Summary
RNA聚合酶II合成延伸超过所述成熟mRNA的3'末端的前体RNA。的成熟RNA的末端cotranscriptionally生成的，在由RNA序列决定的一个部位，通过裂解复合物的内切核酸酶的活性。在这里，我们详细研究裂解反应在体外的方法。
Abstract
哺乳动物mRNA的3'末端不被由RNA聚合酶II（RNPII）突然终止转录的形成。相反，RNPII合成前体的mRNA之外的成熟RNA的末端，内切酶活性的主动过程，需要在特定的位点。前体RNA切割的CA二核苷酸后通常会发生10-30个核苷酸下游的共识polyA位点（AAUAAA）。从裂解复合物，约800 kDa的多因子蛋白复合物，蛋白质完成这个特定的核酸酶活性。特定的RNA序列的上游和多聚A位点的下游控制裂解复合物的募集。紧接在切割后，mRNA前由聚腺苷酸聚合酶（PAP）多聚腺苷酸化，以产生成熟的稳定的RNA消息。
一种RNA转录物的3'端的处理可以使用移动的核提取物与特定的放射性标记的RNA底物进行研究。总之，长32 </ SUP> P-标记的未裂解的前体RNA被孵育体外核提取物和裂解是通过凝胶电泳和放射自显影评估。当适当的切割发生在较短的5'裂解产物进行检测和定量。在这里，我们描述了裂解分析法详细使用，作为一个例子，对HIV-1的mRNA的3'末端加工。
Introduction
最成熟的真核生物的RNA消息（mRNA的）的生物合成需要几个转录后修饰，如封盖，剪接和多聚腺苷酸化。这些修饰通常耦合，以确保正确的处理1，并强烈增加mRNA的稳定性。
由聚（A）聚合酶（PAP）2-4 3'哺乳动物预mRNA的末端形成由新生RNA，随后加入腺苷酸残基到5的内切核苷酸裂解产生'裂解产物。在哺乳动物中，断裂是由多组分蛋白复合物完成约800 kDa的，是组装在特定的预RNA序列。所述聚（A）信号序列，一个高度保守的典型六核苷酸序列AAUAAA，引导切割位点在约10-30个核苷酸的下游。这个网站是专门由切割和多聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）及73 kD的亚基确认CSPF包含内切核酸酶的活性。裂解刺激因子（CSTF）结合更加堕落GU-或U丰富的元素序列中的poly（A）位点下游。还需要裂解是哺乳动物裂解因子I（CFIM）和哺乳动物裂解因子II（CFII）。 CFIM结合上游序列中的元素（使用）的具体UGUA（N）的网站，已经被定义为一些基因，似乎参与重要的生理过程5-8。
在体外实验中 ，RNA加工反应通过使用放射性标记的RNA底物9-12常用分析。这些可以通过从噬菌体启动子的T7或SP6失控转录来合成。当研究一种多聚腺苷酸化位点尚未之前其特征在于，它需要使用的基因组DNA，而不是基因产生的RNA底物，作为重要的下游序列中可能不存在于cDNA的。设计底物，包括至少150个核苷酸upstrea米和50从上成熟的mRNA切割位点/结束nt的下游。裂解产物迁移比基材快;然而，因为其他片段可以通过非特异性核酸酶作用而生成的，该反应的特异性具有由其上的正确处理的信号序列依赖性进行验证。因此，RNA底物具有在AAUAAA序列（ 例如，AAGAAA）的点突变可作为阴性对照的裂解反应。
由于少量的放射性标记的RNA被用于裂解反应中，存在于高丰度在大多数核提取核糖核酸酶可以是有问题的，并限制对提取物的制备起始材料的选择范围。 HeLa细胞中往往含有内源性核糖核酸酶水平低，因而在这些测定中表现良好。
在RNA底物在体内和体外的信使核糖核酸是紧接着的poly（A）另外，周四S中的裂解的中间不存在可检测量。因此，研究一个特定的RNA序列或涉及的裂解反应的蛋白质，实验是在防止多聚腺苷酸化的发生条件进行。有乳沟的多聚腺苷酸化无依赖性，反之亦然，所以人能阻止多聚腺苷酸化而不伤害裂解反应。因此，ATP被替换为缺少3'羟基基团，以便只有一个单核苷酸可以在多聚（A）位点被结合并可以被检测到刚切割的RNA链终止类似物。
由于复杂性和这种类型的检测的特殊性程度高，我们描述了一个详细的视频协议由前体mRNA的体外切割/聚（A）机械研究核酸内切裂解。我们描述了如何准备主管核提取物，产生放射性标记的RNA底物，进行裂解反应，并分析和解释结果ING产品。 图1显示了HIV-1的前mRNA的3'末端也可以用于裂解分析法进行编码的RNA底物的例子。艾滋病毒RNA基因组的3'端是由许多重要的调控序列，如聚（A）位点，一个G+ü丰富的地区，以及使用的元素，这些都是必要的病毒mRNA转录13高效成熟。在这个例子中，我们所期望的输入RNA底物为338 nt的，一经裂解237 nt的。如果多聚腺苷酸化被允许发生，产品一抹黑将237和437个核苷酸之间被观察到。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1，适应贴壁细胞悬浮成
