Summary
RNAポリメラーゼIIは、成熟mRNAの3 '末端を越えて延びる前駆体RNAを合成する。成熟したRNAの末端が切断複合体のエンドヌクレアーゼ活性を経由して、RNA配列によって決定されるサイトで、cotranscriptionally生成されます。ここでは、in vitroでの切断反応を研究する方法を詳細に私たち。
Abstract
哺乳動物のmRNAの3 '末端はRNAポリメラーゼII（RNPII）による転写の突然の終了により形成されていない。その代わり、RNPII、成熟RNAの終わりを超えて前駆体mRNAを合成し、エンドヌクレアーゼ活性のアクティブ·プロセスは、特定のサイトで必要とされる。前駆体RNAの切断は、通常、CAジヌクレオチドの後にコンセンサスポリA部位（AAUAAA）から下流にNT 10月30日に行われます。切断複合体、約800 kDaの多因子のタンパク質複合体からのタンパク質は、この特定のヌクレアーゼ活性を達成する。特定のRNA配列の上流および下流のポリA部位のは、切断複合体の動員を制御します。すぐに切断した後、プレmRNAは成熟し、安定したRNAのメッセージを生成するためのポリAポリメラーゼ（PAP）でポリアデニルている。
RNA転写物の3 '末端の処理は、特定の放射性標識RNA基質と細胞の核抽出物を用いて研究することができる。要するに、長い32 </ SUP> P-標識した未切断前駆体RNAは、インビトロで核抽出物とインキュベートされ、そして切断は、ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって評価される。適切な切断が発生した場合、より短い5 '切断された生成物を検出および定量する。ここでは、一例として用いて詳細にHIV-1 mRNAの3 '末端プロセシングを切断アッセイを記述する。
Introduction
最も成熟した真核生物のメッセージ性RNA（mRNAの）の生合成は、キャッピング、スプライシングおよびポリアデニル化など、いくつかの転写後の修正が必要になります。これらの修飾は、一般に、正しい処理1を確認し、強くmRNAの安定性を増加させるために結合される。
3 '哺乳類プレmRNAの末端形成は5にアデニル酸残基の付加、続いて新生RNAのヌクレオチド鎖切断によって生成される「ポリ（A）ポリメラーゼ（PAP）2-4により生成物を切断した。哺乳類では、切断は、特定のプリRNA配列にアセンブルし、約800 kDaの多成分のタンパク質複合体によって達成される。ポリ（A）シグナル配列、高度に保存された標準的なヘキサヌクレオチド配列AAUAAAは、少なくとも約10〜30塩基下流の切断部位を指示する。このサイトは、特に切断およびポリアデニル化特異性因子（CPSF）との73 kDのサブユニットによって認識されているCSPFは、エンドヌクレアーゼ活性が含まれています。切断刺激因子（CSTF）が下流のポリ（A）サイトの複数の縮重GU-またはU-リッチエレメント配列に特異的に結合する。また、哺乳動物の切断因子I（CFIm）、および哺乳類の切断因子II（CFII）は切断のためにある必要がありました。 CFImは遺伝子の数のために定義された上流の配列要素（使用する）の特定UGUA（N）のサイトを結合し、重要な生理的プロセス5-8に関与していると思われる。
インビトロにおいて 、RNAのプロセシング反応は、一般に放射性標識RNA基質9-12を用いて分析される。これらには、バクテリオファージT7プロモーターまたはSP6からランオフ転写によって合成することができる。以前に特徴付けられていないポリアデニル化部位を研究するとき、それは重要な下流の配列がcDNA中に存在しないかもしれないように、RNA基質を生成するために、ゲノムDNAよりもむしろのcDNAを使用する必要がある。少なくとも150のNT upstreaを含むように設計基板Mおよび50ヌクレオチド下流成熟mRNA上の切断部位/端から。切断産物は、基板よりも速く移動し、;他のフラグメントは、非特異的なヌクレアーゼ作用によって生成することができるのでしかし、反応の特異性は、正しいプロセシングシグナル配列への依存性によって検証されなければならない。したがって、AAUAAA配列（ 例えば AAGAAA）中の点突然変異を有するRNA基質を開裂反応の陰性対照として役立つ。
放射性標識RNAの少量の切断反応に使用されることを考えると、ほとんどの核抽出物中の高い存在量で存在するRNaseが問題となり、抽出調製のための出発材料の選択を制限することができる。 HeLa細胞は、内因性のRNaseを低レベルで含有し、従って、これらのアッセイで良好に機能する傾向がある。
in vivoおよびin vitroでの RNA基質のヌクレオチド鎖切断をすぐにポリ（A）付加、木が続き、切断された中間体は、検出可能な量で存在していないよ。したがって、特定のRNA配列又は切断反応に関与するタンパク質のいずれかを研究するために、実験が発生ポリアデニル化を妨げる条件で行われる。 1は、切断反応を損なうことなく、ポリアデニル化を停止することができますので、何ポリアデニル上の切断の依存性、またはその逆はありません。したがって、ATPは、単一のヌクレオチドがポリ（A）部位に組み込むことができるだけ切断さRNAを検出することができるように、3 'ヒドロキシル基を欠く連鎖停止類似体で置換されている。
