Summary
RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.
Abstract
Memeli mRNA'ların 3 'ucu RNA polimeraz II (RNPII) ile transkripsiyonun sonlandırılması ile ani oluşmuş değildir. Bunun yerine, RNPII olgun RNA'lar ötesinde ön-mRNA sentezler ve endonükleaz aktivitesi olan bir süreç belirli bir site gereklidir. Öncü RNA bölünmesi normalde CA dinükleotidleri sonra konsensüs polyA bölgesi (AAUAAA) aşağı nt 10-30 oluşur. Yarılma kompleks, yaklaşık olarak 800 kDa'lık çok faktörlü bir protein kompleksi, ikinci proteinler, bu özel nükleaz aktivitesi gerçekleştirmek. Belirli RNA sekansları, yukarı akış ve poliA site alt bölünme kompleksinin işe kontrol eder. Hemen bölünmesinden sonra, pre-mRNA stabil olgun RNA mesajları üretmek için poli A polimerazı (PAP) ile poliadenile edilmiştir.
Bir RNA transkriptinin 3 'ucunun radyo-etiketli RNA Processing özel alt-tabakalar ile hücre nükleer özler kullanılarak incelenebilir. Özetle, uzun bir 32 </ Sup> P-etiketli Parçalanmamış öncü RNA, in vitro olarak nükleer ekstreler ile inkübe edilir, ve bölünme jel elektroforez ve otoradyografi ile değerlendirilir. Uygun bölünme oluştuğunda, 5 'kısa bir ürün olarak algılanır ve ölçülür ayrıldı. Burada, bir örnek olarak, kullanılarak ayrıntılı olarak HIV-1 mRNA'ların 3 'ucu işleme bölünme tahlili tarif eder.
Introduction
En olgun ökaryotik mesajı RNA'lar (mRNAlarının) biyosentezi gibi kapatma, yapıştırma ve poliadenilasyonun gibi çeşitli transkripsiyon sonrası değişiklikler gerektirir. Bu değişiklikler genel olarak doğru işlem 1 yürütülmesini sağlamak ve güçlü bir mRNA'nın stabilitesini arttırmak kuple edilir.
3 ', memeli ön mRNA uç oluşumu 5'e adenilat tortularının ilave edildi ve ardından yeni oluşan RNA endonükleolitik yarılmasıyla üretilir' poly (A) polimeraz (PAP) 2-4 ürünü ayrıldı. Memelilerde, bölünme özel ön-RNA dizileri üzerinde toplanır, yaklaşık 800 kDa, ve, bir çok-bileşenli protein kompleksi ile gerçekleştirilir. Poli (A) sinyal sekansı, yüksek oranda korunmuş bir kanonik hexanucleotide sekansı AAUAAA, yaklaşık 10-30 nt alt bölünme sitesi yönlendirir. Bu site spesifik yarılma ve poliadenilasyon özgüllük faktörü (CPSF) ve 73 kD alt ünitesi tarafından tanınanCSPF endonükleaz aktivitesi içerir. Bölünme uyarım faktörü (CSTF) alt poli (A) Alanı daha dejenere GU-ya da U-zengin sekansı element bağlar. Ayrıca memeli bölünme faktörü I (CFIm) ve memeli bölünme faktörü II (CFII) bölünmesi için gerekli olan. CFIm gen bir dizi için tanımlandığı gibidir ve önemli fizyolojik işlemleri 5-8 dahil olmak gibi olmuştur üst dizisi elemanları (kullanım) spesifik UGUA (N) sitelerine bağlanır.
İn vitro olarak, RNA işleme tepkimelerinin genel olarak radyo-etiketli RNA alt tabakaların 9-12 kullanımı ile analiz edilmiştir. Bunlar, bakteriyofaj promotör T7 ya da SP6 ikinci run-off transkripsiyonu ile sentezlenebilir. Daha önce karakterize edilmemiş bir poliadenilasyon sitesi incelenirken, önemli alt dizileri cDNA içinde mevcut olmayabilir gibi, RNA alt tabakanın üretilmesi için, genomik DNA yerine cDNA kullanmak gereklidir. En az 150 nt upstrea dahil tasarım yüzeylerm ve 50 nt aşağısında olgun mRNA üzerinde yarılma sitesi / ucundan. Alt-tabaka bölünme oluşumu daha hızlı göç eder; Diğer parçalar spesifik olmayan nükleaz hareketiyle oluşturulmuş olabilir, çünkü ancak, reaksiyonun özgüllüğü doğru işlem sinyal dizileri üzerinde bağımlılığı ile doğrulanmalıdır. Bu nedenle, AAUAAA dizisi (örneğin, AAGAAA) bir nokta mutasyonu ile alt-tabakalar RNA bölünme reaksiyonu için bir negatif kontrol olarak hizmet etmektedir.
Radyo işaretli RNA küçük bir miktar bölünme reaksiyonları için kullanıldığı göz önüne alındığında, çoğu nükleer özütlerinde de yüksek bolca mevcut RNazlar sorunlu olabilir ve özü hazırlanması için başlangıç malzemesinin seçimi sınırlayabilir. HeLa hücreleri, endojen RNases düşük seviyelerini ihtiva edebilmekte ve bu yüzden, bu deneylerde iyi bir performans göstermektedir.
In vivo ve in vitro RNA substratların endonükleolitik klivaj hemen poli (A) ekleme, Per izlemektedirs bölünmüş ara tespit edilebilir miktarlarda mevcut değildir. Bu nedenle, belirli bir RNA dizisini ya da bir bölünme reaksiyonunda yer alan proteinleri ya da çalışma için, deneyler meydana gelen poliadenilasyon önlemek koşullarda yapılır. Bir parçalanma reaksiyonunu zarar vermeden poliadenilasyona durdurmak böylece hiçbir poliadenilasyonunun üzerinde bölünme bağımlılığı, ya da tam tersi vardır. Bu nedenle, ATP tek bir nükleotid poli (A) bölgesinde dahil edilebilir ve sadece bir RNA klivaj tespit edilebilir, böylece 3 'hidroksil grubuna sahip olmayan bir zincir sonlandırma analogu ile değiştirilir.