（这是可选步骤。悬浮细胞通常做出更好的核提取物，但是也可以使用在平板上生长的细胞。）
- 适应贴壁细胞使用Joklik改性的MEM补充有5-10％新生小牛血清或胎牛血清和1％L-谷氨酰胺生长在悬浮液：青霉素 - 链霉素。繁殖细胞转瓶在37℃的过滤器盖，用8％的CO 2。
- 当适应细胞，开始用100毫升的500毫升旋转瓶中。保持最小的0.3×10 6个细胞/ ml并更换培养基，直到正确的生长率达到（通常是2-6周）每1-2天。改编后，HeLa细胞悬浮液中应该增加一倍，大约每24小时注：在适应阶段，这将需要一些时间使细胞恢复正常的速度加倍。
- 维持细胞在书房在所希望的最终体积0.5-0.8×10 6个细胞/ ml SITY（通常为1-10升）
- 电池通常收获对数中期（约0.5-0.65×10 6个细胞/ ml和> 90％存活）。使用适当尺寸的旋转烧瓶对于培养基的所需量。
2。核提取物
- 缓冲液和试剂制备
注意：提取物中执行以下的改性迪格纳穆等人 （1983）14核提取过程。- 准备1X磷酸盐缓冲液，缓冲液A，缓冲液C，并继续进行提取，并储存于4°C。前缓冲液D（ 表1），后天白天
注：较高的收益率一般都实现了与新配制的缓冲液;然而，缓冲器可稳定数周。重要的是，所有的缓冲液，装置和设备是预冷却和保冷的提取物的全部。使用冷室的许多步骤可能和/或保留一切冰上。临用前加入DTT和PMSF。
- 准备1X磷酸盐缓冲液，缓冲液A，缓冲液C，并继续进行提取，并储存于4°C。前缓冲液D（ 表1），后天白天
- 收集和洗涤细胞
- 在与摆动或固定角转子的离心倾细胞到4250毫升锥形瓶和自旋，在500×g离心5分钟，在4℃下。倒出上清液，加入另一个250mL细胞培养液中，以每瓶。重复旋转，直到所有的细胞已被沉淀。
- 重悬在总共250毫升冰冷的PBS和游泳池结合最终沉淀成一个可容纳250毫升锥形瓶中。在吊桶式离心机旋转的细胞在400×g离心10分钟，在4℃下。
- 倒掉上清，重悬细胞沉淀在冰冷的PBS所以总容积不超过50毫升通过移液并转移至50ml离心管松开沉淀。
- 在吊桶式离心机再次旋转细胞在500×g离心6分钟，在4°C。倒掉supernatanT和估计，并注意细胞沉淀体积（CPV）尽可能准确。使用水在一个单独的匹配管，为了比较，如果颗粒是比在管的容积标记为低。
- 细胞裂解
- 加入DTT缓冲A.重悬采用5卷的估计志愿军的颗粒在缓冲液A。移液器打破了颗粒和在冰上孵育10分钟。
- 在吊桶式离心机旋转的细胞在931×g离心10分钟，在4℃下。
- 小心吸出上清液代替滗析。沉淀量应有所增加大约2倍的尺寸，由于细胞的肿胀。
- 添加1 CPV缓冲液A到细胞中。轻轻地打破了沉淀并除去一小等分（约50微升）在冰上离心管。转移的悬浮细胞置于适当大小的Dounce匀浆（通常为15毫升（ml））在冰上冷却。
- 裂解细胞与B型12-15缓慢但稳定的招（TIGHT）杵。删除一个小等分裂解液和一个显微镜完全裂解（完好的小暗核相比，肿胀的细胞）通过台盼蓝染色下检查。完整的细胞将被清除）。继续匀浆，直到90％溶解达标，停在这里，过douncing可能产生负面影响的核提取物的质量。
- 裂解物转移到超白光超速离心管中，并注意总体积。通过称量试管和自旋在1069×g离心10分钟，在4℃下平衡
注：该超速离心机是用在此步骤中，尽管低纺丝速度，因为相同的管道将在更高的速度在接下来的步骤进行纺丝。此自旋将产生一个相当紧密的颗粒覆盖所述管的底部与多云上清液以上，其可被收集并用于胞质S100提取物。如果有，在管的顶部可见脂质层，它可以被除去。 - 小心地用移液管除去上清液，并将其传输到anoth。呃管避免干扰核颗粒注：这将是重要的是知道，以确定包装的核体积（PNV）上清液的最终体积。
- 核提取物的制备
- 一旦上清液被小心地去除，重制的粗核抽提物沉淀在25453×g离心15分钟，在4℃下在同一管中。
- 除去剩余的上清液（应该是少量透明液体），并将其添加到先前的上清液收集。测量上清液的终体积。通过从原始的溶胞产物的总体积中减去这个量计算PNV前面所指出的。另外，如果颗粒足够大时，它的体积可通过与水相似的体积在相同的管相比较，估计。
