.25 ميكرولتر من استخراج النووية مع سبق الاستغناء 5.25 ميكرولتر من مزيج الرئيسي 1. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المسمى الركيزة التي يتم تخفيفه إلى 50 نانومتر. بدلا من ذلك، قد يتم تضمين الحمض النووي الريبي في مزيج ماستر 1 شريطة أن يتم إضافته بعد المانع ريبونوكلياز، DTT والحمض الريبي النووي النقال ملاحظة: استخدام <5 نانومتر الركيزة الحمض النووي الريبي المسمى.
    6. دوامة بلطف وتدور كل عينة سريعة لإزالة الفقاعات. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 ساعة، ولكن يجب أن يتم تنفيذ دورة الوقت من أجل تحقيق النتائج المثلى. حضانات أطول قد تزيد تدهور الخلفية.
  3. K بروتين الهضم وتنقية
    1. إزالة عينات من الحرارة وإضافة 182.5 ميكرولتر من الحل ETS توقف إلى كل رد فعل. إضافة 5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل K بروتين واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 حجم (200 ميكرولتر) من حمض الفينول كلوروفورم، وحجم ال 1/10 (20 ميكرولتر) من 3 M الصوديومخلات، و 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الجليكوجين. المضي قدما في عمليات الاستخراج كما هو موضح في أقسام 3.4.9-3.4.14.
    3. بمجرد الانتهاء من استخراج الحمض النووي الريبي، تأكد من إزالة جميع ETOH المتبقية. resuspend الكرية في 8 ميكرولتر من العازلة تحميل (90٪ الفورماميد، 10 ملي EDTA، مع برموفينول الأزرق (BFB) (والزيلين أو زرقة السيانول)). قد يتم تخزين العينات في -80 درجة مئوية أو المضي قدما الكهربائي للهلام.
  4. انشقاق التفاعل الكهربائي
    1. إعداد هلام الأكريلاميد 6٪ كما ذكر سابقا في أقسام 3.3.1-3.3.17 مع بضعة تعديلات. استخدام 20 سم × 42 سم تسلسل لوحات هلام مع 2 لقطات الموثق على كل جانب طويلة. استخدام مشط 32 جيدا وتحضير 40 مل من مزيج هلام.
    2. تحميل هلام مع 3 ميكرولتر من علامة و 5 ميكرولتر من كل عينة. تحسين إعدادات الكهربائي وفقا لمرحلة ما قبل الانقسام والمنتج المشقوق الأحجام.
    3. عند اكتمال الكهربائي، اتبع أقسام 3.4.1-3.4.3 </ strong> لتفكيك هلام. بدلا من التفاف البلاستيك، وقطع قطعة من ورق الترشيح لحجم لوحة هلام وبعناية وضعه على جانب واحد من هلام عرضة للخطر.
    4. اضغط على ورق الترشيح بقوة على الجل، ثم اقلب لوحة بحيث ورقة الترشيح هو في القاع والزجاج هو على القمة. اضغط بحزم الزجاج على الطاولة لضمان أن الجل وتجتاح ورقة الترشيح بالتساوي.
    5. قشر ببطء ورقة الترشيح، والذي يجب أن يكون جل المرتبطة به، من واحدة من نهايات قصيرة حتى يتم إزالة كافة ورقة الترشيح مع هلام المرفق من لوحة من الزجاج.
    6. تغطية الجانب جل يتعرض مع غلاف بلاستيكي. الشريط التفاف البلاستيك على ورقة الترشيح.
    7. وضع الجل على مجفف هلام مع الجانب التصفية التي تواجه الجانب فراغ. الجافة لمدة 15 دقيقة أو حتى هلام جافة تماما.
      ملاحظة: إذا كان مجفف هلام غير متوفرة، فيلم الأشعة السينية يمكن استخدامها لتصور العصابات الحمض النووي الريبي. ينبغي أن يتم التعرض للخروج في lighتي ضيق كاسيت مع شاشة تكثيف في -80 درجة مئوية. يتم تحديد زمن التعرض تجريبيا. الحذر: انخفاض المواد الهلامية في المئة الأكريلاميد قد صدع على التجمد.
    8. قد الجل الآن أن تستخدم لفضح الفيلم أو يتم استخدامها مع الفوسفات لتصوير. وقت التعرض يعتمد على قوة من الحمض النووي الريبي المسمى. في البداية التعرض 24 ساعة يمكن استخدامها. إذا باستخدام الفيلم، تعرض في -80 درجة مئوية مع شاشة تكثيف والسماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة قبل النامية.
    9. قياس النسبة بين الحمض النووي الريبي المشقوق وغير المشقوق في كل عينة ل quantitate كفاءة الانقسام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نتائج ممثل مقايسة تشطر من بولي الحمض النووي الريبي (A) مواقع HIV-1 (الشكل 2). يمكننا أن نلاحظ الركيزة الحمض النووي الريبي uncleaved، وهو أبطأ الفرقة المهاجرة في الجزء العلوي من هلام. المنتج المشقوق محددة هي الأكثر كثافة أقصر الفرقة جزء أن يعمل بشكل أسرع في هلام في الحجم المتوقع، وغير موجودة على وجه التحديد من الفحص الانقسام من mutpoly (A) تحكم يحتوي على طفرة نقطة في التسلسل بوليا (mutPolyA) RNA الركيزة. أحيانا قد يكون لوحظ تدهور المنتجات الركيزة الإدخال. يمكن تحديد الكمي للنشاط الانقسام من قبل مؤامرة الكثافة من نسبة uncleaved إلى RNA المشقوق تطبيع إلى 100٪ من الحمض النووي الريبي uncleaved.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي تصوير لفيروس نقص المناعة البشرية قبلمرنا 3 'ركائز نهاية المعالجة، والمنتجات المتوقعة في المختبر الانقسام وتذييل بعديد الأدينيلات ردود الفعل. موقع الانقسام، وثنائي النوكليوتيد-CA-، وتقع 25 الإقليم الشمالي المصب من AAUAAA موقع بوليا. المناطق LTR: U3 (فريدة من نوعها 3 'تسلسل)، R (تسلسل المتكررة)، وU5 (فريدة من نوعها 5' تسلسل).