複雑さとこのタイプのアッセイの特殊性の高い考えると、我々は、in vitroでのmRNA前駆体の劈開/ポリ（A）機構によりヌクレオチド鎖切断を研究するために、詳細なビデオプロトコルを記載している。我々は、有能な核抽出物を調製放射性標識されたRNA基質を生成、切断反応を行い、その結果を分析し、解釈する方法について説明しますING製品。 図1は、切断アッセイに使用するHIV-1プレmRNAの3 '末端をコードする基質RNAの一例を示している。 HIVのRNAゲノムの3 '末端は、ポリ（A）部位、G+ Uリッチ領域、および全てのウイルスmRNA転写物13の効率的な成熟のために必要であるUSE素子などの多くの重要な調節配列から構成されている。この例では、入力されたRNA基質が338 NTおよびNT切断237に依存することを期待する。ポリアデニルが発生した場合は、製品の汚れは、NT 237と437の間で観察されるであろう。
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Protocol
懸濁液に付着細胞の1。適応
（懸濁細胞は、一般に、より良好な核抽出物を作るこれはオプションのステップである、しかしプレート中で増殖させた細胞を用いてもよい。）
- ペニシリン - ストレプトマイシン5〜10％新生仔ウシ血清またはウシ胎児血清および1％のL-グルタミンJoklik変法MEMを用いて、懸濁液中の成長のための接着細胞を適応させる。 8％のCO 2、37℃でフィルターキャップとスピナーフラスコ内の細胞を増殖さ。
- 細胞を適応させる際に、500ミリリットルのスピナーフラスコ中で100ミリリットルで始まります。最小0.3×10 6個/ mlを維持し、適切な成長率は（通常は2〜6週間）が達成されるまで、1〜2日ごとに培地を交換してください。一度適応し、懸濁液中のHeLa細胞は、約24時間毎に倍増する必要があります。 注：細胞が通常の倍の速度に戻るの適応段階では、それには時間がかかります。
- デンで細胞を維持する所望の最終容量（典型的には1〜10 L）中の0.5〜0.8×10 6細胞/ mlのsity
- 細胞は通常、対数期中期（約0.5から0.65×10 6個/ mlと> 90％生存）で収穫されています。培養培地の所望の量に対して適切なサイズのスピナーフラスコを使用する。
2。核抽出
- バッファーおよび試薬の調製
注：抽出を修正Dignam ら 、以下を行っている（1983年）14核抽出手順。- 、1Xリン酸緩衝生理食塩水を調製し、緩衝液Cをバッファリングし、4℃で抽出し、店舗に進む前に、一日D（ 表1）バッファ
注：より高い収率は一般的に、新たに調製した緩衝液を用いて達成される。しかし、バッファは、数週間安定である。これは、すべてのバッファ、装置や機器があらかじめ冷却して抽出の全体のために寒さに保つことが重要である。できるだけ多くのステップのための低温室を使用および/または氷の上のすべてのものを保持します。使用直前にDTTおよびPMSFを追加します。
- 、1Xリン酸緩衝生理食塩水を調製し、緩衝液Cをバッファリングし、4℃で抽出し、店舗に進む前に、一日D（ 表1）バッファ
- 細胞を回収し、洗浄
- 揺れや固定角ローターと遠心機で4℃で5分間500×gで4 250ミリリットルコニカルボトルやスピンに細胞を注ぐ。上清をデカントし、各ボトルに別の250ミリリットルの細胞培養培地を追加します。すべての細胞をペレット化されるまでを繰り返しスピンします。
- 1 250ミリリットルコニカル瓶に250の氷冷PBSを加え、プールの合計組み合わせた最終ペレットを再懸濁する。スイングバケット遠心機で、4℃で10分間、400×gで細胞をスピン。
- 上清を捨て、全体積を50mlを超えないように氷冷したPBSで細胞ペレットを再懸濁する。 50ミリリットルコニカル遠心管にピペット操作し、移動を介してペレットを緩めます。
- スイングバケット遠心機で、4℃で6分間500×gで再びセルを回す。 supernatanを捨てるTと推定値と可能な限り正確に細胞ペレットの量（CPV）を注意してください。ペレットがチューブのボリュームのマーキングよりも低い場合には、比較のために、別個のマッチングチューブに水を使用。
- 細胞溶解
- A.再懸濁を推定CPVの5ボリュームを使用して緩衝液Aでペレットをバッファするために、DTTを追加します。ペレットを破壊し、10分間氷冷した後、ピペット。
- スイングバケット遠心機で4℃で10分間、931×gで細胞をスピン。
- 慎重に上清を吸引し、代わりのデカント。ペレットの体積は細胞の膨張に起因し、サイズがおよそ2倍に増加している必要があります。
- セルに緩衝液Aの1 CPVを追加します。優しくてペレットを破壊し、氷上で微量遠心管に少量（約50μl）を削除します。氷上で冷却し、適切なサイズのダウンスホモジナイザー（通常は15ミリリットルサイズ）に再懸濁した細胞を移す。
- 溶解タイプB（TIGの12月15日、ゆっくりではあるが着実なストロークを持つ細胞HT）乳棒。トリパンブルー染色により（完全な小さな暗い核が膨張した細胞と比較して）溶解液の少量を削除し、完全な溶解のために、顕微鏡下で調べる。無傷の細胞）が明らかであろう。 90％の溶解が達成されるまで均質化を継続し、ここで停止、ダウンシング上で否定的に核抽出物の品質に影響を与える可能性がある。
- ultraclear超遠心チューブにライセートを移し、総量に注意してください。 4℃で10分間1069×gでチューブやスピンを秤量することによってバランスをとる