- 加入缓冲液C（细胞以大约1毫升/毫升）1 PNV体积。小心撞出颗粒用枪头和转移到适当SIZED Dounce匀浆。如果使用与以前相同的匀化器，预先清洗的匀浆，用无菌去离子水。
- 通过重悬采用紧杵一个Dounce匀浆用〜5-10招沉淀。
- 转移核匀浆裂解液成冷冻管并通过倒置在4℃下搅拌30分钟如果体积够大，搅拌用磁力搅拌板和旋转酒吧。
- 转移溶解物到一个新的超白光离心管中并旋转在25453×g离心30分钟，在4℃下粒料应紧凑。约5分钟的自旋之前完成时，水合具有适当的分子量截断（MWCO）的透析盒或管（ 例如，7000 kDa的）。
- 用移液管从管中取出上清液（核提取物）成冰锥形管，然后进行透析。
- 透析
- 注入提取物为水合透析的磁带，每个制造商指示和透析的核提取物在500ml缓冲液D 50为1小时，在4℃下进行搅拌。
- 更换缓冲液用500毫升新鲜，冰冷的缓冲液D 50和透析额外4小时，在4°C。这4小时步骤可以代替分裂成两个2小时的变化。
- 从透析盒中取出提取并转移到冷冻管。旋转的提取物进行5分钟，在1500×g离心在4℃下
- 分装成提取物冷藏，Eppendorf管和急速冷冻在液氮（每等分50-100微升）。储存于-80℃以备将来使用。
3，RNA探针的合成
- 模板制备
注意：用于转录的模板可以是PCR片段或包含T7或SP6启动子的上游和紧邻所需探针序列的质粒。质粒模板必须进行线性化诠释的模板序列的下游erest。我们注意到较高的收益率从PCR的模板。- 该T7/SP6启动子可以在PCR反应过程中被插入。设计了正义引物与靶序列的T7/SP6启动子上游。
- 通过使用高保真聚合酶按照生产商的指示PCR扩增的模板，每2-3反应所需的序列。
- 结合等效反应和通过凝胶提取纯化。
- 序列的PCR产物，以验证模板的精度。 （可选）
- 转录的RNA用32 P标记
- 进行体外转录从1微克模板与市售的试剂盒是兼容的启动子（SP6或T7）进行了以下修改。使用1微升新鲜3000次/毫摩尔[α-32 P] UTP，0.5微升10毫冷双绞线，0.1微升的10mM GTP，和0.9微升10毫M7G（5'）PPP（5'）好核糖核酸盖在20μl的最终体积。
注：G-CAP提高了RNA转录的核提取物的稳定性（帽：GTP）10:1的比例。冷UTP被添加，以防止32 P-UTP被限制试剂。 - 合成的RNA的大小梯子作为上述表示没有对G帽。商业模板可用于产生RNA的大小标记。
- 孵育转录反应在37℃1小时（用于SP6使用40°C）。一旦完成，于37℃进行15分钟的模板DNA酶消化
- 下面的消化，加1微升0.5M的EDTA和5μl上样缓冲液II的RNA底物。加入20微升上样缓冲液II的标记。
- 加热所述RNA标记物和探针在95℃下进行3分钟，然后放置在冰上。
- 进行体外转录从1微克模板与市售的试剂盒是兼容的启动子（SP6或T7）进行了以下修改。使用1微升新鲜3000次/毫摩尔[α-32 P] UTP，0.5微升10毫冷双绞线，0.1微升的10mM GTP，和0.9微升10毫M7G（5'）PPP（5'）好核糖核酸盖在20μl的最终体积。
- 聚丙烯酰胺凝胶铸造/探头电泳
- 准备1升6％聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）混合和400ml 10％的页面。使6％，混合150ml的40％的19点01分的丙烯酰胺：双 - 一crylamide用100毫升10X的Tris /硼酸/ EDTA（TBE）的和460克尿素。带来高达800毫升无菌去离子水中，并搅拌加热板上，同时施加热量低（约50-80℃）。完成至1 L去离子水。
注：该反应是吸热的。加热促进了尿素的溶解。只要尿素溶解除去热源并把该溶液至1L去离子水。在室温下可替换地搅拌过夜;过多的热量可以引发聚合反应。 - 从光铝箔和储存在室温下保护PAGE组合。页面混音可以提前准备的时间和稳定数月。
- 双丙烯酰胺中加入40ml 10×TBE和184克尿素：通过结合将100毫升40％的19点01分的丙烯酰胺的制备400毫升10％PAGE组合。尿素溶解后，调出到400ml的去离子水中。
另外，准备一个20％19:1丙烯酰胺溶液和10％的丙烯酰胺溶液无线个缓冲和尿素只;然后这些可以以任意比例混合，得到在0到20％的任何百分比;尿素总是慢溶解。 - 制备10-50毫升的无菌去离子水中的10％过硫酸铵（APS）溶液取决于凝胶待铸造的数量。