الرقم 2
الشكل 2: (أ) بولي (أ) موقع الانقسام. حضنت 32 الرناوات ف المسمى الذي يحتوي على بولي (أ) من HIV-1 وطفرة نقطة من بولي (A) إشارة إلى أن تلغي الانقسام (mutPolyA) في مقتطفات النووية من خلايا هيلا-S3 أو BSA كعنصر تحكم السلبية. السهم يشير إلى الغامق 5 'المشقوق المنتج. في "جزء 3 غالبا ما تنجرف الجل أو غير المتدهورة وغير مرئية دائما. (B) مؤامرة الكثافة من األنشطة الانقسامأعرب تاي كنسبة من uncleaved إلى RNA المشقوق تطبيع إلى 100٪ من الحمض النووي الريبي uncleaved.

العازلة A (100 مل) 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.9)، 1.5 ملي MgCl 2، 10 ملي بوكل، 0.5 ملي dithiothreitol (DTT). إضافة DTT فقط قبل استخدام العازلة A خلال الاستخراج. إضافة 1 ميكرولتر من 1 M DTT لكل 1 مل من العازلة A.
العازلة C (50 مل) 20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.9)، 25٪ (V / V) الجلسرين، 0.42 M كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي MgCl 2، 0.2 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 0.5 ملي DTT، 0.5 ملي phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF). إضافة قرص كوكتيل مثبط البروتياز صباح الاستخراج.
العازلة D 50 (2-4 L) 20 ملي تريس (pH7.9)، 20٪ (V / V) الجلسرين، و 0.2 ملي EDTA، 0.5 ملي DTT، كبريتات الأمونيوم 50 ملم. HEPES KOH-قد تكون بديلا للتريس العازلة A، C و D.
0.5 M خلات الأمونيوم، 10 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA، 0.2٪ من الصوديوم كبريتات دوديسيل (SDS) تخزين في درجة حرارة الغرفة.
توقف مؤقت (ETS) 10 ملي تريس (pH8.0)، 10 ملي EDTA، 0.5٪ SDS تخزين في درجة حرارة الغرفة.
العازلة انشقاق تحميل 90٪ الفورماميد، 5 ملي EDTA pH8، 0.025٪ برموفينول الأزرق المحل في -20 درجة مئوية.