NOTE：同じチューブに次の段階で、より高速で紡糸することができるので、超遠心機を低回転速度にもかかわらず、このステップで使用される。このスピンを回収し、サイトゾルS100抽出物のために使用することができる上記の曇った上清をチューブの底を覆うかなりタイトなペレットをもたらす。チューブの上に目に見える脂質層が存在する場合、それを除去することができる。 - 慎重にピペットで上清を除去し、anothにそれを移すERチューブ核ペレットを乱さないように注意：これは、パックされた核の体積（PNV）を決定するために、上清の最終容量を知ることが重要になります。
- 核抽出物の調製
- 上清を慎重に除去された後、同じチューブ内で4℃で15分間25453×gで粗核抽出物ペレットを再回転。
- 残りの上清を除去し（それは透明な液体を少量であるべき）と前回の上清コレクションに追加します。上清の最終体積を測定します。オリジナル溶解液の全容積からこのボリュームを減算してPNVを計算する前に述べた。ペレットが十分に大きい場合あるいは、その体積は、同一チューブ内の水を同様の体積と比較することにより推定することができる。
- バッファーC（細胞の約1ミリリットル/ mlで）の1 PNVボリュームを追加。慎重にピペットチップでペレットを取り除くし、適切にSiに転送するZEDダウンスホモジナイザー。以前と同じホモジナイザーを使用している場合は、滅菌した脱イオン水でホモジナイザーを前すすぎ。
- タイト乳棒を用いてダウンスホモジナイザーを経由して〜5月10日ストロークでペレットを再懸濁します。
- チルドチューブに均質化された核ライセートを移し、4℃で30分間転倒混和体積が十分に大きい場合、磁気撹拌プレート及びスピンバーを用いて攪拌する。
- 新しいultraclear遠心管に溶解液を移し、4℃で30分間25453×gでスピンペレットをコンパクトにする必要があります。スピン前に約5分が完了し、適切な分子量カットオフ（MWCO）を持つ透析カセットやチューブを水和物（ 例：7000）を有する。
- トランスファーピペットを使って冷やしコニカルチューブにチューブから上清（核抽出）を取り外した後、透析を続行します。
- 透析
- 製造業者に従って水和透析カセットに抽出物を注入 'の指示攪拌しながら4℃で1時間バッファーD 50 500ml中に核抽出物を透析する。
- 500ミリリットル新鮮な氷冷した緩衝液D 50でバッファーを交換し、4℃でさらに4時間透析この4時間の工程は、2つではなく2時間の変更に分割することができる。
- 透析カセットからの抽出物を取り出して、冷やしたチューブに移す。 4℃で1,500×gで5分間抽出を紡ぐ
- チルド、エッペンドルフチューブに抽出を分取し、液体窒素（分量当たり50〜100μL）で凍結スナップ。将来の使用のために-80℃で保存。
3。RNAプローブ合成
- テンプレートの調製
NOTE：転写のために使われているテンプレートは、所望のプローブ配列の上流および直ぐ隣接T7またはSP6プロモーターを含有するPCR断片又はプラスミドであり得る。プラスミド鋳型は、int型の鋳型配列の下流に直線化されなければならないerest。我々は、PCR鋳型からのより高い収量を指摘した。- T7/SP6プロモーターは、PCR反応の間に挿入することができる。標的配列の上流にT7/SP6プロモーターとセンスプライマーを設計します。
- 高忠実度ポリメラーゼを用いて、製造者の指示ごとのPCRによるテンプレートごとに2〜3の反応で所望の配列を増幅する。
- 同等の反応を組み合わせて、ゲル抽出により精製した。
- PCR産物の配列は、テンプレートの正確さを検証する。 （オプション）
- 32 Pのラベルを有するRNA転写
- 以下の変更を加えたプロモーター（SP6またはT7）と互換性があり、市販のキットを用いてテンプレートを1μgからインビトロ転写行う。新鮮な3000 CI /ミリモル[α-32 P] UTPの1μL、10 mMの寒さのUTPの0.5μL、10 mMのGTPの0.1μL、及び10mMのm7G（5 '）PPP（5'）G RNAの0.9μlを使用する20μLの総最終体積キャップ。
注：（：GTPキャップ）10:1の比率のG-キャップは、核抽出物中のRNA転写物の安定性を向上させます。冷UTPは、限定試薬であり、32 P-UTPを防止するために添加される。 - Gキャップなしで上記の示すようにRNAサイズラダーを合成します。商用テンプレートは、RNAサイズマーカーを生成するために用意されています。
- 1時間（SP6用40°C）で37℃で転写反応をインキュベートする。完了したら、37℃で15分間、テンプレートのDNase消化を行う
- 消化後、RNA基質に0.5 M EDTAおよびローディングバッファーIIの5μLの1μLを加える。マーカーに20μlのローディング緩衝液IIを追加します。
- 氷の上に置いた後、3分間95℃でRNAマーカーおよびプローブを加熱する。
- 以下の変更を加えたプロモーター（SP6またはT7）と互換性があり、市販のキットを用いてテンプレートを1μgからインビトロ転写行う。新鮮な3000 CI /ミリモル[α-32 P] UTPの1μL、10 mMの寒さのUTPの0.5μL、10 mMのGTPの0.1μL、及び10mMのm7G（5 '）PPP（5'）G RNAの0.9μlを使用する20μLの総最終体積キャップ。
- ポリアクリルアミドゲルキャスティング/プローブ電気泳動