Karmaşıklığı ve tahlil bu tür yüksek derecede belirli özellikler göz önüne alındığında, in vitro mRNA öncülerinin ayırma / Poli (A) makine ile endonükleolitik bölünme incelemek için ayrıntılı bir video protokol açıklar. Biz, yetkili nükleer özleri hazırlamak radyoetiketlenmiş RNA alt tabakalar oluşturmak, parçalanma reaksiyonunu gerçekleştirmek ve sonucu analiz etme ve yorumlama nasıl tarifing ürünleri. Şekil 1, bir bölme deneyi için kullanılacak olan HIV-1 ön-mRNA öğeleri içerisinde 3 'ucunda kodlama için alt-tabaka RNA'ların bir örneğini göstermektedir. HIV RNA genomunun 3 'ucu, örneğin poli (A) sitesi, G+ U zengin bölge ve bütün viral mRNA transkriptlerinin 13 etkin bir şekilde olgunlaşması için gerekli olan USE elemanı olarak çok önemli bir düzenleyici sekansların oluşmaktadır . Bu örnekte giriş RNA substrat 338 nt ve bölünme 237 üzerine nt olması beklenir. Poliadenilasyon oluşmasına izin verilir ise, ürün bir yayma 237 ve 437 nt arasında anlamlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Süspansiyon içine yapışan hücreler 1. İntibak
(Bu, isteğe bağlı bir adımdır. Süspansiyon hücreleri genel olarak, ancak plakalar içinde yetişen hücreler de kullanılabilir daha iyi nükleer özler olun.)
- Penisilin-streptomisin:% 5-10 yeni doğmuş buzağı serumu ve fetal inek serumu ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş Joklik değiştirilmiş MEM kullanılarak süspansiyon içinde büyüme için yapışkan hücreler uyum. % 8 CO2 ile 37 ° C 'de bir filtre kapak ile döndürücü şişelere hücreleri yayma.
- Hücreler adapte olduğunda, 500 ml spinner flask içinde 100 ml ile başlar. Minimum 0,3 x 10 6 hücre / ml korumak ve uygun büyüme oranı (genellikle 2-6 hafta) elde edilinceye kadar, her 1-2 gün orta yerine. . Kez uyarlanmış, süspansiyon HeLa hücreler yaklaşık her 24 saat NOT katına olmalıdır: hücreler normal ikiye katlama oranına geri dönmek için adaptasyon aşamasında, biraz zaman alacaktır.
- Bir den de hücreleri korumakİstenen nihai hacim içinde 0.5-0.8 x 10 6 hücre / ml 'versitesi (tipik olarak 1-10 L)
- Hücreler tipik olarak, orta log fazında (yaklaşık 0,5-0,65 x 10 6 hücre / ml ve>% 90 yaşayabilir) hasat edilmiştir. Kültür ortamı içinde arzu edilen miktarda için uygun büyüklükte spinner şişesi kullanın.
2.. Nükleer özler
- Tampon ve Reaktif Hazırlama
Not: ekstraksiyonlar değiştirilmiş Dignam ve diğerleri, aşağıdaki gerçekleştirilir (1983), 14 nükleer ekstre prosedür..- , 1X fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama A, C tampon maddesi tampon ve 4 ° C'de ekstraksiyon ve mağaza ile devam etmeden önce gün D (Tablo 1) tampon
NOT: Yükseköğretim verimleri genellikle taze hazırlanmış tamponu ile elde edilir; Ancak, tampon birkaç hafta kararlıdır. Tüm tamponlar, cihaz ve ekipman ön soğutuldu ve ekstraksiyon bütünlüğü için soğuk muhafaza önemlidir.Mümkün olduğunca çok sayıda adımlar için bir soğuk oda kullanın ve / veya buz üzerinde her şeyi tutmak. Kullanımdan hemen önce DTT ve PMSF ekleyin.
- , 1X fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama A, C tampon maddesi tampon ve 4 ° C'de ekstraksiyon ve mağaza ile devam etmeden önce gün D (Tablo 1) tampon
- Hücreleri Toplama ve Yıkama
- Bir sallanan ya da bir sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g, dört 250 ml 'lik konik şişe içine hücrelerin ve hızlı dökün. Decant yüzer ve her şişeye 250 ml bir hücre kültür ortamı ilave edin. Tüm hücreler topak haline edilene kadar tekrar döner.
- Bir 250 ml konik şişe içine 250 buz soğukluğunda PBS ml havuz toplam kombine son pelet yeniden süspanse edin. , Salıncak kovalı bir santrifüj içinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 xg'de hücreleri dönerler.
- Süpernatantı dökün ve toplam hacmi 50 ml aşmayacak şekilde buz gibi soğuk PBS ile hücre pelletini. Pipetle ve 50 ml konik santrifüj tüpüne transfer ile pelet çözün.
- , Salıncak kovalı bir santrifüj içinde 4 ° C'de 6 dakika boyunca 500 xg'de tekrar hücreleri dönerler. Supernatan kapalı dökünt ve tahmin ve mümkün olduğu kadar doğru hücre pelet hacmi (CPV) unutmayın. Topak tüp üzerinde ses işaretleri daha düşük ise, karşılaştırma için, ayrı uygun bir tüp içinde su kullanın.
- Cell Lysis
- A. yeniden süspanse tahmini CPV 5 hacim tampon A ile pelet tampon DTT ekleyin. Pelet parçalamak ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe Pipette.
- , Salıncak kovalı bir santrifüj içinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 931 xg'de hücreleri dönerler.
- Dikkatle yerine decanting süpernatant aspire. Topak hacmi nedeniyle, hücrelerin şişmesine boyutu yaklaşık iki kat arttı olmalıdır.
- Hücrelere tampon A ile 1 'yi ekleyin. Yavaşça pelet parçalamak ve buz üzerinde bir mikrofüj tüpüne küçük bir kısım (yaklaşık 50 ul) çıkarın. Buz üzerinde soğutulmuş, uygun büyüklükte bir Dounce homojenleştirici (genellikle 15 mi boyut) yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler içine transfer edin.
- Bir B tipi 12-15 yavaş ama istikrarlı vuruş (tig ile lizleyin hücrelerht) pestle. Lizat küçük bir kısım çıkarın ve tripan mavi boyama ile eridiği (dokunulmamış koyu küçük çekirdekler şişmiş hücreleri ile karşılaştırıldığında) bir mikroskop altında incelenmiştir. Sağlam hücreler) açık olacaktır. 90% çözünme sağlanana kadar homojenleştirilerek devam edecek ve burada durdurmak, douncing üzerinde olumsuz nükleer özlerin kalitesini etkileyebilir.