الجدول 1. تكوين مخازن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في المختبر قبل مرنا 3 'انشقاق رد الفعل، التي نفذت في مقتطفات النووية خلية هيلا أو مع عوامل الانقسام مجزأة من هذه المقتطفات، وقد مكن تحديد العوامل الأساسية الانقسام والمجمعات الرئيسية الخاصة بهم 16-21. وقد تم مؤخرا تحديد العديد من البروتينات المرتبطة بهذه العوامل 22، ويمكن أن تستمر في التفاعل في المختبر لتسليط الضوء على كيفية مساهمة هذه البروتينات إلى رد فعل. ربما لأن رد فعل في الجسم الحي يبدو أن cotranscriptional 23، أو بسبب بعض العوامل المساهمة قد تفقد خلال استخراج وغسيل الكلى، وكفاءة في كثير من الأحيان الفقراء، ونادرا ما يتم تحقيق أكثر من 30٪ الانقسام. بالإضافة إلى ذلك، قد تنخفض كفاءة رد الفعل فجأة من يوم لآخر دون سبب واضح. وبالتالي، فمن المهم أن نقدر التي الخطوات هي الأكثر أهمية، وخاصة عند محاولة التكيف مع رد فعل لتعديل أو المصابة فيروسي-هيلا سلليرة سورية، لأنواع الخلايا الأخرى أو إلى ركائز جديدة.

دون شك، ونوعية للاستخراج ونضارة من الحمض النووي الريبي في المختبر كتب لها أهمية قصوى، كما هي الحاجة للعمل تحت ظروف بدقة ريبونوكلياز خالية. صحة الخلايا في الوقت الذي يتم حصادها لاستخراج مهم أيضا. يجب أن تظهر الخلايا السليمة، ينبغي مضاعفة في أقل من 24 ساعة، وينبغي أن يكون في أو الاقتراب من مرحلة منتصف السجل، ويجب أن يكون هناك عدد قليل من الخلايا الميتة أو غيرها من الحطام غير المبررة. من الواضح، لا ينبغي أن تكون ملوثة الخلايا عن طريق الميكوبلازما أو البكتيريا الأخرى. لا ينبغي أن يكون الركيزة عالية جدا مع نشاط معين، وهذا يمكن أن يؤدي إلى تدهور واضح.

عندما يعتبر سلسلة كبيرة بما فيه الكفاية على جانبي الموقع الانقسام، ويتم احتساب تذييل بعديد الأدينيلات بديلة ل، وعدد بولي مختلفة (A) إشارات تسلسل في الجينوم البشري يتجاوز بلا شك عدد من الجينات 24 25. يمكن الجمع بين بولي ضعيف (A) تسلسل إشارة مع الخلايا الأخرى من خلايا هيلا معيار إثبات محبطة، وأنه من الأفضل أول من استخدم ركيزة قوية مع خلايا جديدة، أو خلايا هيلا معدلة مع يحتمل أن تكون ضعيفة بوليا الركيزة.

حتى بعد سنوات عديدة من الاستخدام الناجح، لا تزال هناك أسرار الطفيفة المرتبطة في المختبر 3 'رد فعل الانقسام. على سبيل المثال، لماذا فوسفات الكرياتين حاجة؟ وقد تبين أن السبب الأصلي لذلك بما في ذلك - على التجدد تجمع ATP - غير صالح 26. ومن المثير للاهتمام، ويمكن حذف مع فقدان جزئي فقط من النشاط عند مقتطفات النوويةالمستخدمة، ولكن يصبح تدريجيا أكثر حسب الضرورة ومجزأة إلى استخراج عوامل الانقسام المنقى جزئيا التي تستخدم لإعادة تشكيل رد فعل. في الواقع، phosphocholine، جزيء صغير آخر مع مجموعة الفوسفات وأمين موجبة الشحنة، ولكن من المرجح عدم وجود في الجسم الحي دور في رد الفعل، وقد وجد أن تكون أكثر فعالية من الفوسفات الكرياتين، على الأقل في رد فعل المعاد 27. PVA هو عنصر آخر الذي لا يفسر تماما الشرط. فمن المفترض أن يكون وكيل الازدحام، مما يؤدي إلى زيادة تركيز عامل فعال في الانقسام، ولكن وكلاء الازدحام أخرى، مثل البولي ايثيلين جلايكول، لا تعمل تقريبا كذلك. فهم هذه العوامل قد تؤدي إلى تحسين الكفاءة، مما يتيح تمديد طريقة لأقل كفاءة أنواع الخلايا والحمض النووي الريبي ركائز، وربما تسفر عن أدلة على كيفية عمل مختلف العوامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