- 6％ポリアクリルアミドゲル（PAGE）ミックスと10％のページの400ミリリットルを1リットル調製。ビス-A：6％にするには、40パーセント午前19時01アクリルアミドの150ミリリットルを混ぜる10Xトリス/ホウ酸塩/ EDTA（TBE）100mlおよび460グラムの尿素とcrylamide。滅菌脱イオン水を用いて800ミリリットルに起動し、（50〜80℃の付近）の低熱を加えながらホットプレート上で撹拌する。脱イオン水で1Lに完了します。
注：反応は吸熱性である。加熱は、尿素の可溶化を促進する。とすぐに尿素を溶解させるように暑さから削除し、脱イオン水で1Lに解決策をもたらす。代替的に、室温で一晩撹拌する。あまりにも多くの熱が重合を開始することができます。 - 室温でのアルミ箔や店舗の光からページミックスを保護します。ホームページミックスは、事前に準備し、数ヶ月間安定していることができます。
- ビスアクリルアミド、10X TBEの40ミリリットルと184グラムの尿素40％午前19時01分アクリルアミドの100ミリリットルを組み合わせることにより、10％のホームページミックスの400ミリリットルを用意します。尿素が溶解した後、脱イオン水で400ミリリットルに育てる。
代替的に、夜7時01分20％アクリルアミド溶液、0％アクリルアミド溶液w iを調製目のバッファと尿素のみ;これらは、次いで0〜20％の間の任意のパーセンテージを与えるために任意の比率で混合することができる;尿素は常に溶解が遅い。 - キャストするゲルの数に応じて滅菌脱イオン水中10％過硫酸アンモニウム（APS）溶液を10〜50ミリリットル調製する。
- 70％エタノール（エタノール）、20センチ×22センチメートルガラスゲルプレートを洗浄します。大糸くずの出ないワイプで乾燥させます。
- 5 N水酸化ナトリウム（NaOH）の1ミリリットルで、正規版を洗浄した後、70％エタノールで洗い直す。コートゲルとノッチプレートが飽和し、小さなキムワイプでプレートを拭いてシリソリューションをはじく。
- 空のピペットチップボックスまたは洗浄面を上にして、テーブルからそれを上昇させる発泡スチロールの作品を定期的にプレートを配置することによって、プレートを組み立てる。長辺の端に0.4ミリメートルのスペーサーを置きます。
- コーティングされた面がゲルの内側になるように慎重にスペーサを介してノッチプレートを置き。シフトかみそりやその他の薄い楽器を使用してくださいゲルプレートの底部及び側部に同一平面配向用スペーサは、次いで、スペーサ上にゲルプレートの各側にバインダークリップで固定します。
- 10％を15mlを混合してゲル当たり8％PAGE混合物を30mlを調製し、6％を50mlチューブにそれぞれを混合する。すぐに8％ゲル混合物にN、N、N 'を30μl、N'-テトラ-メチル（TEMED）に続いて10％のAPSを300μlを加える。
注：個々のプローブのサイズに適したゲルの割合は、実験者が選択する必要があります。 - キャップと2Xを反転し、ゲルプレートのノッチ領域に溶液を注ぐ。少し手でプレートを高め、ページのミックスが底から滴り始めるまでさえ注ぐ保持してください。
- バックレベルにプレートを下げて、すぐに0.4ミリメートル×20センチのゲルのための大規模な8ウェル矩形コームを挿入します。下の方に小さな気泡は、実行には影響しませんが、ウェル内の気泡があってはならない。
注：<注ぐ時に任意の流出を捕獲するために、ゲルの底部と上部に下記のテーブルの上に/強い>プレースペーパータオル。 - ホームページミックスは、少なくとも30分間重合させることができます。
- 寒い部屋に重合したゲルを移し、電気泳動装置を組み立てる。上下のチャンバーに充填ラインに冷たいTBE緩衝液を追加します。
- コームを取り外し、任意の破片を除去するためにかみそりを使用しています。装置内にゲルをセットし、密封するために、プレートを保持するために、バインダークリップを使用しています。それがプレートに流れるまで上部チャンバーに冷たいTBEを追加します。
- 直前に標識RNA基質をロードする冷たいTBEで満たさ30ミリリットルsyringe/21 G 1-1/2 "針で井戸を洗浄します。走行中の熱の均一な分布を支援するためにガラスの背面にアルミ板を置きます。
- マーカーの負荷3μLと別々のウェル中の各RNA基板の全25μlの転写反応。 Pによく、同様の大きさの転写物との間に残してreventに交差汚染。ローディング緩衝液中のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール色素がゲル上でサイズの移行を推定するために使用することができる。
- （NT 600のプローブの2時間例えば 25ワット）RNAプローブのサイズに適切な一定のワット数でゲルを実行します。
- 6％ポリアクリルアミドゲル（PAGE）ミックスと10％のページの400ミリリットルを1リットル調製。ビス-A：6％にするには、40パーセント午前19時01アクリルアミドの150ミリリットルを混ぜる10Xトリス/ホウ酸塩/ EDTA（TBE）100mlおよび460グラムの尿素とcrylamide。滅菌脱イオン水を用いて800ミリリットルに起動し、（50〜80℃の付近）の低熱を加えながらホットプレート上で撹拌する。脱イオン水で1Lに完了します。
- 標識RNAの抽出および精製
- 電気泳動後、ゲルを慎重に装置の上部チャンバードレイン。放射能の大部分はゲルと下部チャンバーになります。しかしながら、上部バッファは、いくつかの放射性物質を含んでいてもよい。
- 別の放射性物質の作業領域に移動する場合は、ゲルを輸送するためにトレイを使用してください。慎重に横に離れてゲルから突出片を引いて、スペーサを取り外します。
- 優しくプレートを分離する。ゲルは、シリコーン処理されなかった板に固執する必要があります。ゲルとガラス板の上にラップの部分を置きます。
- アールにプラスチックラップにglogos autoradマーカーステッカーを配置任意のサンプルのは明らかであるゲルの。
- 暗い部屋で、プレート全体にわたってオートラジオグラフィーのフィルム片を配置し、少なくとも1分間さらす。フィルムを開発しています。
- 光表面に現像されたフィルムを配置します。その後、膜の上にゲル面のプラスチック側を下に置き、フィルム上の露出のマーカーにゲルからautoradマーカーの位置を合わせます。一度揃え、ガラス上の所望のバンドの位置をマークするために黒のマーカーを使用しています。
注：別の方法として、RNAバンドをカットするには、次のようにゲル/フィルムの位置を合わせます。暗い部屋で、テーブルの上にラップされたゲルを置き、その上にフィルムを置き、フィルム片の上にカセット（または書籍等）を配置します。その後、簡単に室内の光スイッチのフリック、オフの場合にしてください。これは「プレフラッシュ」により、上部のカセットが提供する光からの圧力/保護フィルム上の全てのウェルの輪郭を生成するフィルムます。これにより、簡単に、ゲル上に膜を整列させ、切断することができる蛍光マーカーを使用せず、バンド外。 - 慎重にラップを除去し、各RNA基質のための新鮮なメスまたはかみそりを使用し、ゲルからバンドを切り出し、別の1.7ミリリットルマイクロチューブに入れる。溶出中に穏やかな扇動のための旋回装置を使用してください。
- 各チューブにRNA溶出緩衝液500μl（0.5 M酢酸アンモニウム、10mMのMgCl 2、1mMのEDTA、0.2％SDS）を添加する。簡単に説明するとゲル断片を沈めるために遠心する。プローブサイズに応じて、3月16日時間、暗所で室温でインキュベートする。
- 新しいチューブに溶出した物質の全体を500μlを移す。彼らは、精製を妨害するように任意のゲル片を転送することは避けてください。 （RNAの場合）寒い、酸性フェノール - クロロホルムを500μlとともにグリコーゲンの1μL（20 mg / mlの）を追加します。
- 簡単に言うと渦、溶液は濁って表示されます。 5-6分間、最高速度（〜16,000×g）で、室温でスピン。
- 慎重にトランスFERトップ（水）は、間期からごみを避けながら、できるだけ多くの収集を新しいチューブへのレイヤ。転送水層に等量のクロロホルムを加える。手順を繰り返し3.4.10と新しいチューブにトップ（水性）層を転送する。収集された材料に、氷冷百分の95から100のEtOH 1ミリリットルを追加します。 10分間-80℃でインキュベートNOTE：所望によりRNAを一晩保存することができる。
- 4℃で16,000×gで30分間、RNAをペレット化慎重に放射性廃棄物容器に上清を捨て、各ペレットを氷冷した70％の分子グレードエタノールの1ミリリットルを加える。
- 、上澄みを捨てる1分間再びスピンし、ピペットを経由して残留エタノールを除去し、残りのエタノールを蒸発させるのを可能にするように開放キャップを用いて室温で残して、4℃で15分間16,000×gで、RNAをペレット化。
- RNaseフリー水20〜30μlにペレットを再懸濁します。標識されたRNAは-80℃で保存することができる
注：放射性サーベイメータは、標識されたRNAは、任意のステップの間に失われていないことを確認するために、全体の抽出手順全体で使用する必要があります。
- プレmRNAの3 'mRNAの開裂反応のための標識されたRNAの定量
- 以下の手順を使用して切断基質のモル濃度を近似。
- 例えば、3000 CI /ミリモルの1μlの[α-32 P] UTPおよび10 mCiの/ mlのを取る。ラベル（ラベル基準日では、この原液の化学物質濃度は、その日付の前にそれはそれは〜1.6 mMの、などの日付の後に高く、1半減期（〜13日）です。3.3100μMのUTPとなります） UTP K mより最終冷UTP濃度が使用される場合、最終反応濃度にUTPの寄与は、典型的には無視できる程度である。 UTP用のT7 RNAPのK mは、114 mMの15です。
- 水39μlに1μlの希釈する。その後、希釈した[α-1μlを加える
- 前のステップで使用されるシンチレーション液を同量の別々のバイアルに各標識RNA基質の1μLに希釈する。背景を計算するための唯一のシンチレーション液をバイアルにご注意ください。シンチレーションカウンターで放射能を定量。
- 最初の希釈を考慮に単独でシンチレーション液により得られたバックグラウンドを減算する40で、[α-32 P] UTPサンプル分間当たりのカウント（cpm）を掛けます。 RNaseフリー水の量（20〜30μL）により各RNAプローブの数を掛けますが、RNを再懸濁するために使用プローブ。これは精製されたRNAの総CPMを与えます。
例：最大のcpm =（CPM [α-32 P] UTP -バックグラウンド）40をX標識RNAサンプル1 =2万CPM×20 =40万CPM（20μlの再懸濁のために使用されている場合） - [α-32 P] UTPの1μL以外の量は、転写物を作るために使用された場合は、[α-32 P]のためのCPMを乗じて、[α-32 P] UTPの最終CPMにこのボリュームを考慮使用量だけのUTPサンプル。
例：[α-32 P] UTPの2μlを転写物を作るために使用されている。 1μlの[α-32 P] UTPのための計算されたCPM 500,000 cpmである。 50万* 2 = 1,000,000 CPMを掛け - 単独の[α-32 P] UTPの計算されたCPMで計算標識RNA CPMを分ける。これは大まかに組み込まれた標識UTPの割合を推定します。
例：400,000 / 1,000,000 = 0.40または40％組み込ま - 酵素は同位体を区別することはできませんので、ラベルおよび非標識UTPの同じ割合は、転写の際、RNAに組み込まれている。転写反応（10 mM溶液を0.5μL= UTPの5.0×10 -9モル）に追加されたモル数で冷たいUTPの量を計算する。
- （上記のカウントホットUTPから知られている）が設立パーセントの反応におけるモルのUTPを掛け、その後、RNA配列中のウリジンの数によってそれを割る。
例：UTP X 0.40 = 2×10 -9モルのUTPの5.0×10 -9モル
2×10 -9モルのUTP / 73 U転写産物あたり= RNAの2.7×10 -11モル - 回収されたRNAの再懸濁溶液の体積で割ることによってモル濃度にRNAのモル数を変換する。
例：RNA / 20μL= 1370 nMのRNAを2.7×10 -11モル。約1μgの直線から作られたT7 RNAP転写用プラスミド化されたし、20μlの水に再懸濁し、200 1,400 nmの値が典型的である。
NOTE：RNAのモル濃度は、 インビトロ切断反応における最終的なプレ-mRNA基質濃度は、開裂反応あたり5nM未満であることを保証するために使用される。 RNA濃度が5 nmを超える大幅に上昇させると切断効率が低下する可能性があります。
- 以下の手順を使用して切断基質のモル濃度を近似。
4。3 'mRNAの開裂反応
- 切断反応試薬の調製
- 切断反応に必要なすべての試薬を準備します。水を沸騰させることにより、10％のポリビニルアルコール（PVA）を行い、徐々にPVA粉末の正確な量を加える。 10％のPVAは、粘性であり、溶解に時間を要するであろう。室温で保存したり、-20℃〜
- -80℃で1 Mクレアチンリン酸（CP）とストアを準備するこれは、4未満月齢で1 MのCPを使用することが重要である。
- 1 M DTTとストアを準備します-20℃での直前に切断反応をすることを1 M DTTから新鮮0.2 M DTT希釈を作る。
- ETS（切断停止液）を調製：10 mMトリスpHは7.8、10mMのEDTA、0.5％SDS。室温で保管してください。
- 開裂反応
- 2分間80℃に標識されたRNAを加熱した後、氷上に置きます。
- 静かにボルテックスして、気泡を除去するために2〜3分間、最高速度で10％のPVAをスピン。
- マスターミックス1：単一の反応については、3.125μlの10パーセントを組み合わせて、PVA、0.625μlの1 M、CP、0.25μlの0.5 MのtRNA、0.125μlの100のdATP、0.13μL40 U /μlのRNase阻害剤、0.25μlの0.1 M EDTA pHを8 、0.1μlの0.2 M DTT、および0.645μlのRNaseフリー水。氷上でチューブあたり5.25μlのマスターミックス1を分配する。
- マスターミックス2：2 mg / mlのより高い濃度での核抽出物の使用6.25μL/反応。核抽出物は、緩衝液D 50で希釈することができるかの旧姓DED。
- 以前にマスターミックス1の5.25μLを分注して、核抽出物を6.25μLを兼ね備えています。50nmで希釈した標識RNA基質の1を添加する。あるいは、RNAは、マスターミックス1に含まれてもよいがRNase阻害剤、DTTおよびtRNA後に添加されることを条件とする。 注：使用して標識されたRNA基質の<5nMで。
- 優しく泡を除去するために、各サンプルをボルテックスし、迅速なスピン。最大2時間、30℃で培養するが、時間の経過は、最適な結果を得るために行われるべきである。長いインキュベーションは、バックグラウンドの低下が増加する可能性があります。
- プロテイナーゼK消化と精製
- 熱からサンプルを取り出して、各反応にETS停止液182.5μlを加える。 20 mg / mlのプロテイナーゼKの5μLを加え、10分間37℃でサンプルをインキュベートする。
- 3 Mナトリウムの1酸性フェノール-クロロホルムの体積（200μl）を、1/10量 （20μl）を添加することにより、RNAを抽出酢酸、および20 mg / mlのグリコーゲンを1μl。のセクション3.4.9-3.4.14で説明したように抽出を進める。
- RNA抽出が完了すると、すべての残留エタノールを除去してください。ローディングバッファー（90％ホルムアミド、ブロモフェノールブルー（BFB）（および、キシレンシアノールブルーで10のEDTA））の8μlにペレットを再懸濁します。サンプルは-80℃で保存するか、またはゲル電気泳動を続行することができる。
- 切断反応電気泳動
- 以前にいくつかの変更を持つセクション3.3.1-3.3.17に記載されているように、6％のアクリルアミドゲルを準備します。長辺に2バインダークリップ、20センチ×42センチメートルシングゲルプレートを使用してください。 32ウェルコームを使用し、ゲル混合物の40ミリリットルを用意。
- マーカーの3μL、各サンプル5μlのゲルをロードします。事前に切断し、切断産物のサイズに応じて電気泳動の設定を最適化します。