- UltraClear ultrasantrifüjdeki tüpler içine lisat aktarın ve toplam hacmi unutmayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1069 x g tüpler ve spin tartılarak Denge
NOT: aynı tüp, bir sonraki aşamada daha yüksek bir hızda döndürüldü olacaktır çünkü ultrasantrifüj düşük spin hızına rağmen bu aşamada kullanılmaktadır. Bu sıkma toplandı ve sitozolik S100 özleri için kullanılabilmektedir cloudier üzerinde yüzer olan tüpün alt kısmını kaplayan oldukça sıkı bir pelet, verecektir. Tüpün üst görünür bir lipid tabakası ise, kaldırılabilir. - Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve anoth içine aktarmak.. er boru nükleer pelet rahatsız etmemek Not: Bu, paketlendi nükleer hacmi (PNV) belirlemek amacıyla yüzer nihai hacmi bilmek önemlidir.
- Nükleer Özütünün Hazırlanması
- Süpernatant dikkatli bir şekilde kaldırıldı sonra, aynı tüp içerisinde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 25.453 x g'de ham nükleer ekstre pelet respin.
- Kalan Süpernatantı (net sıvı miktarı az olmalıdır) ve önceki yüzer koleksiyonuna eklemek. Süpernatan son hacim ölçün. Orijinal lizat toplam hacminin bu hacim çıkarılarak PNV hesaplayın Daha önce belirtildiği. Pelet yeterince büyük, alternatif olarak, hacmi özdeş bir tüp içinde su benzer hacmi ile karşılaştırarak tahmin edilebilir.
- Tampon C (hücrelerin yaklaşık 1 ml / ml) içinde 1 PNV hacim. Dikkatli bir pipet ile pelet çıkarmak ve uygun bir şekilde si aktarmakzed Dounce homogenizer. Daha önce olduğu gibi aynı homojenieştirici kullanılarak halinde, steril deiyonize su ile homojenleştirici Ön yıkama.
- Sıkı bir havan tokmağı kullanılarak bir Dounce homojenleştirici ile 5-10 ~ darbeleri ile pelet yeniden süspanse edin.
- Soğutulmuş bir tüp içine homojenize nükleer lizat aktarılır ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca ters çevirerek karıştırın Hacmi yeterince büyük değilse, bir manyetik karıştırma plaka ve spin çubuğunu kullanarak ajitasyon.
- Yeni lardan santrifüj tüpü içine transferi ve lisat, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 25.453 x g'de dönmeye Topak küçük olmalıdır. Spin önce yaklaşık 5 dakika tamamlandıktan sonra, uygun bir molekül ağırlığına kesilmiş (MWCO) sahip diyaliz kaseti veya boru hidrat (örneğin, 7,000 kDa).
- Bir transfer pipet kullanarak soğutulmuş bir konik tüp içine tüpten (nükleer ekstresi) çıkarın ve sonra diyaliz ile devam edin.
- Diyaliz
- Üretici göre hidratlanmış diyaliz kasetler içine enjekte özleri 's talimatları ve karıştırılarak, 4 ° C 'de 1 saat süre ile Tampon D 50, 500 ml nükleer özler dialyze.
- 500 ml taze, buz gibi soğuk tampon D ile 50 tampon yerine ve 4 ° C'de ek bir 4 saat boyunca diyalize Bu 4 saat adım yerine iki 2 saat değişiklikleri bölünebilir.
- Diyaliz kaset özü çıkarın ve soğuk tüplere aktarın. 4 ° C'de 1500 x g'de 5 dakika boyunca ekstraktları Spin
- Soğutulmuş, Eppendorf tüpleri içine özleri tablet ve sıvı azot (aliko başına 50-100 ul) dondurma oturtun. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklayın.
3.. Probe RNA sentezi
- Şablon hazırlama
Not: transkripsiyon için kullanılan şablonlar PCR fragmanları, veya bir T7 ya da SP6 promotör üst ve hemen bitişik olan, arzu edilen sekansı ihtiva plazmidler olabilir. Plasmid şablonları int şablonu sekansının alt baş doğrusallaştırılmış olmalıdırerest. Biz PCR şablonlardan yüksek verim kaydetti.- T7/SP6 promoter, PCR reaksiyonu sırasında sokulabilir. Hedef sekansın T7/SP6 promoter yukan ile sens primer tasarımı.
- , Bir hi-fi polimeraz kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre PCR aracılığıyla şablon başına 2-3 reaksiyonlarda, arzu edilen diziyi yükseltin.
- Denk reaksiyonlar birleştirin ve jel ekstraksiyonu ile arıtın.
- Dizisi PCR ürünleri şablon doğruluğunu kontrol etmek için. (İsteğe bağlı)
- 32 P Etiketleme ile RNA Transkripsiyon
- Şu değişiklikler ile promotör (SP6 ya da T7) ile uyumlu olan bir ticari olarak temin edilebilir kit ile şablonun 1 ug in vitro transkripsiyonu sonucunda yapın. Taze 3,000 Ci / mmol [α-32 P] UTP 1 ul 10 mM soğuk UTP, 0.5 ul 10 mM GTP, 0.1 ul ve 10 mM M7G (5 ') ppp (5') G RNA 0.9 ul kullanın 20 ul nihai hacim içinde, toplam kap.
NOT: (: GTP kapak) 10:01 oranı G-kapak nükleer özütlerinde de RNA transkript kararlılığını geliştirir. Soğuk UTP reaktif sınırlayıcı olmaktan 32P-UTP önlemek için ilave edilir. - G kapağı olmadan yukarıda gösterilen gibi bir RNA boyutu merdiveni Synthesize. Ticari şablonları RNA boyut işaretleyici üretmek için kullanılabilir.
- (SP6 kullanım için 40 ° C) 1 saat boyunca 37 ° C 'de transkripsiyon reaksiyonları inkübe edin. Tamamlandığında, 37 ° C de 15 dakika boyunca şablonun DNase sindirim yapmak
- Sindirme işlemini takiben, RNA substratlara 0.5 M EDTA ve 1 ul yükleme tamponu II içinde 5 ul ekle. Markere 20 ul yükleme tamponu II ekleyin.
- 3 dakika boyunca 95 ° C'de RNA işaretleyici ve problar ısı, daha sonra buz üzerine yerleştirin.
- Şu değişiklikler ile promotör (SP6 ya da T7) ile uyumlu olan bir ticari olarak temin edilebilir kit ile şablonun 1 ug in vitro transkripsiyonu sonucunda yapın. Taze 3,000 Ci / mmol [α-32 P] UTP 1 ul 10 mM soğuk UTP, 0.5 ul 10 mM GTP, 0.1 ul ve 10 mM M7G (5 ') ppp (5') G RNA 0.9 ul kullanın 20 ul nihai hacim içinde, toplam kap.
- Poliakrilamid Jel Döküm / Probe Elektroforez
- % 6 poliakrilamid jel (PAGE) karışımı ve% 10 PAGE 400 ml için 1 L hazırlayın. Bis-a:% 6 hale getirmek için,% 40 akrilamid 19:01 150 ml karıştırın10X Tris / borat / EDTA (TBE), 100 ml ve 460 g üre ile akrilamit. Düşük ısı (yaklaşık 50-80 ° C) uygulanması sırasında steril deiyonize su ile 800 ml kadar getirmek ve bir ocak üzerinde karıştırın. Deiyonize su ile 1 L'ye tamamlayın.
NOT: tepkime endotermik. Isıtma ürenin çözülmesini teşvik etmektedir. En kısa sürede çözülür üre gibi ısı çıkar ve deiyonize su ile 1 L'ye bir çözüm getirmektedir. Alternatif olarak, gece boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı; çok fazla ısı polimerizasyon başlatabilir. - Oda sıcaklığında alüminyum folyo ve mağaza ile ışıktan PAGE karışımı koruyun. SAYFA karışımları vaktinden hazırlanan ve birkaç ay stabildir olabilir.
- Bis-akrilamid, 10x TBE, 40 ml ve 184 g üre:% 40 akrilamid 19:01 100 ml birleştirerek,% 10 PAGE karışımı 400 ml hazırlayın. Üre eridikten sonra, iyonu giderilmiş su ile 400 ml'ye getirin.
Seçenek olarak ise, bir 20% 19:01 akrilamid çözeltisi ve% 0 akrilamid çözeltisi wi hazırlamakinci tampon ve üre sadece; Bu daha sonra 0 ile% 20 arasında bir oran vermek üzere, herhangi bir oranda karıştırılabilir; üre her zaman çözmek için yavaş. - Döküm için jellerin sayısına bağlı olarak, steril iyondan arındırılmış su içinde% 10 amonyum persülfat (APS) solüsyonu 10-50 ml hazırlayın.
- % 70 etanol (EtOH) ile 20 cm x 22 cm cam jel plakaları yıkayın. Büyük tüysüz ücretsiz mendil ile kurulayın.
- 5 N sodyum hidroksit (NaOH), 1 ml normal plakayı yıkayın ve daha sonra 70% EtOH ile rewash. Coat doymuş küçük Kimwipe plaka silerek jel repel silikonlaştırıcı çözeltisi ile çentikli plaka.
- Boş bir pipet ucu kutusu veya yukarı bakacak temizlenmiş tarafı ile masaya onu yükseltmek için strafor parçası üzerinde düzenli plaka yerleştirerek levhalarını. Her uzun yan kenarında 0.4 mm aralayıcıları yatıyordu.
- Kaplanmış taraf jelin iç tarafında olacak şekilde dikkatlice aralama üzerinde çentikli plaka yerleştirilir. Kaydırmaya bir jilet veya başka ince bir alet kullanınJel plakaları alt ve yanlarda yaslama hizalama için aralama sonra aralama üzerinde jel plakaları her iki tarafında bağlayıcı klipler ile sabitleyin.
- 15 ml% 10 ve% 6 bir 50 ml tüp içinde, her karışımları karıştırılarak jel başına% 8 PAGE karışımı 30 ml hazırlayın. Hızlı bir şekilde% 8 jel karışımı, N, N, N ', 30 ul, N'-tetra-metiletilendiamin (TEMED) ve ardından% 10 APS 300 ul ekle.
NOT: Bireysel prob boyutları için uygun jel yüzdeleri deneyci tarafından seçilmelidir. - Şapka ve invert 2x ve jel plakaları çentikli alana çözüm dökün. Elle hafifçe plakaları yükseltmek ve PAGE karışımı alt dışarı damlamaya başlar dek bir daha dökmek korumak için emin olun.
- Geri seviyeye plakaları indirin ve hemen 0.4 mm x 20 cm jel için büyük 8-de dikdörtgen tarak yerleştirin. Dibe yakın küçük kabarcıklar çalışan etkilemez, fakat kuyularda kabarcıklar olmalıdır.
NOT: <Jel alt ve üst aşağıdaki tabloda / strong> Yeri kağıt havlular dökme sırasında herhangi dökülmeleri yakalamak için. - PAGE karışım en az 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın.
- Soğuk odaya polimerize jel aktarın ve elektroforez aygıtı monte edin. Üst ve alt bölmelerde üzerindeki dolum hatlarına soğuk TBE tamponu ekleyin.
- Tarak kaldırmak ve herhangi bir enkaz kaldırmak için bir jilet kullanın. Cihazında jel ayarlayın ve mühür levhası tutmak için bir bağlayıcı klip kullanın. Bu plakalar içine akana kadar üst bölmeye soğuk TBE ekleyin.
- 30 mL 'si ile yıkayınız kuyu hemen önce işaretli RNA alt tabakaların yükleme soğuk TBE dolu G 1-1/2 "iğne syringe/21. Çalışırken ısı dağılımını yardım etmek için cam arkasına bir alüminyum levha yerleştirin.
- Işaretleyici ve ayrı kuyularda her RNA alt tabakanın tüm transkripsiyon reaksiyonunda 25 ul of Load 3 ul. P benzer büyüklükteki transkript arasında bir kuyu bırakınRevent çapraz kontaminasyon. Yükleme tamponunda bromofenol mavisi ve ksilen siyanol boyalar jeli üzerinde boyut göç tahmin etmek için de kullanılabilir.
- (600 nt sondalar için 2 saat boyunca örneğin 25 watt) RNA probları boyutu için sabit watt uygun jel çalıştırın.
- % 6 poliakrilamid jel (PAGE) karışımı ve% 10 PAGE 400 ml için 1 L hazırlayın. Bis-a:% 6 hale getirmek için,% 40 akrilamid 19:01 150 ml karıştırın10X Tris / borat / EDTA (TBE), 100 ml ve 460 g üre ile akrilamit. Düşük ısı (yaklaşık 50-80 ° C) uygulanması sırasında steril deiyonize su ile 800 ml kadar getirmek ve bir ocak üzerinde karıştırın. Deiyonize su ile 1 L'ye tamamlayın.
- Etiketli RNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması
- Elektroforezi takiben dikkatlice jel tertibatının üst bölmesini boşaltmak. Radyoaktivite çoğu, jel ve alt odasına olacaktır; Bununla birlikte, üst tampon bir radyoaktif malzeme içerebilir.
- Başka bir radyoaktif malzeme çalışma alanına hareket halinde jel taşımak için bir tepsi kullanın. Dikkatlice yan uzak jelden çıkıntılı parça çekerek ara parçaları çıkarın.
- Yavaşça plakaları ayrı. Jel silikonlu değildi plaka ayrılmamak gerekir. Jel ve cam levha üzerinde plastik wrap bir parça yerleştirin.
- Bir over sarın plastik bir glogos autorad işaretleyici etiket yerleştirinHerhangi bir numune açıktır jel.
- Karanlık bir odada, tüm plaka üzerinde otoradyografi filmin bir parça yer ve en az 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır. Filmi geliştirin.
- Hafif bir yüzeye geliştirilmiş bir film yerleştirin. Daha sonra film üzerine yüzü aşağı gelecek ve film üzerinde maruz markerine jelden autorad işaretleyici hizalamak jelin plastik tarafına yerleştirin. Bir kez hizalanmış, camına istenilen bantların konumunu işaretlemek için siyah bir kalem kullanınız.
NOT: Alternatif olarak, RNA bantları kesip şu şekilde jeller / filmi hizalayın. Karanlık bir odada, bir masanın üzerinde sarılı jel yerleştirin bunun üstüne filmi yerleştirin ve film parçasının üstüne bir kaset (ya da kitap, vb) yerleştirin. Kapalı ise kısaca odada ışık anahtarını Flick, daha sonra açın. Bu, "ön-flaş 'nedeniyle üst kaset içerir ışıktan basınç / koruma için filmin tüm oyuklara bir taslak üreten film olacaktır. Bu sayede jeli üzerinde film hizalamak ve kesme kolaylaştırırfloresan işaretlerini kullanarak olmadan bant dışarı. - Dikkatlice plastik kaplamayı çıkarmak ve her bir RNA alt-tabaka için yeni bir jilet veya neşter kullanmak ve jelden bantları tüketim ve ayrı bir 1.7 ml mikrofüj tüplerine yerleştirin. Çalışma sırasında yumuşak bir ajitasyon Nutator kullanın.
- Her tüpe RNA elüsyon tampon 500 ul (0.5 M amonyum asetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA,% 0.2 SDS) eklenir. Kısaca jel fragmanı batığın santrifüj. Prob boyutuna bağlı olarak 3-16 saat boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin.
- Yeni bir tüp içine akıtılan malzemenin tüm 500 ul aktarın. Onlar arıtma engel olacak şekilde herhangi bir jel parçaları transfer kaçının. (RNA), soğuk, asidik fenol-kloroform ile birlikte 500 ul glikojen 1 ul (20 mg / ml) eklenir.
- Kısaca girdap, çözelti bulanık görünmelidir. 5-6 dakika boyunca en yüksek hızda (~ 16.000 xg), oda sıcaklığında Spin.
- Dikkatle transfer üst (sulu) interfaz herhangi enkaz kaçınarak mümkün olduğu kadar toplama yeni tüplere katman. Aktarılan sulu tabakaya kloroform eşit miktarda ekleyin. Adımı tekrarlayın 3.4.10 ve üst aktarın (sulu) yeni bir tüpe katman. Toplanan malzeme buz soğukluğunda% 95-100 EtOH içinde 1 ml ilave edilir. . 10 dakika NOT boyunca -80 ° C'de inkübe edin: istenirse RNA gece boyunca saklanabilir.
- 4 ° C'de 16,000 x g'de 30 dakika boyunca RNA Pelet Dikkatli bir radyoaktif atık kabı içine süpernatant kapalı dökün ve her pelet buz% 70 moleküler sınıf EtOH 1 ml ekleyin.
- , Süpernatantı dökün 1 dakika boyunca tekrar döner ve pipet ile herhangi bir kalıntı EtOH kaldırmak ve herhangi bir geri kalan EtOH buharlaştırılarak izin vermek için açık kapaklarla oda sıcaklığında bekletin, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16,000 xg'de RNA Pelet.
- RNase-içermeyen su içinde 20-30 ul pelet yeniden süspanse edin. Etiketli RNA -80 ° C'de saklanabilir
NOT: Bir radyoaktif anket metre etiketli RNA herhangi bir adım sırasında kayıp olmamıştır doğrulamak için tüm ekstraksiyon prosedürü boyunca kullanılmalıdır.
- Bir pre-mRNA 3 'mRNA bölünmesi Reaksiyonu için etiketlenir RNA kantitasyonu
- Aşağıdaki prosedürü kullanarak bölünme yüzeylerde molaritesini yaklaşmaktadır.
- Örneğin, 3,000 Ci / mmol [α-32 P] UTP ve 10 mCi / ml 'lik 1 ul al. Etiketli (etiket referans tarihte, bu stok çözeltinin kimyasal konsantrasyonu, bu tarihten önce o ~ 1.6 mM, vs tarihten sonra daha yüksek ve bir yarılanma ömrü (~ 13 gün). 3.3 mcM UTP olacak) Nihai reaksiyon konsantrasyona UTP katkı UTP K m üzerinde bir son soğuk UTP konsantrasyonu kullanıldığı zaman, tipik olarak göz ardı edilebilir. UTP için T7 RNAP K m 114 mm 15 olduğunu.
- Su 39 ul 1 ul seyreltin. Sonra sulandırılmış [1 ul α-ekleyebilir
- Bir önceki aşamada kullanılan sintilasyon sıvısı eşit miktarda ayrı ayrı şişelere her bir işaretli RNA alt tabakanın 1 ul seyreltin. Arka hesaplamak için sadece parıltı sıvısı ile bir şişe var emin olun. Bir sintilasyon sayacında radyoaktivite nicelleştirmektedir.
- Ilk seyreltme faktör ve tek başına parıltı sıvısı ile elde edilen arka çıkarmak için 40 ile [α-32 P] UTP örnek için dakika (CPM) sayım çarpın. RNase içermeyen su miktarı (20-30 ul), her bir RNA için prob sayılarını çarpın RN yeniden askıya almak için kullanılırA sondalar. Bu durum, saflaştırılmış RNA toplam cpm verir.
Örnek:. Max cpm = (cpm [α-32 P] UTP - arka) 40 x Etiketli RNA Örnek 1 = 20,000 cpm x 20 = 400,000 cpm (20 ul yeniden süspanse için kullanıldığı takdirde) - [Α-32 P] UTP 1 ul başka bir miktar transkript yapmak için kullanılan, daha sonra [α-32 P] için cpm çarparak [α-32 P] UTP nihai cpm içine bu hacim faktör Kullanılan miktar ile UTP örneği.
Örnek: [α-32 P] UTP 2 ul transkript yapmak için kullanılır. 1 ul [α-32 P] UTP için hesaplanan kopyaya 500,000 kopyaya. Çarpın 500.000 * 2 = 1.000.000 kopyaya - Yalnız [α-32 P] UTP için hesaplanan cpm tarafından hesaplanan etiketli RNA cpm bölün. Bu kabaca dahil etiketli UTP yüzdesini tahmin eder.
Örnek: 400,000 / 1,000,000 = 0.40 veya% 40anonim - Bir enzim izotoplar ayırt edemediğinden, etiketli ve etiketsiz UTP aynı oranda transkripsiyon sırasında RNA içine dahil edilmiştir. Transkripsiyon reaksiyonu (UTP 5.0 x 10 -9 mol, 10 mM çözeltisi = 0.5 ul) ilave edilir mol soğuk UTP miktarını hesaplayın.
- (Yukarıda sayma sıcak UTP bilinen) dahil oranında reaksiyonda mol UTP çarpın, daha sonra RNA sekansında uridines sayısına göre bölmek.
Örnek: UTP 5,0 x 10 -9 mol x 0.40 = 2 x 10 -9 mol UTP
2 x 10 -9 mol UTP / 73 U transkript başına = RNA 2.7 x 10 -11 mol - Geri kazanılan RNA yeniden süspansiyon çözeltisinin hacmine bölünmesiyle molariteyi RNA mol dönüştürün.
Örnek: RNA / 20 ul = 1370 nM RNA, 2.7 x 10 -11 mol. Yaklaşık 1 ug düz yapılmış T7 RNAP transkript içinplasmid ized ve 20 ul su içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, 200 1,400 nM değerleri tipiktir.
Not: RNA molar konsantrasyonu in vitro parçalanma reaksiyonunun nihai pre-mRNA alt tabaka konsantrasyonu parçalanma reaksiyonunun başına en az 5 nM olduğundan emin olmak için kullanılır. RNA konsantrasyonu önemli ölçüde 5 nM üzerine yükseltildiğinde, eğer klevajı verimliliği azaltır.
- Aşağıdaki prosedürü kullanarak bölünme yüzeylerde molaritesini yaklaşmaktadır.
4.. 3 'mRNA bölünmesi reaksiyonu
- Yarılma Reaksiyon Reaktif Hazırlama
- Bölünme reaksiyonu için gerekli tüm reaktifleri hazırlayın. Kaynar su ile% 10 polivinil alkol (PVA) ve yavaş yavaş yapın PVA tozu doğru miktarını ekleyin. % 10 PVA viskoz olabilir ve çözmek için zaman alır olacaktır. Oda sıcaklığında ya da -20 ° C'de saklayın
- -80 ° C'de 1 M kreatin fosfat (CP) ve mağaza hazırlayın Bu az 4 aylık olduğu 1 M CP kullanmak önemlidir.
- 1 M DTT ve mağaza hazırlayın-20 ° C'de Hemen önce bölünme reaksiyonu yapıyor 1 M DTT taze bir 0.2 M DTT seyreltme olun.
- ETS (bölünme durdurma solüsyonu) hazırlanması: 10 mM Tris pH 7.8, 10 mM EDTA,% 0.5 SDS. Oda sıcaklığında saklayın.
- Reaksiyon Cleavage
- 2 dakika boyunca 80 ° C'ye ısıtın etiketli RNA daha sonra buz üzerine yerleştirin.
- Yavaşça girdap ve sonra kabarcıklar çıkarmak için 2-3 dakika boyunca en yüksek hızda% 10 PVA dönerler.
- Ana Karışım 1: Tek bir reaksiyon için, 3.125 ul,% 10 PVA, 0.625 ul 1 M CP, 0.25 ul 0.5 M tRNA, 0.125 ul 100 mM dATP, 0.13 ul 40 U / ul RNaz inhibitörü, 0.25 ul 0.1 M EDTA, pH 8 kombine , 0.1 ul 0.2 M DTT ve 0.645 ul RNase-barındırmayan su bulunmaktadır. Buz üzerinde tüp başına 5.25 ul ana karışımı 1 dağıtın.
- Ana Karışım 2: 2 mg / ml 'den daha yüksek konsantrasyonlarda nükleer özler 6,25 ul / reaksiyon. Nükleer özler, Tampon D 50 ile seyreltilebilir halinde needed.
- Daha önce ana karışımı 1 5.25 ul tevzi nükleer ekstresinin 6.25 ul bir araya getirin. 50 nM'ye seyreltilmiştir; işaretli RNA alt tabakanın 1 ul ekle. . Kullanımlar etiketli RNA alt tabakanın <5 nM: Seçenek olarak ise, RNA 1 bu RNaz inhibitörü, DTT ve tRNA NOT sonra eklenir koşuluyla ana karışımı dahil edilebilir.
- Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için her örnek vorteks ve hızlı sıkma. Kadar 2 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edilir, ancak bir zaman süreci en iyi sonuçlar için gerçekleştirilmelidir. Uzun inkubasyon arka plan bozulması artabilir.
- Proteinaz K sindirim ve saflaştırılması
- Ateşten örnekleri çıkarın ve her bir reaksiyon için ETS stop solüsyonu 182.5 ul ekleyin. 20 mg / ml proteinaz K içinde 5 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe örnekleri.
- 3 M sodyum asit 1 fenol-kloroform hacmi (200 ul), 1/10 hacim th (20 ul) eklenerek RNA ekstrakteasetat, ve 20 mg / ml glikojen 1 ul. 3.4.9-3.4.14 bölümlerde anlatıldığı gibi ekstraksiyon işlemine devam edin.
- RNA ekstraksiyon tamamlandıktan sonra, kalan tüm EtOH'nin kaldırmak emin olun. (Bromofenol Mavisi (BFB) (ve veya ksilen siyanol Blue)% 90 formamid, 10 mM EDTA) yükleme tamponu 8 ul pelet tekrar. Numuneler -80 ° C'de saklanır ya da jel elektroforezi ile devam edilebilir.
- Yarılma Reaksiyon Elektroforez
- , Daha önce bir kaç değişiklik ile bölme 3.3.1-3.3.17 belirtilen bir% 6 akrilamid jel hazırlayın. Her uzun tarafta 2 bağlayıcı klipleri ile 20 cm x 42 cm dizileme jeli plakalar kullanın. 32-çukurlu bir tarakla ve jel karışımı 40 ml hazırlar.
- Marker 3 ul ve her bir numunenin 5 ul jel yerleştirin. Önceden bölünmesi ve bölünmüş ürünün boyutlarına göre elektroforez ayarları optimize.
- Elektroforez tamamlandığında, bölümler 3.4.1-3.4.3 takip <Jel sökmeye> / strong. Bunun yerine plastik wrap, jel plaka boyutuna filtre kağıdı bir parça kesilmiş ve dikkatli bir şekilde maruz kalan jelinin bir tarafı üzerine yerleştirin.
- Filtre kağıdı alt ve cam üstünde olacak şekilde sıkıca jel üzerine filtre kağıdı basın, daha sonra plaka üzerinde çevirin. Sıkıca jel eşit filtre kağıdı sürükleyici sağlamak için masaya camını bastırın.
- Yavaş yavaş eklenmiş jeli ile filtre kağıdı tüm cam plakadan çıkarılır kadar kısa uçların birinden, ona bağlı jel olması gereken filtre kağıdı, soyun.
- Plastik wrap ile maruz jel yan kapağı. Filtre kağıt, plastik wrap bantlayın.
- Vakum tarafına bakan filtre tarafı ile bir jel kurutucu üzerinde jel yerleştirin. 15 dakika boyunca ya da kuru jel kadar tamamen kurudur.
NOT: Bir jel kurutucu kullanılabilir durumda değilse, X-ışını filmi, RNA bantları görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Çekim bir aydınlatabiliriz içinde yapılmalıdır-80 ° C'de yoğunlaştırma ekranıyla t sızdırmaz kaset Pozlama süresi ampirik olarak belirlenir. Dikkat: Düşük yüzde akrilamid jeller dondurma üzerine çatlayabilir. - Jel şu anda filmi de gösterebilir veya bir fosfo-görüntüleyici ile kullanılabilir kullanılabilmektedir. Pozlama süresi işaretlenmiş RNA gücüne bağlıdır. İlk olarak, 24 saat maruz bırakma kullanılabilmektedir. Film kullanarak ise, yoğunlaştırma ekranı ile -80 ° C 'de ortaya çıkarmak ve önceki geliştirmek için oda sıcaklığına ısınmaya bırakın.
- Bölünme etkinliğini ölçmek için her bir örnek olarak yarılmış ve un-yarılmış RNA arasındaki oran ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA poli (A) HIV-1 siteleri (Şekil 2) bir bölünme tahlili temsil edici sonuçları. Bu jelin üstünde yavaş göç eden bir bant Parçalanmamış RNA alt tabakanın, gözlemleyebiliriz. Belirli ürün, daha hızlı parçalanan beklenen boyutta jelde çalışan en yoğun kısa fragman bandı, ve poliA sekansı (mutPolyA) RNA, bir nokta mutasyon ihtiva mutpoly (A) kontrolü yarılma tahlilinden özellikle yoktur alt-tabaka. Giriş substratın degradasyon ürünleri, bazen gözlemlenebilir. Yarılma aktivitesi miktar tayini Parçalanmamış RNA% 100'e normalize ayrıldı RNA'ya Parçalanmamış oranı densitometrik grafiği ile tespit edilebilir.
Of HIV-ön-Şekil 1,. Şematik olarak gösterilmesimRNA 3 'ucu işlem alt tabakalar, ve in vitro ve poliadenilasyon yarılma reaksiyonları beklenen ürün. parçalanma alanı, öyle ki dinükleotid-CA-, yalan 25 nt aşağısında yer AAUAAA gelen polyA. LTR bölgeler: U3 (özgü 3 'dizisi), R (tekrar sekansı) ve U5 (benzersiz 5' sekansı).