- 用70％乙醇（乙醇）洗为20cm×22厘米玻璃凝胶板。干大无绒抹布。
- 用1毫升5N的氢氧化钠（NaOH）洗涤定期板，然后再洗，用70％的乙醇。大衣的缺口板与饱和小的Kimwipe擦板凝胶击退硅化的解决方案。
- 通过将普通平板上的一个空的枪头盒或一块泡沫塑料，从表中清除的一面朝上举起它组装板。放置在每个长边的边缘0.4毫米垫片。
- 小心地将切口板通过隔板，使涂布面将在凝胶的内部。用剃刀或其他瘦身仪转移隔板为在凝胶板的底部和侧面齐平对准，然后固定带在凝胶板在隔板的每一侧上的粘合剂片段。
- 通过将15毫升10％和6％在每一个50ml管中混合，制备加入30ml每凝胶8％PAGE组合。快速添加300微升10％的APS接着加入30μl的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED），以8％的凝胶组合。
注：合适的凝胶百分比个别探头尺寸应该由实验者选择。 - 盖和倒置2x和将溶液倒入凝胶板的缺口区域。请务必用手稍垫高板和保持均匀的倒入，直到页面结构开始滴落的底部出来。
- 降低板回水平，并立即插入大8孔矩形梳子0.4毫米×20厘米的凝胶。底部附近的小气泡不会影响运行，但应在孔中无气泡。
注：<在凝胶的底部和顶部见下表/ STRONG>地点纸巾浇注过程中捕获的任何泄漏。 - 允许PAGE组合，聚合至少30分钟。
- 聚合凝胶转移到冷藏室和组装电泳仪。加冷TBE缓冲液在上下腔填充线。
- 取出梳子，用剃刀，以消除任何碎片。设置在凝胶中的装置和使用的粘合剂夹持有板的密封。添加冷TBE至顶室，直到它流进板。
- 用30ml的洗井syringe/21摹1-1/2“针之前，为了加载标记的RNA底物充满冷TBE。放置在铝板与玻璃的背面运行时均匀分布的热量，以帮助。
- 负载3微升的标记和单独的孔中的每个RNA底物的整个25μl的逆转录反应的。留下好同样大小的成绩单为p之间r事件交叉污染。在加样缓冲液溴酚蓝和二甲苯青染料可以用来估计大小迁移到凝胶上。
- 运行该凝胶在恒定的瓦数适合的RNA探针（ 例如 25瓦 特2小时为600个核苷酸的探针）的大小。
- 准备1升6％聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）混合和400ml 10％的页面。使6％，混合150ml的40％的19点01分的丙烯酰胺：双 - 一crylamide用100毫升10X的Tris /硼酸/ EDTA（TBE）的和460克尿素。带来高达800毫升无菌去离子水中，并搅拌加热板上，同时施加热量低（约50-80℃）。完成至1 L去离子水。
- 标记的RNA提取和纯化
- 电泳后，小心地排出凝胶装置的顶室中。大部分放射性将在凝胶和底室;然而，上部缓冲可能含有一些放射性物质。
- 使用托盘运输凝胶，如果移动到另一个放射性物质的工作区。小心拉动凸片侧向远离凝胶取出垫片。
- 轻轻分开的平板。凝胶应该坚持，这不是硅化板。将一块保鲜膜在凝胶和玻璃板。
- 广场上的塑料glogos autorad标志贴在包装的ARE一个很清晰的任何样品的凝胶。
- 在黑暗的房间将一块放射自显影胶片在整个板暴露至少1分钟。发展电影。
- 将开发薄膜上的光的表面。然后将凝胶的塑料侧面朝下放在膜和对齐从凝胶中autorad标记，以在胶片上的曝光指标。一旦对齐，用黑色标记，以纪念在玻璃上所需带的位置。
注意：可替换地，以下面的方式切出的RNA条带对齐凝胶/膜。在漆黑的房间，将凝胶包裹放在桌子上，将薄膜在它的上面，并把录像带（或书籍等）上的一片片的顶部。弗里克灯的开关在房间内短暂，那么请关闭电源。这将“预闪”薄膜产生在胶片上的各孔的轮廓，由于从光上顶盒提供的压力和/保护。这可以很容易地对准在凝胶上的薄膜，切所述频带，而无需使用荧光标记物。 - 小心地取下保鲜膜，用新鲜的手术刀或剃须刀每个RNA底物，并从凝胶切除乐队，并放入单独的1.7毫升离心管。洗脱过程中使用章动器的温柔的风潮。
- 加入500μl的RNA的洗脱缓冲液（0.5M乙酸铵，10毫摩尔MgCl 2，1mM的EDTA，0.2％SDS）中，每管。短暂离心淹没凝胶片段。在室温下孵育在黑暗中3-16小时，取决于探头的尺寸。
- 传输整个500μl的洗脱材料的进新管中。避免传输任何凝胶块，因为他们将与净化干扰。加入1μl糖原（20毫克/毫升）一起加入500μl冷的，酸性的酚 - 氯仿（用于RNA）的。
- 简言之旋涡，溶液应出现混浊。旋在室温下以最快的速度（〜16,000×g离心）5-6分钟。
- 仔细跨FER的顶部（水溶液层）到新管中收集尽可能多的同时避免从相间任何碎屑。加氯仿等量的转移水层。重复步骤3.4.10和转移的顶部（水溶液层）到一个新的试管中。加入1 ml冰冷的95％-100％EtOH中收集到的材料。孵化在-80°C下10分钟。 注意：该RNA可以储存过夜，如果需要的话。
- 沉淀的RNA 30分钟，在16000×g离心在4℃下小心倒出上清液到放射性废物容器中，加入1 ml冰冷的70％，分子级乙醇每个颗粒。
- 沉淀的RNA在16000×g离心15分钟，在4℃，倒出上层清液，再旋转1分钟，并通过移液管除去任何残留的EtOH中，在室温下用盖打开，以允许对任何剩余的EtOH中蒸发留下。
- 悬浮颗粒在20-30微升不含RNA酶的水。标记的RNA可被存储于-80℃。
注：一种放射性测量仪，应使用在整个提取过程，以验证该标记的RNA尚未在任何步骤中丢失。
- 定量标记的RNA的mRNA前体的3'mRNA的裂解反应
- 近似使用以下步骤的裂解底物的摩尔浓度。
- 取，例如，1微升的3000次/毫摩尔[α-32 P] UTP和10毫居里/毫升。 （在标签基准日，该储备液的化学浓度将3.3微米的UTP。该日期之前，它是更高的，一个半衰期（〜13日）是〜1.6 mm等日期后）的标记最终反应浓度UTP贡献是当最终冷UTP浓度高于超五类K M是用于一般可以忽略不计。在T7 RNA聚合酶K M的双绞线是114毫米15。
- 稀释1μl，以39微升的水。再加入1微升的稀释[α-
- 稀释1μl的各标记的RNA底物为单独的小瓶中，在先前的步骤中所用闪烁液的量相等。确保有只闪烁液来计算背景小瓶。在闪烁计数器中定量放射活性。
- 40乘以每分钟（CPM）的计数为[α-32 P] UTP样品因素，在初始稀释并减去单独的闪烁液中获得的背景。由无RNase的水的量（20-30微升）乘以每个RNA探针的计数用于重悬在RN一个探头。这给出了纯化的RNA的总的cpm。
例如：最大CPM =（CPM [α-32 P] UTP -背景）×40标记的RNA样品1 =每 分钟20,000×20 = 400000 CPM（如果用于悬浮20微升） - 如果使用的金额不可超过1微升[α-32 P] UTP的其他制作笔录，然后乘以CPM为[α-32 P]这个因素量为[α-32 P] UTP的最后CPM由所使用的量双绞线样品。
例如：2微升[α-32 P] UTP的是用来制造的成绩单。计算出每分钟1微升[α-32 P] UTP为500,000 CPM。乘500,000 * 2 = 1,000,000 CPM - 通过计算CPM为[α-32 P] UTP单独划分计算标记的RNA CPM。这将大致估算标记的UTP注册成立的百分比。
例如：400,000 / 1,000,000 = 0.40或40％注册 - 因为酶不能同位素区分，标记和未标记的UTP的相同百分比掺入到RNA的转录过程。计算冷双绞线的摩尔数被添加到转录反应（0.5微升的10mM溶液= 5.0×10 -9摩尔双绞线的）的量。
- 通过掺入的百分比（从热双绞线上述计数已知）乘以在该反应的摩尔数双绞线，然后除以尿苷中的RNA序列的数目。
例如：5.0×10-9摩尔的UTP的X 0.40 = 2×10-9摩尔的UTP
每成绩单2×10 -9摩尔的UTP / 73 U = RNA为2.7×10 -11摩尔的 - 通过将回收的RNA重悬浮溶液的体积转换的RNA的摩尔数，以摩尔浓度。
例如：RNA / 20微升= 1,370 nM的RNA 2.7×10 -11摩尔的。为从约1微克线性制成的T7 RNA聚合酶的转录美化版质粒并重新悬浮于20μl水中，在200至1,400 nm的值是典型的。
注意：RNA的摩尔浓度使用，以确保在体外裂解反应的最终前体mRNA底物浓度是每裂解反应小于5nm。切割效率会降低，如果RNA浓度显著以上5 nM的提高。
- 近似使用以下步骤的裂解底物的摩尔浓度。
4。3'mRNA的降解反应
- 裂解反应试剂制备
- 准备好所有需要的裂解反应的试剂。使10％的聚乙烯醇（PVA）由开水，慢慢加入聚乙烯醇粉末的正确的金额。 10％的PVA会粘稠，需要时间来溶解。储存在室温下或-20℃。
- 准备1M的磷酸肌酸（CP）和储存在-80°C。使用1M的CP是小于4个月大是很重要的。
- 准备1 M DTT和存储于-20℃。做只是之前做的裂解反应新鲜的0.2 M DTT从1 M DTT稀释。
- 制备ETS（裂解终止液）的10mM Tris pH值7.8，10mM的EDTA，0.5％SDS中。在室温下储存。
- 裂解反应
- 加热该标记的RNA以80℃加热2分钟，然后放置在冰上。
- 然后振荡，然后旋10％的PVA以最快的速度为2-3分钟，以去除气泡。
- 主结构1：对于单个反应，结合3.125微升10％的PVA，0.625微升1米的CP，0.25微升0.5M的氨酰tRNA，0.125微升100毫米的dATP，0.13微升40 U /μLRNA酶抑制剂，0.25微升0.1M的EDTA的pH值8 ，0.1微升的0.2M DTT和0.645微升不含RNA酶的水。免除5.25μl反应混合液1每管上的冰。
- 预混2：使用核提取物的浓度超过2毫克/毫升高6.25微升/反应。核提取物可以用缓冲液D 50，如果稀释东东DED。
- 结合6.25微升核提取物与先前免除5.25μl反应混合液1。加入1μl的稀释到50纳米标记的RNA底物。可选地，RNA可以被包括在主结构1，只要它的RNase抑制剂，DTT和tRNA 注后添加：使用<5 nM的标记的RNA底物的。
- 然后振荡和快速旋转每个样品以去除气泡。孵育在30℃达2小时，但应以获得最佳效果进行了时间过程。再孵育会增加背景退化。
- 蛋白酶K消化及纯化
- 从火上移开样品，并添加182.5微升ETS终止液到每个反应。加入5微升20毫克/毫升蛋白酶K孵育的样品在37℃下10分钟。
- 通过加1体积（200微升）酸苯酚-氯仿，1/10体积（20微升）的3M氢氧化钠提取RNA酯，乙酸和1微升20毫克/毫升糖原。继续在部分3.4.9-3.4.14描述提取。
- 一旦RNA提取完成后，一定要删除所有残留的乙醇。重悬沉淀在8μl上样缓冲液（90％甲酰胺，10毫米EDTA，用溴酚蓝（BFB）（和或二甲苯蓝蓝））。样品可以贮存于-80℃或进行凝胶电泳。
- 裂解反应电泳
- 准备如前节3.3.1-3.3.17了一些修改说明6％的丙烯酰胺凝胶。使用20厘米×42厘米测序凝胶板与每边长2长尾夹。使用32孔梳，并准备40毫升凝胶组合。
- 加载凝胶用3微升标记物和5μl各样品。根据预先裂解和裂解产物长度优化电泳设置。
- 当电泳完成后，请按照章节3.4.1-3.4.3 </ strong>来拆卸凝胶。代替保鲜膜，切成一片滤纸，凝胶板的大小，小心地将其放置在暴露的凝胶的一侧。
- 按滤纸牢牢凝胶上，然后翻转的板，使滤纸上的底部和玻璃是在顶部。用力按下玻璃放在桌子上，以确保凝胶夹持滤纸均匀。
- 慢慢剥下滤纸，它应该有连接到它的凝胶，从短端部之一，直到所有的滤纸与凝胶附着的从玻璃板上取下。
- 覆盖外露的凝胶一边用保鲜膜。用胶带将保鲜膜滤纸。
- 将凝胶上的凝胶干燥机与过滤器面朝向真空侧。干燥15分钟或直到凝胶完全干燥。
注：如果凝胶烘干机不可用，透视膜可以用于可视化的RNA条带。曝光应以二极管灯进行叔紧卡带集约化屏在-80°C。曝光时间是根据经验确定的。注意：低百分之丙烯酰胺凝胶可能破裂后结冰。 - 该凝胶现在可用于曝光胶片，或与磷酸化成像器使用。曝光时间取决于标记的RNA的实力。最初24小时暴露可能被使用。如果使用膜，暴露在-80℃下用集约化屏幕，并允许升温至室温显影之前。
- 测量每个样品中切割和未切割的RNA之间的比值来定量切割效率。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
将RNA的poly（A）的HIV-1的部位（ 图2）的裂解试验的代表性结果。我们可以观察到的未裂解的RNA底物，它是最慢迁移带在凝胶的顶部。具体的裂解产物是运行在上面的预期大小的凝胶更快最激烈的较短片段的带，并且是从mutpoly（A）的控制，其中包含多聚腺苷酸序列（mutPolyA）+ RNA的点突变的裂解测定法特别缺席基材。输入基板的降解产物有时可观察到。裂解活性的定量可以通过未切割到切割RNA归的未切割RNA的100％比例的密度计的情节来确定。
的艾滋病毒预图1。示意图mRNA的3'末端加工的基板，并在体外切割和多聚腺苷酸化反应的预期产物。的切割位点，在双核苷酸CA-，在于25个核苷酸的多聚腺苷酸位点AAUAAA下游。 LTR区：U3（独特的3'序列），R（重复序列），和U5（独特5'序列）。
图2（A）聚（A）位点切割。含有HIV-1的聚（A）和聚（A）信号，即取消裂解（mutPolyA）的点突变32 P标记的RNA孵育在核提取物的HeLa-S3细胞或BSA作为阴性对照。粗体箭头表示5'解产物。的3'片段常常跑出凝胶或劣化的，并不总是可见的（B）的裂解活性状况的光密度积TY表示为未切割到切割RNA标准化为未裂解RNA的100％的比率。
| 缓冲液A（100毫升） | 的10mM Tris（pH值7.9），1.5毫摩尔MgCl 2，10mM的氯化钾，0.5mM的二硫苏糖醇（DTT）。 | 加入DTT在提取过程中使用缓冲液A前夕。加入1μl的1 M DTT每1ml缓冲液A的 |
| 缓冲液C（50毫升） | 的20mM Tris（pH值7.9），25％（V / V）甘油，0.42 M氯化钠，1.5毫摩尔MgCl 2，0.2mM的乙二胺四乙酸（EDTA），0.5mM的DTT，0.5 mM的苯基甲基磺酰氟（PMSF）。 | 添加蛋白酶抑制剂混合物片剂提取的早晨。 |
| 缓冲液D 50（2-4升） | 的20mM Tris（pH7.9），20％（V / V）甘油，0.2毫摩尔EDTA，0.5mM的DTT，50mM的硫酸铵。 | HEPES-KOH可以在缓冲液A，C和D取代的Tris |
| 0.5M的amonium乙酸酯，10毫摩尔MgCl 2，1mM的EDTA，0.2％十二烷基硫酸钠（SDS） | 在室温下储存。 | |
| 挡车器（ETS） | 的10mM Tris（pH值8.0），10mM的EDTA，0.5％SDS中 | 在室温下储存。 |
| 乳沟上样缓冲液 | 90％甲酰胺，5mM EDTA的pH值为8，0.025％溴酚蓝 | 储存在-20℃。 |
表1组成的缓冲区。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
体外前体mRNA 3'裂解反应，在HeLa细胞核提取物或从这些提取物分馏裂解因素进行，使识别的核心裂解因素，其主要复合物16-21。许多与这些因素相关的更多的蛋白质最近已确定了22个，并在体外的反应可能会继续阐明这些蛋白是如何有助于反应轻。也许是因为在体内的反应似乎是cotranscriptional 23，或者是因为一些影响因素可能提取和透析过程中丢失时，效率往往较差，且很少超过30％的裂解实现。此外，反应效率可能会突然从天降到一天没有明显的原因。因此，要明白这些步骤是最关键的，试图适应反应来改性或病毒感染的HeLa CEL，特别是当它是重要的LS，其他细胞类型或新的基板。
毫无疑问，该提取物的质量和在体外转录的RNA的新鲜度是最重要的，因为是需要严格无RNA酶的条件下工作。细胞在它们收获萃取时间的健康也很重要。这些细胞应该会出现健康的，他们应该增加一倍，在不到24小时，就应该在或接近数中期，并且应该有几个死细胞或其他不明原因的碎片。明显地，该细胞不应该由支原体或其他细菌的污染。基板不应与过高的比活性，如本可导致明显的降解。
当一个足够大的序列上的切割位点的任一侧上被认为是，和替代多聚腺苷酸化入账，不同聚在人类基因组（A）序列信号的数量无疑超过24个基因的数目25。弱的多聚（A）与细胞比标准HeLa细胞中其他信号序列的组合，可以证明令人沮丧的，并且最好是先使用强基板与新的细胞，或者未改性的HeLa细胞具有潜在薄弱的polyA衬底。
即使经过这么多年的成功运用，仍有与体外 3'裂解反应相关的未成年人的奥秘。例如，为什么是磷酸肌酸需要？已经证明，原来的原因包括它-再生ATP池-无效26。有趣的是，它可以用在核提取物的活性只有部分损失可以省略使用，但逐渐变得更加必要的，因为萃取分馏成用来重新构成反应部分纯化的裂解因素。事实上，磷酸胆碱，另一个小分子与磷酸基团和一个带正电的胺，但有可能在具有反应没有在体内的作用，已经发现比磷酸肌酸，至少在重组反应27更有效。聚乙烯醇是另一种成分的要求是不充分的解释。它被假定为一个群集剂，导致在切割因子浓度的有效增加，但其它拥挤剂，如聚乙二醇，不工作几乎一样好。了解这些因素可能会导致改进的效率，从而使该方法效率较低的细胞类型和RNA底物的延伸，并可能产生线索的各种因素是如何工作的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
SV是感谢来自美国国立卫生研究院K22AI077353和Landenberger基金会的资助。 KR感激来自美国国立卫生研究院（5SC1GM083754）承认资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Celstir flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 position slow speed stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table top centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250 ml conical tubes | Corning | 430776 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal bovine serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-glut:pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M sodium chloride solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium sulfate | Fisher | A702-500 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml |
| 15 ml Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand high fidelity PCR kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% absolute ethanol 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid phenol:chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase inhibitor | Promega | N261B | |
| Polyvinyl alcohol- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable sequencing unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| 20 cm x 22 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| 20 cm x 42 cm aluminum cooling plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| 0.4 mm x 22 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| 0.4 mm x 42 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| 8-well comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| 16-well comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 EA |
| 32-well comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel loading tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μl |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech vacuum pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U.
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S.
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
- Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