- 電気泳動が完了すると、<3.4.1-3.4.3の項に従ってくださいゲルを分解> /強い。代わりにプラスチックラップを、ゲルプレートのサイズに濾紙片を切断し、慎重に露出ゲルの一方の側の上に置き。
- ろ紙が下になるとガラスが上になるようにプレート上にフリップ次いで、ゲル上にしっかりと濾紙を押してください。しっかりとゲルが均等に、ろ紙を把持していることを確実にするためにテーブルの上にガラスを下に押します。
- 徐々に取り付けられたゲルと濾紙の全てがガラス板から除去されるまでの短い端部の一方から、それに取り付けられたゲルを有するべきである濾紙を剥がす。
- ラップで公開されるゲル側を覆う。フィルターペーパーにプラスチックラップをテープで固定します。
- 真空側にフィルタ側とゲル乾燥機でゲルを置きます。 15分間またはゲルが完全に乾くまで乾燥させます。
NOTE：ゲル乾燥機を使用できない場合は、X線フィルムは、RNAバンドを可視化するために使用することができる。露出はガーゼで行われるべきである-80℃で強化スクリーン付きTシャツタイトなカセット露光時間は経験的に決定される。ご注意：ロー％のアクリルアミドゲルを凍結すると割れることがあります。 - ゲルは、現在膜を露出させるために使用され得るか、またはホスホ - イメージャーと共に使用する。露光時間は標識RNAの強さに依存します。最初に24時間曝露が使用されてもよい。膜を使用する場合、強化スクリーンを-80℃で露出し、現像前に室温に温める。
- 切断効率を定量するために、各サンプル中の切断されたとの未切断されたRNAの間の比率を測定します。
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Representative Results
RNAのポリ（A）HIV-1の部位（ 図2）の切断アッセイの代表的な結果。我々は、ゲルの上部に最も遅いマイグレーションの帯域で切断されていないRNA基質を、観察することができる。具体的な切断産物が予想されたサイズでゲルに高速に実行され、最も強烈な短い断片のバンドであり、mutpoly（A）の切断アッセイから、特に存在しないポリA配列（mutPolyA）RNA中の点変異を含むコントロール基板。入力基板の分解産物は、時々観察することができる。切断活性の定量化は、切断されていないRNAを100％に正規化し、切断されたRNAの非切断の比のプロットトメトリーによって決定することができる。
図1 HIV-前の概略図mRNAの3 '末端処理基板、in vitroでの切断およびポリアデニル化反応の予想される生成物。切断部位、ジ-CA-25はNT下流のポリA部位のAAUAAAから位置しています。 LTR領域：U3（ユニークな3 '配列）、R（反復配列）、およびU5（ユニーク5'配列）。
図2（A）ポリ（A）部位切断。HIV-1のポリ（A）および切断（mutPolyA）を廃止し、ポリ（A）シグナルの点突然変異を含有する32 P-標識されたRNAは、核抽出物中でインキュベートした。ネガティブコントロールとしてのHeLa-S3細胞またはBSAの。太字の矢印は、5 '切断産物を示している。 3 '断片は、多くの場合、ジェルをオフに実行するか、劣化しており、常に表示されていない。（B）切断活動の濃度測定プロットTYは切断されていないRNAの100％に正規化され、切断されたRNAに切断されていないとの比率として表現。
| 緩衝液A（100ml）で | 10 mMのトリス（pH 7.9）、1.5mMのMgCl 2、10mMのKCl、0.5 mMジチオスレイトール（DTT）。 | 直前に抽出中に緩衝液Aを使用して、DTTを追加します。バッファAの1ミリリットルあたり1 M DTTの1μl加え |
| バッファーC（50ml）中 | 20 mMのトリス（pH 7.9）、25％（v / v）グリセロール、0.42 MのNaCl、1.5mMのMgCl 2、0.2mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.5mMのDTT、0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）。 | プロテアーゼ阻害剤カクテル錠の抽出の朝を追加します。 |
| 緩衝液D 50（2-4 L） | 20mMトリス（pH7.9）、20％（v / v）グリセロール、0.2mMのEDTA、0.5mMのDTT、50mMの硫酸アンモニウム。 | HEPES-KOH緩衝液A、C及びDのトリスを置換することができる |
| 0.5 Mのamonium酢酸、10mMのMgCl 2、1mMのEDTA、0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） | 室温で保管してください。 | |
| 停止緩衝液（ETS） | 10mMトリス（pH8.0の）、10mMのEDTA、0.5％SDS | 室温で保管してください。 |
| 切断ローディングバッファー | 90％ホルムアミド、5 mMのEDTA pH8の、0.025％ブロモフェノールブルー | -20℃で保存 |
バッファの表1の組成物。
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Discussion