SV تشعر بالامتنان للدعم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة K22AI077353 Landenberger. KR بامتنان بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (5SC1GM083754).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Celstir flask Wheaton 356884 Different sizes available
4 position slow speed stirrer VWR 12621-076
Swinging bucket centrifuge Beckman Coulter Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R Eppendorf Refridgerated
Thermomixer incubator Eppendorf
250 ml conical tubes Corning 430776
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
Ultraclear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
JOKLIK modified MEM Lonza 04-719Q
Fetal bovine serum Atlas F-0500-A Heat inactivated
L-glut:pen:strep Gemini Bio-Products 400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0 Mediatech 46-031-CM
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Potassium chloride MP Biomedicals 194844
HEPES Fisher BP310-500
DTT Alexis Biomedicals 280-001-G-010
Glycerol Fisher BP229-4
5 M sodium chloride solution Mediatech 46-032-CV
EDTA 0.5 M solution Sigma-Aldrich E7889-100ml
EDTA Fisher BP120-500
PMSF Thermo Scientific 36978
Ammonium sulfate Fisher A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit Thermo Scientific 66372 MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D9938-1SET Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit Roche 11 732 650 001
10 mM dNTP Mix Invitrogen Y02256 10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit Ambion AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap New England Biolabs S1404S
Century Marker Template Plus Ambion AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi Perkin Elmer BLU507H250UC
Gel loading buffer II Ambion 8546G
DEPC treated water Ambion AM9906
10x TAE Fisher BP13354
10x TBE Ameresco Life Sciences 0658-4L
10x PBS Fisher BP399-20
Urea Fisher BP169-212
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
TEMED Fisher BP150-20
Ammonium acetate Fisher A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide Bio-Rad 161-0144
Glycogen Roche 10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof Acros 61509-0040
Acid phenol:chloroform Ambion 9720 For RNA
Scintilation fluid Fisher SX18-4
Rnase inhibitor Promega N261B
Polyvinyl alcohol- PVA Sigma-Aldrich P8136-250G
Creatine phosphate Calbiochem 2380
100 mM dATP Fisher BP2560-4
SDS Acros 23042-5000
Proteinase K Fisher BP1700-100
Adjustable sequencing unit Sigma-Aldrich Z351881-1EA
Binder clips Office Depot 838-056
20 cm x 42 cm glass plates Sigma-Aldrich Z352543 1 SET
20 cm x 22 cm glass plates Sigma-Aldrich Z35252-7 1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates Sigma-Aldrich Z352667 1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers Sigma-Aldrich Z35230-6 1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers Sigma-Aldrich Z352314-1 1 SET
8-well comb Sigma-Aldrich Z35195-4 1 EA
16-well comb Sigma-Aldrich Z351962 1 EA
32-well comb Sigma-Aldrich Z351970 1 EA
Gel repel coating C.B.S. Scientific SGR-0401 or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips Rainin GT-10-4 0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV Bio-Rad PowerPac HV 5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583 Bio-Rad Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers Agilent 420201
Film 8 x 10 Midsci BX810
Film 14 x 17 Phenix F-BX1417
Autoradiography cassette Fisher FBCA 1417 8 x 10 size available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  2. Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
  3. Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
  4. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
  5. Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
  6. Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
  7. Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
  8. Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
  9. Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
  10. Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
  11. Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
  12. Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
  13. Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
  14. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
  15. Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
  16. Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
  17. Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
  18. Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
  19. Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
  20. Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
  21. Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
  22. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
  23. Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
  24. Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
  25. Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
  26. Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
  27. Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).

Tags

مجمع الأمراض المعدية، العدد 87، الشق، تذييل بعديد الأدينيلات، وتجهيز مرنا وعصائر النووية، 3 'المعالجة
تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 &#39;نهاية الشق من قبل مرنا ركائز<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jablonski, J., Clementz, M., Ryan,… More

Jablonski, J., Clementz, M., Ryan, K., Valente, S. T. Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro. J. Vis. Exp. (87), e51309, doi:10.3791/51309 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter