Summary
ARN polimerasa II sintetiza un precursor de ARN que se extiende más allá del extremo 3 'del ARNm maduro. El final de la ARN maduro se genera cotranscriptionally, en un sitio de dictado por las secuencias de ARN, a través de la actividad de endonucleasa del complejo de escisión. Aquí, detalle el método para estudiar las reacciones de escisión in vitro.
Abstract
El extremo 3 'de los ARNm de mamíferos no se forma por la terminación abrupta de la transcripción por ARN polimerasa II (RNPII). En lugar de ello, RNPII sintetiza ARNm precursor de más allá del final de los ARN maduros, y se requiere un proceso activo de actividad endonucleasa en un sitio específico. La escisión del precursor de ARN se produce normalmente 10-30 nt aguas abajo del sitio poliA consenso (AAUAAA) después de los dinucleótidos CA. Las proteínas del complejo de escisión, un complejo de proteína multifactorial de aproximadamente 800 kDa, lograr esta actividad nucleasa específica. Secuencias de ARN específicas de aguas arriba y aguas abajo del sitio poliA controlan el reclutamiento del complejo de escisión. Inmediatamente después de la escisión, pre-mRNAs se polyadenylated por la poli-polimerasa (PAP) para producir madurar mensajes de ARN estables.
Procesamiento del extremo 3 'de un transcrito de ARN puede ser estudiada usando extractos nucleares celulares con sustratos específicos de ARN radiomarcados. En suma, una larga 32 </ Sup> sin escindir ARN precursor de P-etiquetados se incuba con extractos nucleares in vitro, y la escisión se evaluó por electroforesis en gel y autorradiografía. Cuando se produce la escisión adecuada, una más corta 5 'escindido producto se detecta y se cuantifica. Aquí se describe la división de ensayo en detalle utilizando, por ejemplo, el procesamiento de extremo 3 'del VIH-1 mRNAs.
Introduction
La biosíntesis de la mayoría de los ARN de mensajes eucariotas maduros (ARNm) requiere varias modificaciones post-transcripcionales tales como nivelación, empalme y poliadenilación. Estas modificaciones se acoplan generalmente para asegurar su correcto procesamiento 1 y aumentar fuertemente la estabilidad del ARNm.
El 3 'final de la formación de mamífero pre-ARNm se genera mediante la escisión endonucleolítica de la ARN naciente seguido de la adición de residuos de adenilato a la 5' producto escindido por poli (A) polimerasa (PAP) 2-4. En los mamíferos, la escisión se lleva a cabo por un complejo de proteína de varios componentes, de aproximadamente 800 kDa, que se ensambla en las secuencias de pre-ARN específicos. El poli (A) secuencia señal, una secuencia de hexanucleótidos altamente conservada canónica AAUAAA, dirige el sitio de escisión en aproximadamente 10-30 nt aguas abajo. Este sitio se reconoce específicamente por el factor de división y de poliadenilación especificidad (CPSF) y la 73 kD subunidad deCSPF contiene la actividad endonucleasa. El factor de estimulación de escisión (CSTF) se une a una más degenerada GU-o U-rica secuencia de elemento aguas abajo de la poli (A) sitio. También se requiere para la escisión es el factor de escisión I de mamífero (CFIM), y el factor de escisión de mamífero II (CFII). CFIM une los sitios específicos UGUA (N) en elementos de la secuencia aguas arriba (usos) que han sido definidos por un número de genes y parecen estar implicados en importantes procesos fisiológicos 5-8.
In vitro, las reacciones de procesamiento del ARN son comúnmente analizados por el uso de sustratos de ARN radiomarcados 9-12. Estos pueden ser sintetizados por transcripción escorrentía del bacteriófago promotor T7 o SP6. Cuando se estudia un sitio de poliadenilación que no se ha caracterizado antes, es necesario el uso de ADN genómico en lugar de ADNc para generar el sustrato de ARN, como importantes secuencias aguas abajo pueden no estar presentes en el ADNc. Sustratos de diseño para incluir al menos 150 nt upstream y 50 nt aguas abajo del sitio de escisión / final en el ARNm maduro. El producto de escisión migra más rápido que el sustrato; Sin embargo, debido a que otros fragmentos pueden ser generados por la acción de nucleasas no específicas, la especificidad de la reacción tiene que ser verificada por su dependencia de las secuencias de señal de procesamiento correctos. Por lo tanto, los sustratos de ARN con una mutación puntual en la secuencia AAUAAA (por ejemplo AAGAAA) sirven como un control negativo de la reacción de escisión.
Dado que una pequeña cantidad de ARN radiomarcado se utiliza para las reacciones de escisión, RNasas presentes en gran abundancia en la mayoría de los extractos nucleares pueden ser problemáticas, y limitar la elección del material de partida para la preparación del extracto. Células HeLa tienden a contener niveles bajos de RNasas endógenas, y por lo tanto un buen rendimiento en estos ensayos.
La escisión endonucleolítica de los sustratos de RNA in vivo e in vitro es seguida inmediatamente por la poli (A) Además, jues del intermedio escindida no está presente en cantidades detectables. Por lo tanto, para estudiar o bien una secuencia o proteínas implicadas en una reacción de escisión de ARN específico, los experimentos se llevan a cabo en condiciones que impidan de poliadenilación que se produzcan. No hay dependencia de la escisión de poliadenilación, o viceversa, por lo que se puede dejar de poliadenilación sin perjudicar la reacción de escisión. Por lo tanto, el ATP se sustituye con un análogo de terminación de cadena que carece de grupo hidroxilo 3 'de modo que sólo un único nucleótido se puede incorporar en el sitio de poli (A) y sólo ARN escindido puede ser detectado.
Dada la complejidad y el alto grado de particularidad de este tipo de ensayo, se describe un protocolo detallado de vídeo para estudiar la escisión endonucleolítica por la maquinaria de escisión / poli (A) de los precursores de ARNm in vitro. Se describe cómo preparar extractos nucleares competentes, generar ARN sustratos radiomarcados, lleve a cabo la reacción de escisión, y analizar e interpretar el resultadoproductos ing. Figura 1 muestra un ejemplo de los ARN de sustrato que codifican para el extremo 3 'del VIH-1 de pre-ARNm para ser utilizado para un ensayo de escisión. El extremo 3 'del genoma de ARN del VIH se compone de muchas secuencias reguladoras importantes, tales como el sitio poli (A), una región rica en G+ T, y el elemento de uso, que son todos necesarios para la maduración eficiente de los transcritos de ARNm virales 13 . En este ejemplo, se esperaría que el sustrato de ARN de entrada sea 338 nt y tras la escisión 237 nt. Si poliadenilación se permite que ocurra, se observó una mancha de productos entre 237 y 437 nt.
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Protocol
1. Adaptación de células adherentes en Suspensión
(Este es un paso opcional. Las células en suspensión generalmente tomar mejores extractos nucleares, sin embargo las células cultivadas en placas también se pueden utilizar.)
- Adaptar las células adherentes para el crecimiento en suspensión usando MEM de Joklik modificado suplementado con 5-10% de suero de ternero recién nacido o de suero fetal bovino y 1% de L-glutamina: penicilina-estreptomicina. Propagar las células en matraces de agitación con una tapa de filtro a 37 ° C con 8% de CO 2.
- Cuando la adaptación de las células, comience con 100 ml en un matraz de 500 ml spinner. Mantener un mínimo de 0,3 x 10 6 células / ml y reemplazar el medio cada 1-2 días hasta alcanzar la tasa de crecimiento adecuada (normalmente 2-6 semanas). Una vez adaptado, las células HeLa en suspensión deben duplicar aproximadamente cada 24 horas NOTA:. Durante la fase de adaptación, que tomará algún tiempo para que las células se volvieron a sus tasas duplicación normal.
- Mantener las células en una cuevadad de 0,5 a 0,8 x 10 6 células / ml en el volumen final deseado (típicamente 1-10 L)
- Las células se cosechan típicamente en la fase logarítmica media (alrededor de 0,5 a 0,65 x 10 6 células / ml y> 90% viable). Utilice el matraz de agitación de tamaño adecuado para la cantidad deseada de medio de cultivo.
2. Extractos nucleares
- Buffer y Preparación de los reactivos
NOTA: Las extracciones se realizan siguiendo un modificado Dignam et al (1983) 14 Procedimiento de extracto nuclear..- Preparar 1X solución salina tamponada con fosfato, tampón A, tampón C, y tampón D (Tabla 1) el día antes de proceder con extracciones y almacenar a 4 ° C.
NOTA: Los mayores rendimientos se obtienen generalmente con tampón recién preparado; Sin embargo, el tampón es estable durante varias semanas. Es importante que todos los tampones, aparatos y equipos son pre-enfriaron y se mantienen en frío para la totalidad de las extracciones.Use un cuarto frío para tantos pasos posibles y / o mantener todo en hielo. Añadir TDT y PMSF inmediatamente antes de su uso.
- Preparar 1X solución salina tamponada con fosfato, tampón A, tampón C, y tampón D (Tabla 1) el día antes de proceder con extracciones y almacenar a 4 ° C.
- La recogida y lavado Células
- Vierta células en cuatro botellas de 250 ml cónicos y de espín a 500 xg durante 5 min a 4 ° C en una centrífuga con un balanceo o un rotor de ángulo fijo. Sobrenadantes de decantación y añadir otro medio de cultivo celular de 250 ml a cada botella. Repita hace girar hasta que todas las células se han sedimentado.
- Resuspender sedimentos finales combinadas en un total de 250 ml de helado de PBS y piscina en una botella de 250 ml cónico. Girar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de cubeta oscilante.
- Retirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en PBS helado por lo que el volumen total no exceda de 50 ml. Aflojar el sedimento a través de pipeteo y la transferencia a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
- Girar las células de nuevo a 500 xg durante 6 min a 4 ° C en una centrifugadora de cubeta oscilante. Vierta supernatanty estimación y anotar el volumen sedimento celular (CPV) con la mayor precisión posible. Utilice agua en un tubo de juego aparte, para la comparación, si la pastilla es más bajo que las marcas de volumen en el tubo.
- La lisis celular
- Añadir TDT para amortiguar A. Resuspender el precipitado en tampón A con 5 volúmenes de la CPV estimada. Pipeta para romper el pellet e incubar en hielo durante 10 min.
- Girar las células a 931 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de cubeta oscilante.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante en lugar de decantación. El volumen de pellets debería haber aumentado más o menos dos veces en tamaño debido a la hinchazón de las células.
- Añadir 1 Públicos de tampón A a las células. Romper suavemente el precipitado y retirar una pequeña alícuota (unos 50 l) a un tubo de microcentrífuga en hielo. Transferencia de las células resuspendidas en un homogeneizador Dounce de tamaño apropiado (por lo general 15 ml de tamaño) enfriado en hielo.
- Lisar las células con 12 a 15 movimientos lentos pero constantes de tipo B (TIGht) maja. Retirar una pequeña alícuota del lisado y examinar bajo un microscopio para lisis completa (intacta pequeños núcleos oscuros en comparación con las células inflamadas) mediante tinción con azul tripán. Las células intactas serán claras). Continuar homogeneización hasta que se alcanza el 90% de lisis y se detiene aquí, más douncing puede influir negativamente en la calidad de los extractos nucleares.
- Transfiera el lisado en UltraClear tubos de ultracentrífuga y anotar el volumen total. Equilibre pesando los tubos y giran a 1069 xg durante 10 min a 4 ° C.
NOTA: La ultracentrífuga se utiliza en este paso a pesar de la baja velocidad de giro debido a que el mismo tubo se hizo girar a una velocidad más alta en la siguiente etapa. Este giro se producir un sedimento bastante estrecho que cubre la parte inferior del tubo con sobrenadante más nublado anteriormente, que puede ser recogida y usada para los extractos de S100 citosólicas. Si hay una capa de lípidos visibles en la parte superior del tubo, que se puede quitar. - Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y la transfiere en anoth.. tubo er Evite perturbar el sedimento nuclear NOTA: Será importante conocer el volumen final de sobrenadante con el fin de determinar el volumen nuclear comprimido (PNV).
- Preparación del extracto nuclear
- Una vez que el sobrenadante se ha eliminado cuidadosamente, respin el crudo de pellets extracto nuclear a 25.453 xg durante 15 min a 4 ° C en el mismo tubo.
- Eliminar el sobrenadante restante (que debería ser una pequeña cantidad de líquido claro) y agregarla a la colección sobrenadante anterior. Medir el volumen final del sobrenadante. Calcular el PNV restando este volumen del volumen total del lisado inicial observó anteriormente. Alternativamente, si el sedimento es lo suficientemente grande, su volumen se puede estimar mediante la comparación con el volumen similar de agua en un tubo idéntico.
- Añadir 1 volumen PNV de tampón C (aproximadamente 1 ml / ml de células). Desprender cuidadosamente la bolita con una punta de pipeta y transferir en una forma apropiada sihomogeneizador Dounce zed. Si se utiliza el mismo homogeneizador como antes, Prelavado el homogeneizador con agua desionizada estéril.
- Resuspender el precipitado con ~ 5-10 golpes a través de un homogeneizador Dounce usando una mano de mortero ajustado.
- Transferir el lisado nuclear homogeneizada en un tubo enfriado y se mezcla por inversión durante 30 min a 4 ° C. Si el volumen es lo suficientemente grande, agite usando una placa de agitación magnética y barra magnética.
- Transferir el lisado en un nuevo tubo de centrífuga ultraclaros y girar a 25.453 xg durante 30 min a 4 ° C. El sedimento debe ser compacto. Acerca de 5 minutos antes del exprimido, hidratar los casetes de diálisis o tubos que tienen un peso molecular apropiado de corte (MWCO) (por ejemplo, 7.000 kDa).
- Quitar el sobrenadante (extracto nuclear) del tubo en un tubo cónico refrigerados utilizando una pipeta de transferencia a continuación, proceder a la diálisis.
- Diálisis
- Inyectar los extractos en casetes de diálisis hidratados según fabricantes instrucciones y dializar los extractos nucleares en 500 ml de Tampón D 50 durante 1 hora a 4 ° C con agitación.
- Vuelva a colocar el tampón con 500 ml fresca, helada Buffer D 50 y diálisis para un 4 horas adicionales a 4 ° C. Este paso 4 horas se puede dividir en dos cambios de 2 horas en su lugar.
- Quitar los extractos de la casete de diálisis y transferir a tubos refrigerados. Haga girar los extractos durante 5 minutos a 1500 xga 4 º C.
- Alícuota de las soluciones en tubos Eppendorf, refrigerados y complemento de congelación en nitrógeno líquido (50-100 l por alícuota). Almacenar a -80 ° C para su uso futuro.
3. ARN de Síntesis de Sonda
- Preparación de plantilla
Nota: Las plantillas utilizadas para la transcripción pueden ser fragmentos de PCR o plásmidos que contienen un promotor de T7 o SP6 aguas arriba e inmediatamente adyacente a la secuencia de la sonda deseada. Plantillas de plásmido deben ser linealizadas aguas abajo de la secuencia de la plantilla de interest. Hemos observado un mayor rendimiento a partir de plantillas de PCR.- El promotor T7/SP6 se puede insertar durante la reacción de PCR. Diseñar el cebador sentido con la T7/SP6 promotor aguas arriba de la secuencia diana.
- Amplificar la secuencia deseada en 2-3 reacciones por la plantilla a través de PCR según las instrucciones del fabricante utilizando una alta fidelidad de la polimerasa.
- Combine reacciones equivalentes y se purifica por extracción de gel.
- Secuencia de los productos de PCR para comprobar la exactitud de la plantilla. (Opcional)
- RNA Transcripción con 32 P etiquetado
- Realizar la transcripción in vitro a partir de 1 g de plantilla con un kit disponible comercialmente que sea compatible con el promotor (SP6 o T7) con las siguientes modificaciones. Utilice 1 l de fresco UTP 3000 Ci / mmol [α-32 P], 0,5 l de 10 mM UTP frío, 0,1 l de 10 mM GTP, y 0,9 l de 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G ARN gorra en un volumen final total de 20 l.
NOTA: El G-cap mejora la estabilidad de las transcripciones de ARN en extractos nucleares (cap: GTP) 10:1. El UTP frío se añade para evitar que el 32 P-UTP de ser el reactivo limitante. - Sintetizar una escalera de tamaño de ARN como se indica más arriba sin la tapa de mayor. Plantillas comerciales están disponibles para generar el marcador de tamaño de ARN.
- Se incuban las reacciones de transcripción a 37 ° C durante 1 h (para uso SP6 40 ° C). Una vez completado, realizar la digestión DNasa de la plantilla durante 15 min a 37 ° C.
- Después de la digestión, añadir 1 l de EDTA 0,5 M y 5 l de tampón de carga II a los sustratos de ARN. Añadir 20 l de tampón de carga II del marcador.
- Calentar el marcador de ARN y las sondas a 95 ° C durante 3 min y después colocar sobre hielo.
- Realizar la transcripción in vitro a partir de 1 g de plantilla con un kit disponible comercialmente que sea compatible con el promotor (SP6 o T7) con las siguientes modificaciones. Utilice 1 l de fresco UTP 3000 Ci / mmol [α-32 P], 0,5 l de 10 mM UTP frío, 0,1 l de 10 mM GTP, y 0,9 l de 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G ARN gorra en un volumen final total de 20 l.
- Fundición gel de poliacrilamida / sonda de electroforesis
- Preparar 1 l de 6% de gel de poliacrilamida (PAGE) y la mezcla de 400 ml de 10% de PAGE. Para hacer que el 6%, mezclar 150 ml de 40% 19:01 acrilamida: bis-uncrylamide con 100 ml de 10 veces de Tris / borato / EDTA (TBE) y 460 g de urea. Llevar hasta 800 ml con agua desionizada estéril y mezclar sobre una placa caliente mientras se aplica calor bajo (alrededor de 50-80 ° C). Completar hasta 1 litro con agua desionizada.
NOTA: La reacción es endotérmica. Calefacción promueve la solubilización de la urea. Eliminar de calor tan pronto como se disuelve la urea y llevar la solución a 1 L con agua desionizada. Alternativamente agitar a temperatura ambiente durante la noche; Demasiado calor puede iniciar la polimerización. - Proteja la mezcla PÁGINA de la luz con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente. Las mezclas PRODUCTOS pueden preparar con anticipación y son estables durante varios meses.
- Preparar 400 ml de 10% de mezcla PÁGINA mediante la combinación de 100 ml de la 40% 19:01 acrilamida: bis-acrilamida, 40 ml de TBE 10x y 184 g de urea. Después de que se disuelva la urea, llevar hasta 400 ml con agua desionizada.
Alternativamente, preparar una solución de acrilamida 19:01 20% y una solución de acrilamida 0% wiª tampón y urea sólo; a continuación, estos se pueden mezclar en cualquier proporción para dar cualquier porcentaje entre 0 y 20%; urea es siempre lento para disolver. - Preparar 10-50 ml de persulfato de amonio al 10% (APS) en agua desionizada estéril en función del número de geles para ser emitidos.
- Lavar 20 cm x 22 cm placas de gel de vidrio con etanol al 70% (EtOH). Seque con grandes paños libres de pelusa.
- Lavar la placa regular con 1 ml de 5 N de hidróxido de sodio (NaOH) y luego vuelva a lavar con 70% de EtOH. Cubra la placa con muescas con una solución de gel siliconado repelen limpiando la placa con una pequeña Kimwipe saturado.
- Montar las placas mediante la colocación de la placa de periódico sobre una caja de puntas de pipeta vacía o un trozo de espuma de poliestireno para elevarlo de la mesa con el lado limpio hacia arriba. Coloque 0.4 espaciadores mm en el borde de cada lado largo.
- Colocar con cuidado la placa con muescas sobre los espaciadores de modo que el lado revestido será en el interior del gel. Use una navaja u otro instrumento delgado para cambiarlos espaciadores para una alineación ras en la parte inferior y los lados de las placas de gel luego asegure con clips de la carpeta en cada lado de las placas de gel de más de los espaciadores.
- Preparar 30 ml de 8% de mezcla PÁGINA por gel mediante la mezcla de 15 ml de 10% y 6% se mezcla cada una en un tubo de 50 ml. Añadir rápidamente 300 l de 10% de APS, seguido por 30 l de N, N, N ', N'-tetra-metiletilendiamina (TEMED) a la mezcla de gel de 8%.
Nota: Los porcentajes de gel apropiadas para tamaños de sonda individuales deben ser seleccionados por el experimentador. - Cap y 2x invertido y vierta la solución en la zona dentada de las placas de gel. Asegúrese de elevar ligeramente las placas con la mano y mantener un derramará hasta que la mezcla PÁGINA comienza a gotear de la parte inferior.
- Baje las placas de nuevo a nivel e inserte inmediatamente el gran 8-así peine rectángulo de 0,4 mm x 20 cm de gel. Pequeñas burbujas cerca de la parte inferior no afectarán el funcionamiento, pero no debe haber burbujas en los pocillos.
NOTA: </ Strong> Coloque toallas de papel en la mesa debajo de la parte inferior y la parte superior del gel para capturar cualquier derrame durante el vertido. - Deje que la mezcla PÁGINA polimerizar durante al menos 30 min.
- Transferir el gel polimerizado a la sala fría y montar el aparato de electroforesis. Añadir tampón TBE frío a las líneas de llenado en las cámaras superior e inferior.
- Quite el peine y utilizar una navaja de afeitar para eliminar los residuos. Ajuste el gel en el aparato y utilizar un clip de la carpeta para mantener la placa a la junta. Añadir TBE frío a la cámara superior hasta desembocar en las placas.
- Lavar los pocillos con 30 ml syringe/21 T 1-1/2 aguja "lleno de frío TBE justo antes de la carga de los sustratos de ARN marcadas. Coloque una placa de aluminio en la parte posterior del vidrio para ayudar en la distribución uniforme del calor mientras se ejecuta.
- Carga 3 l del marcador y toda la reacción de transcripción 25 l de cada sustrato de ARN en pocillos separados. Deja un pozo entre las transcripciones de tamaño similar a la pcontaminación cruzada revenir. Bromofenol colorantes azules y cianol de xileno en el tampón de carga se pueden utilizar para estimar la migración del tamaño en el gel.
- Correr el gel a una potencia constante apropiada para el tamaño de las sondas de ARN (por ejemplo, 25 vatios durante 2 horas para sondas de 600 nt).
- Preparar 1 l de 6% de gel de poliacrilamida (PAGE) y la mezcla de 400 ml de 10% de PAGE. Para hacer que el 6%, mezclar 150 ml de 40% 19:01 acrilamida: bis-uncrylamide con 100 ml de 10 veces de Tris / borato / EDTA (TBE) y 460 g de urea. Llevar hasta 800 ml con agua desionizada estéril y mezclar sobre una placa caliente mientras se aplica calor bajo (alrededor de 50-80 ° C). Completar hasta 1 litro con agua desionizada.
- Etiquetados RNA Extracción y Purificación
- Después de la electroforesis, drenar cuidadosamente la cámara superior del aparato de gel. La mayor parte de la radiactividad habrá en el gel y la cámara inferior; Sin embargo, el tampón superior puede contener algún material radiactivo.
- Utilice una bandeja para transportar el gel si se desplaza a otra área de trabajo de material radiactivo. Retire con cuidado los separadores tirando de la pieza que sobresale lateralmente lejos del gel.
- Separar suavemente las placas. El gel debe pegarse a la placa que no se siliconado. Coloque un pedazo de plástico sobre la placa de gel y vidrio.
- Coloque una autorradiografía pegatina glogos marcador en la envoltura de plástico sobre un sonuna del gel que está claro de las muestras.
- En una habitación oscura, colocar un trozo de película de autorradiografía sobre toda la placa y exponer por lo menos durante 1 min. Desarrollar la película.
- Coloque la película desarrollada en una superficie clara. A continuación, coloque el lado de plástico del gel boca abajo sobre la película y alinear el marcador autorradiografía del gel para el marcador expuesta en la película. Una vez alineado, con un marcador negro para marcar la ubicación de las bandas deseadas en el cristal.
NOTA: Como alternativa, alinee geles / película de la siguiente manera para cortar bandas de ARN. En el cuarto oscuro, coloque el gel envuelto en una mesa, coloque la película en la parte superior de la misma y coloque un cassette (o un libro, etc) en la parte superior de la pieza de la película. Flick el interruptor de luz en la sala de un instante y luego apagarla. Esta voluntad "pre-flash" la película que genera un resumen de todos los pozos de la película debido a la presión / protección de la luz que el casete en la parte superior ofrece. Esto hace que sea fácil para alinear la película sobre el gel y se cortóla banda sin el uso de marcadores fluorescentes. - Retire con cuidado el envoltorio de plástico y utilizar un bisturí fresca o una navaja para cada sustrato de ARN y extirpar las bandas del gel y colocar en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml separadas. Utilice un nutator para agitaciones suaves durante la elución.
- Añadir 500 l de tampón de elución de ARN (acetato de amonio 0,5 M, 10 mM de MgCl 2, EDTA 1 mM, 0,2% de SDS) a cada tubo. Centrifugar brevemente para sumergir el fragmento de gel. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 3-16 h según el tamaño de la sonda.
- Transferencia de la totalidad de los 500 l de material eluido en un nuevo tubo. Evitar la transferencia de los trozos de gel, ya que interferirán con la purificación. Añadir 1 l de glucógeno (20 mg / ml) junto con 500 l de frío, fenol-cloroformo ácida (para ARN).
- Vórtice resumen, la solución debe aparecer turbia. Girar a temperatura ambiente a una velocidad superior (~ 16.000 xg) durante 5-6 min.
- Cuidadosamente transfer la parte superior (acuosa) de capa a nuevos tubos receptores tanto como sea posible evitando al mismo tiempo cualquier residuo de la interfase. Añadir una cantidad igual de cloroformo a la capa acuosa transferido. Repita el paso 3.4.10 y transferir la parte superior (acuosa) de capa a un nuevo tubo. Añadir 1 ml de helado de 95-100% EtOH para el material recogido. Incubar a -80 º C durante 10 min NOTA:. El ARN se puede almacenar durante toda la noche si se desea.
- Sedimentar las ARN durante 30 min a 16.000 xg a 4 ° C. Vierta cuidadosamente el sobrenadante en un recipiente de desechos radiactivos y añadir 1 ml de helado de 70% de grado molecular EtOH para cada pastilla.
- Sedimentar las ARN a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C, se vierte el sobrenadante, girar de nuevo durante 1 min y eliminar cualquier EtOH residual a través de la pipeta y dejar a temperatura ambiente con las tapas abiertas para permitir la evaporación de cualquier resto de EtOH.
- Resuspender los pellets en el 20-30 l de RNasa libre de agua. ARN marcado se puede almacenar a -80 ° C.
NOTA: Un metro encuesta radiactivo debe ser utilizado durante todo el procedimiento de extracción para verificar que el ARN marcado no se ha perdido durante cualquier etapa.
- La cuantificación de ARN marcado para una reacción de pre-ARNm 3 'mRNA división
- Calcule la molaridad de los sustratos de corte utilizando el siguiente procedimiento.
- Tomemos, por ejemplo, 1 l de 3.000 Ci / mmol [α-32 P] UTP y 10 mCi / ml. (En la fecha de referencia de etiqueta, la concentración química de esta solución madre será 3,3 M UTP. Antes de esa fecha es más alto y una vida media (~ 13 días) después de la fecha en que quede ~ 1,6 mM, etc) El etiquetado contribución UTP a la concentración final de reacción es típicamente insignificante cuando se utiliza una concentración final de UTP frío por encima de la UTP K m. El T7 RNAP Km para UTP es de 114 mM 15.
- Diluir las 1 l en 39 l de agua. A continuación, añadir 1 l de diluido [α-
- Diluir 1 l de cada sustrato de ARN marcado en viales separados con una cantidad igual de líquido de centelleo usado en el paso anterior. Asegúrese de tener un vial con sólo líquido de centelleo para calcular el fondo. Cuantificar la radiactividad en un contador de centelleo.
- Multiplicar los recuentos por minutos (cpm) de la [α-32 P] UTP muestra por 40 para tener en cuenta la dilución inicial y restar el fondo obtenido por el fluido de centelleo solo. Multiplique los recuentos para cada sonda de ARN por la cantidad de agua libre de RNasa (20-30 l) utilizaron para volver a suspender la RNA sondas. Esto le da al cpm total de la ARN purificado.
Ejemplo:. Cpm Max = (cpm [α-32 P] UTP - fondo) x 40 Etiquetados RNA Muestra 1 = 20,000 cpm x 20 = 400.000 cpm (si 20 l utilizados para la resuspensión) - Si una cantidad distinta de 1 l de [α-32 P] UTP se utilizó para hacer las transcripciones, entonces este factor de volumen en el cpm definitiva de [α-32 P] UTP multiplicando el cpm para el [α-32 P] muestra de UTP por la cantidad utilizada.
Ejemplo: 2 l de [α-32 P] UTP se utiliza para hacer las transcripciones. El cpm calculado para 1 l [α-32 P] UTP es de 500.000 cpm. Multiplique 500000 * 2 = 1.000.000 cpm - Divida la cpm ARN marcado calculado por el cpm calculado para [α-32 P] UTP solo. Este será más o menos estimar el porcentaje de UTP marcado incorporado.
Ejemplo: 400000/1000000 = 0,40 o 40%incorporado - Dado que una enzima no puede distinguir entre isótopos, el mismo porcentaje de UTP marcado y no marcado se incorpora en el ARN durante la transcripción. Calcular la cantidad de UTP frío en moles que se añade a la reacción de transcripción (0,5 l de una solución 10 mM = 5,0 x 10 -9 moles de UTP).
- Multiplicar el UTP moles en la reacción por el porcentaje incorporado (conocido a partir de la UTP caliente contando arriba), y se divide por el número de uridines en la secuencia de ARN.
Ejemplo: 5,0 x 10 -9 moles de UTP x 0,40 = 2 x 10 -9 moles UTP
2 x 10 -9 moles UTP / 73 U por transcripción = 2,7 x 10 -11 moles de ARN - Convertir moles de ARN a molaridad dividiendo el volumen de la solución de ARN resuspensión recuperado.
Ejemplo: 2,7 x 10 -11 moles de ARN / 20 l = 1,370 nM de ARN. Para transcripciones de T7 RNAP hechas de aproximadamente 1 g linealdio cuenta plásmido y se resuspendió en 20 l de agua, los valores de 200 a 1400 nM son típicos.
NOTA: La concentración molar de ARN se utiliza para asegurar que la concentración de sustrato de pre-ARNm final en la reacción de escisión in vitro es menos de 5 nM por reacción de escisión. Eficacia de escisión puede disminuir si la concentración de ARN se eleva significativamente por encima de 5 nM.
- Calcule la molaridad de los sustratos de corte utilizando el siguiente procedimiento.
4. 3 'del ARNm reacción de división
- Reacción de escisión Preparación de los reactivos
- Preparar todos los reactivos necesarios para la reacción de escisión. Hacer 10% de alcohol de polivinilo (PVA) de agua hirviendo y añadir poco a poco la cantidad correcta de polvo de PVA. 10% de PVA será viscoso y toma tiempo para disolverse. Conservar a temperatura ambiente o 20 ° C.
- Preparar 1 M de fosfato de creatina (CP) y se almacena a -80 ° C. Es importante utilizar 1 M de CP que es menos de 4 meses de edad.
- Preparar 1 M DTT y almacenara -20 ° C. Hacer una nueva M DTT dilución 0.2 de la M DTT 1 justo antes de hacer la reacción de escisión.
- Preparar ETS (solución de parada de escisión): 10 mM de Tris pH 7,8, EDTA 10 mM, 0,5% de SDS. Guarde a temperatura ambiente.
- Reacción de escisión
- Calentar el ARN marcado a 80 ° C durante 2 min y después colocar sobre hielo.
- Agite suavemente y luego girar el PVA 10% a la máxima velocidad durante 2-3 minutos para eliminar las burbujas.
- Master mezcla 1: Para una sola reacción, se combinan 3,125 l 10% de PVA, 0.625 l 1 M CP, 0,25 l 0,5 M tRNA, 0.125 l mM dATP 100, 0,13 l 40 U inhibidor de RNasa / l, 0,25 l 0,1 M EDTA pH 8 , 0,1 l 0,2 M DTT, y 0.645 RNasa libre de agua l. Dispense 5,25 l maestro de la mezcla 1 por tubo en hielo.
- Master mezcla 2: Uso 6,25 l / reacción de extractos nucleares a concentraciones superiores a 2 mg / ml. Los extractos nucleares se pueden diluir con tampón D 50 si Needed.
- Combine los 6,25 l de extracto nuclear con el previamente dispensado 5,25 l de mezcla maestra 1. Añadir 1 l de sustrato de ARN marcado que se diluye a 50 nM. Alternativamente, el ARN se puede incluir en la mezcla maestra 1 a condición de que se añade después de que el inhibidor de RNasa, la TDT y tRNA NOTA:. Uso <5 nM del sustrato de ARN marcado.
- Agite suavemente y vuelta rápida de cada muestra para eliminar las burbujas. Incubar a 30 ° C durante un máximo de 2 horas, pero un curso de tiempo se debe realizar para obtener resultados óptimos. Incubaciones más largas podrían aumentar la degradación de fondo.
- Proteinasa K digestión y purificación
- Retire las muestras del fuego y añadir 182,5 l de solución de parada de ETS a cada reacción. Añadir 5 l de 20 mg / ml de proteinasa K y se incuban las muestras a 37 ° C durante 10 min.
- Extraer el ARN mediante la adición de 1 volumen (200 l) de ácido fenol-cloroformo, 1/10 de volumen (20 l) de sodio 3 Metilo, y 1 l de 20 mg / ml de glucógeno. Proceda con las extracciones que se describen en las secciones 3.4.9-3.4.14.
- Una vez que se haya completado la extracción de RNA, asegúrese de retirar todos EtOH residual. Resuspender el sedimento en 8 l de tampón de carga (90% de formamida, EDTA 10 mM, azul de bromofenol con (BFB) (o xileno cianol y azul)). Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C o proceder con la electroforesis en gel.
- Electroforesis reacción de escisión
- Preparar un gel de acrilamida al 6% como se ha indicado anteriormente en las secciones 3.3.1-3.3.17 con unas pocas modificaciones. Utilice 20 cm x 42 cm placas de gel de secuenciación con 2 clips de la carpeta de cada lado largo. Utilice un peine de 32 pocillos y preparar 40 ml de la mezcla de gel.
- Cargue el gel con 3 l de marcador y 5 l de cada muestra. Optimice la configuración de electroforesis de acuerdo con pre-escisión y de producto escindido tamaños.
- Cuando se completa la electroforesis, siga las secciones 3.4.1-3.4.3 </ Strong> para desmontar el gel. En lugar de una envoltura de plástico, cortar un trozo de papel de filtro para el tamaño de la placa de gel y que lo coloque en un lado del gel expuesta.
- Presione el papel de filtro con firmeza sobre el gel, y luego la vuelta sobre la placa de manera que el papel de filtro se encuentra en la parte inferior y el vidrio es en la parte superior. Presione firmemente el vaso sobre la mesa para asegurar que el gel está agarrando el papel de filtro en forma pareja.
- Pelar lentamente el papel de filtro, que debe tener el gel unido a él, desde uno de los extremos cortos hasta que todo el papel de filtro con gel de adjunto se retira de la placa de vidrio.
- Cubra el lado gel expuesta con una envoltura de plástico. Pegue el plástico con el papel de filtro.
- Colocar el gel en un secador de gel con el lado del filtro hacia el lado de vacío. Seco durante 15 minutos o hasta que el gel se seque completamente.
NOTA: Si un secador de gel no está disponible, película de rayos X puede ser utilizado para visualizar las bandas de ARN. La exposición debe llevarse a cabo en un ligh-t apretada cassette con pantalla de intensificación a -80 ° C. Tiempo de exposición se determina empíricamente. Precaución: geles bajas por ciento de acrilamida pueden agrietarse al congelarse. - El gel puede ahora ser usado para exponer la película o ser utilizado con una fosfo-Imager. Tiempo de exposición depende de la fuerza de la ARN marcado. Inicialmente una exposición de 24 horas puede ser utilizado. Si se utiliza la película, exponer a -80 ° C con una pantalla de intensificación y se deja calentar a temperatura ambiente antes de desarrollar.
- Medir la relación entre el ARN segmentado y un-escindido en cada muestra para cuantificar la eficiencia escote.
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Representative Results
Los resultados representativos de un ensayo de escisión del ARN poli (A) los sitios de VIH-1 (Figura 2). Podemos observar el sustrato de ARN no escindido, que es la banda de migración más lenta en la parte superior del gel. El producto escindido específica es la más intensa banda del fragmento más corto que corre más rápido en el gel en el tamaño esperado, y es específicamente ausentes del ensayo de escisión de la mutpoly (A) de control que contiene una mutación puntual en la secuencia de poliA (mutPolyA) ARN sustrato. Los productos de degradación del sustrato de entrada pueden a veces ser observados. La cuantificación de la actividad de escisión puede ser determinada por parcela densitométrico de la relación de no escindido a ARN escindido normalizado a 100% de ARN no escindido.
Figura 1. Esquema representación del VIH-pre-sustratos mRNA 3 'finales de procesamiento y productos esperados de vitro reacciones de escisión y poliadenilación en el sitio de escisión., el dinucleótido-CA-, se encuentra 25 nt río abajo del AAUAAA polyA sitio. Regiones LTR: U3 (única secuencia 3 '), R (secuencia repetida) y U5 (única secuencia 5').
Figura 2. (A) Poli de escisión (A) sitio. 32 ARN P-etiquetados que contienen el poli (A) de VIH-1 y un punto de mutación de la poli (A) de la señal que suprime la escisión (mutPolyA) fueron incubadas en extractos nucleares de células HeLa-S3 o BSA como control negativo. Flecha negritas indica la 5 'escindida producto. El fragmento 3 'a menudo se sale del gel o se degrada y no siempre visible. (B) parcela densitométrico de la activi escoteTy expresa como una relación de no escindido a ARN escindido normalizado a 100% de ARN no escindido.
| Tampón A (100 ml) | Tris 10 mM (pH 7,9), 1,5 mM de MgCl 2, KCl 10 mM, ditiotreitol 0,5 mM (DTT). | Añadir TDT justo antes usando tampón A durante la extracción. Añadir 1 l de DTT 1 M por 1 ml de tampón A. |
| Tampón C (50 ml) | Tris 20 mM (pH 7,9), 25% (v / v) de glicerol, 0,42 M de NaCl, 1,5 mM de MgCl 2, 0,2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), DTT 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM (PMSF). | Añadir una tableta de cóctel inhibidor de proteasa de la mañana de las extracciones. |
| Tampón D 50 (2-4 L) | Tris 20 mM (pH 7,9), 20% (v / v) de glicerol, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, sulfato de amonio 50 mM. | HEPES-KOH puede ser sustituido por Tris en tampón A, C y D. |
| Acetato de amonio 0,5 M, 10 mM de MgCl 2, EDTA 1 mM, 0,2% de sodio dodecil sulfato (SDS) | Guarde a temperatura ambiente. | |
| Detener Buffer (ETS) | Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM, 0,5% de SDS | Guarde a temperatura ambiente. |
| Escote Loading Buffer | 90% de formamida, 5 mM de EDTA pH 8, 0,025% de azul de bromofenol | Almacenar a -20 ° C. |
Tabla 1. Composición de tampones.
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Discussion
La reacción de escisión in vitro de pre-ARNm 3 ', llevado a cabo en los extractos nucleares de células HeLa o con factores de escisión se fraccionó a partir de estos extractos, ha permitido la identificación de los factores de división de núcleo y sus principales complejos de 16-21. Muchos más proteínas asociadas a estos factores se han identificado recientemente 22, y la reacción in vitro pueden continuar para arrojar luz sobre cómo estas proteínas contribuyen a la reacción. Quizás porque la reacción in vivo parece ser cotranscriptional 23, o debido a que algunos factores que contribuyen pueden perderse durante la extracción y la diálisis, la eficiencia es a menudo pobre, y rara vez se consigue es más de 30% de escisión. Además, la eficacia de la reacción puede caer de repente en el día a día, sin razón aparente. Por lo tanto, es importante apreciar que los pasos son los más críticos, especialmente cuando se trata de adaptar la reacción a modificado o infectada con un virus CEL HeLaLS, a otros tipos de células o a nuevos sustratos.
Sin duda, la calidad del extracto y la frescura de la vitro de ARN transcrito en son de suma importancia, como es la necesidad de trabajar bajo condiciones escrupulosamente RNasa libre. La salud de las células en el momento que se cosechan para la extracción también es importante. Las células deben aparecer sana, deben duplican en menos de 24 horas, deben ser o se aproxima a mediados de la fase de registro, y no debe haber pocas células muertas y otros residuos de origen desconocido. Obviamente, las células no deben ser contaminados por micoplasma u otras bacterias. El sustrato no debe hacerse con demasiado alto de una actividad específica, ya que esto puede conducir a la degradación aparente.
Cuando se considera una gran secuencia de suficiente a cada lado del sitio de escisión, y la poliadenilación alternativa se tiene en cuenta, el número de diferentes poli (A) señales de secuencia en el genoma humano, sin duda, supera el número de genes 24 25. La combinación de un poli débil (A) la secuencia de señal con células distintas de las células HeLa estándar puede resultar frustrante, y es mejor primero utilizar un sustrato fuerte con nuevas células, o células HeLa no modificados con un sustrato potencialmente débil poliA.
Incluso después de tantos años de uso con éxito, todavía hay misterios menores asociados con la reacción de escisión in vitro en 3 '. Por ejemplo, ¿por qué se necesita el fosfato de creatina? Se ha demostrado que la razón original para la inclusión de que - para regenerar el ATP piscina - no es válida 26. Curiosamente, se puede omitir con pérdida parcial de la actividad cuando son extractos nuclearesutilizado, pero se vuelve progresivamente más necesario como el extracto se fracciona en factores de escisión parcialmente purificadas que se utilizan para reconstituir la reacción. De hecho, fosfocolina, otra molécula pequeña con un grupo fosfato y una amina cargada positivamente, pero es probable que no tiene papel in vivo en la reacción, se ha encontrado que es más eficaz que el fosfato de creatina, por lo menos en la reacción reconstituida 27. PVA es otro ingrediente cuyo requisito no se explica completamente. Se supone que es un agente de hacinamiento, lo que lleva a un aumento real de la concentración de factor de la división, pero otros agentes hacinamiento, como polietilenglicol, no funcionan tan bien. La comprensión de estos factores puede llevar a una mayor eficiencia, lo que permite la extensión del método a tipos de células y sustratos de RNA menos eficiente, y podría dar pistas sobre cómo funcionan los diversos factores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
SV agradece el apoyo financiero del NIH K22AI077353 y la Fundación Landenberger. KR agradece el financiamiento de los NIH (5SC1GM083754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Celstir flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 position slow speed stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table top centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250 ml conical tubes | Corning | 430776 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal bovine serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-glut:pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M sodium chloride solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium sulfate | Fisher | A702-500 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml |
| 15 ml Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand high fidelity PCR kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% absolute ethanol 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid phenol:chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase inhibitor | Promega | N261B | |
| Polyvinyl alcohol- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable sequencing unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| 20 cm x 22 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| 20 cm x 42 cm aluminum cooling plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| 0.4 mm x 22 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| 0.4 mm x 42 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| 8-well comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| 16-well comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 EA |
| 32-well comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel loading tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μl |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech vacuum pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 size available |
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