Şekil 2,. (A) Poli (A) bölgeye ayrılması. HIV-1 poli (A) ve bölünme (mutPolyA) ortadan kaldıran, poli (A) sinyali, bir nokta mutasyon ihtiva eden 32P-işaretli RNA nükleer özütlerinde kuluçkalanmıştır Bir negatif kontrol olarak HeLa-S3 hücreleri veya BSA. Koyu mürekkep ile işaretli ok 5 'ayrıldı ürünü gösterir. 3 'fragmanı genellikle jel kapalı çalışan veya bozulmuş ve her zaman görünür değildir. (B) bölünme aktiviteler dansitometrik arsaty Parçalanmamış RNA% 100'e normalize parçalanabilen RNA'ya Parçalanmamış bir oranı olarak ifade edilir.
| Tampon A (100 mi) | 10 mM Tris (pH 7.9), 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, 0.5 mM ditiotreitol (DTT). | Hemen önce ekstraksiyon sırasında tamponu A kullanarak DTT ekleyin. Tampon A içinde 1 ml başına 1 M DTT, 1 ul ekle |
| Tampon C (50 mi) | 20 mM Tris (pH 7.9),% 25 (v / v) gliserol, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), 0.5 mM DTT, 0.5 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF). | , Bir proteaz inhibitörü kokteyl tableti ekstraksiyon sabah ekleyin. |
| Tampon D 50 (2-4 L) | 20 mM Tris (pH7.9),% 20 (v / v) gliserol, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 50 mM amonyum sülfat içerir. | HEPES-KOH tampon A, C ve D'de Tris için ikame edilebilir |
| 0.5 M amonyum asetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA,% 0.2 sodyum dodesil sülfat (SDS) | Oda sıcaklığında saklayın. | |
| Dur Tampon (ETS) | 10 mM Tris (pH 8.0), 10 mM EDTA,% 0.5 SDS | Oda sıcaklığında saklayın. |
| Yarılma Yükleme Tamponu | % 90 formamid, 5 mM EDTA pH 8,% 0.025 Bromofenol Mavisi | -20 ° C'de saklayın |
Tamponlar Tablo 1.. Bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HeLa hücre nükleer özütlerinde veya bu ekstrelerden parçalandı bölme faktörleri ile gerçekleştirilen in vitro pre-mRNA 3 'bölünme reaksiyonu, çekirdek bölünmesi faktörler ve ana komplekslerinin 16-21 tanımlanmasını sağladı. Bu faktörlerle ilişkili daha birçok proteinlerin son zamanlarda 22 tespit edilmiştir ve in vitro reaksiyon bu proteinlerin reaksiyonu nasıl katkıda ışık tutacak devam edebilir. In vivo reaksiyon cotranscriptional 23 gibi görünüyor, ya da bazı faktörlerdir çıkarma ve diyaliz esnasında kaybolmuş olabilir, çünkü verimlilik genellikle zayıftır, ve nadiren% 30 daha fazla bölünme elde edilir olduğu için belki. Buna ek olarak, reaksiyon verimi aniden nedensiz günden güne düşebilir. Bu nedenle, bu adımlar, tadil edilmiş ya da viral olarak enfekte olmuş HeLa cel reaksiyonun uyarlanması teşebbüsünde, özellikle en kritik olduğu takdir etmek önemlidirls, diğer hücre tipleri veya yeni substratlara.
Titizlikle RNase içermeyen koşullar altında çalışmak için ihtiyaç olduğu Hiç şüphesiz, ekstrenin kalitesi ve in vitro transkribe RNA tazelik, büyük önem taşımaktadır. Bu çıkarılması için hasat edilir zamanda hücrelerin sağlık da önemlidir. Hücreleri sağlıklı, onlar en az 24 saat içinde iki katına olmalıdır görünmelidir, onlar veya orta log fazı yaklaşıyor olmalı ve birkaç ölü hücreler veya diğer açıklanamayan enkaz olmalıdır. Açıkçası, hücreler, mikoplazma veya diğer bakteriler ile kirlenmiş olmamalıdır. Substrat bu bariz bozulmaya yol açabilir gibi, çok yüksek bir spesifik aktiviteye sahip yapılmamalıdır.
Bölünme sitesinin iki tarafında yeterince büyük bir sekans olarak kabul edilir ve alternatif poliadenilasyon sorumluydu zaman, farklı poli insan genomundaki (A) sekansı sinyallerinin sayısı kuşkusuz genlerin 24 sayısını aşan 25. Zayıf bir standart poli HeLa hücreleri dışındaki hücreler ile (A) sinyal sekansı kombinasyonu sinir bozucu kanıtlamak ve potansiyel olarak zayıf bir poli A alt-tabaka ile yeni hücre veya değiştirilmemiş HeLa hücreleri ile güçlü bir alt-tabakanın kullanımı ilk olarak daha iyidir.
Hatta başarılı kullanım bunca yıl sonra, in vitro 3 'bölünme reaksiyonu ile ilişkili küçük gizemler hala var. Örneğin, neden kreatin fosfat gereklidir? ATP havuzu yenilemek için - - 26 geçerli değildir onu da dahil olmak üzere orijinal neden olduğu gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, nükleer özler olan faaliyet sadece kısmi kaybı ile atlanabilirkullanılabilir, ancak özüt, reaksiyonu sulandırmak için kullanılan, kısmen saflaştırılmış bölünme faktörleri parçalandı olarak giderek daha fazla gerekli hale gelir. Aslında, fosfokolin, bir fosfat grubu ve bir pozitif yüklü amin, ama büyük olasılıkla reaksiyonda herhangi bir in vivo bir rol sahip olan başka bir küçük molekül, en az reaksiyonda yeniden 27 kreatin fosfat, daha etkili olduğu bulunmuştur. PVA olan gereksinimi tam olarak açıklanmış değil başka bir maddedir. Bu bölünme faktörü konsantrasyonunda etkili bir artışa yol açan, bir madde kalabalık olduğu kabul edilir, ancak diğer kalabalık maddeler, polietilen glikol gibi, yaklaşık olarak iyi çalışmaz. Bu faktörleri anlama yöntemi hücre tipleri ve RNA yüzeyler daha az verimli uzantısı sağlayan, geliştirilmiş verimlilik yol açabilir, ve çeşitli faktörlerin nasıl çalıştığını ipuçları verebilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
SV NIH K22AI077353 ve Landenberger Vakfı'nın finansman desteği için minnettar olduğunu. KR minnetle NIH (5SC1GM083754) fon kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Celstir flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 position slow speed stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table top centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250 ml conical tubes | Corning | 430776 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal bovine serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-glut:pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M sodium chloride solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium sulfate | Fisher | A702-500 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml |
| 15 ml Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand high fidelity PCR kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% absolute ethanol 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid phenol:chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase inhibitor | Promega | N261B | |
| Polyvinyl alcohol- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable sequencing unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| 20 cm x 22 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| 20 cm x 42 cm aluminum cooling plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| 0.4 mm x 22 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| 0.4 mm x 42 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| 8-well comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| 16-well comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 EA |
| 32-well comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel loading tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μl |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech vacuum pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U.
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S.
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
- Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