HeLa細胞核抽出物又はこれらの抽出物から分画し切断因子を用いて行わインビトロプレ-mRNAの3 '切断反応は、コア切断因子の同定とその主な複合体16-21が可能となった。これらの要因に関連するより多くのタンパク質が、最近22を同定されており、in vitroでの反応は、これらのタンパク質が反応に寄与どのように光を当てるし続けることができる。おそらくので、インビボでの反応は、23 cotranscriptionalであるように見える、またはいくつかの要因が抽出および透析中に失われる可能性があるため、効率が悪く、しばしばず、まれに切断が達成される30％以上である。また、反応効率が急に明確な理由もなく日々低下することがあります。そのため、手順が変更またはウイルス感染HeLa CELへの反応を適用しようとする場合は特に、最も重要である理解することが重要であるlsの、他の細胞型または新規基質に関する。
綿密にRNaseフリーの条件下で作業する必要があるように、疑いもなく、抽出物の品質とin vitroで転写されたRNAの新鮮さは、最優先される。それらは抽出のために回収する時に、細胞の健康も重要です。細胞が健康で、彼らはより少ない24時間に倍増する必要があります表示され、それらは、あるいは対数期中期に近づいているべきであり、いくつかの死んだ細胞やその他の原因不明の残骸があるはずです。明らかに、細胞はマイコプラズマや他の細菌に汚染されるべきではない。これは見かけ上の劣化につながることができように、基板には、あまりにも高い比活性で作られるべきではない。
切断部位のいずれかの側に十分な大きさの配列を考慮して、選択的ポリアデニル化が考慮される場合、ヒトゲノムにおける異なる数のポリ（A）シグナル配列は、間違いなく遺伝子24の数を超え25。弱ポリ標準HeLa細胞以外の細胞で（A）シグナル配列の組み合わせがイライラ証明することができ、それは潜在的に弱いポリA基質を使用して新しい細胞または未改変HeLa細胞との強力な基板を使用する最初の方がよい。
でも、成功した使用のように多くの年後に、in vitroでの 3 '切断反応に関連した軽微な謎が残っています。たとえば、なぜクレアチンリン酸が必要か？ ATPのプールを再生させる- - 26は有効ではありません、それを含めて、元の理由があることが実証されている。興味深いことに、核抽出物である活性の部分的喪失のみで省略することができる使用されるが、抽出物は、反応を再構成するために使用される部分的に精製された切断因子に分別されるように徐々必要となる。実際には、ホスホコリン、リン酸基を有する他の小分子と正に帯電したアミンが、反応性が高いにはインビボでの役割を有していない、再構成された少なくとも27の反応では、クレアチンリン酸よりも有効であることが見出されている。 PVAは、その要件に十分に説明されていない別の成分です。これは、切断因子濃度を効果的に増加をもたらす、クラウディング剤であると仮定されるが、他のクラウディング剤が、ポリエチレングリコールのように、ほぼ同様に機能しない。これらの要因を理解することは、非効率的な細胞型およびRNA基質にメソッドの拡張を可能にする、改良された効率性につながる可能性があり、様々な要因がどのように機能するかの手がかりが得られるかもしれません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
SVは、NIH K22AI077353とランデンバーガー財団からの資金援助に感謝しています。 KRは感謝NIH（5SC1GM083754）から資金提供を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Celstir flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 position slow speed stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table top centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250 ml conical tubes | Corning | 430776 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal bovine serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-glut:pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M sodium chloride solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium sulfate | Fisher | A702-500 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml |
| 15 ml Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand high fidelity PCR kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% absolute ethanol 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid phenol:chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase inhibitor | Promega | N261B | |
| Polyvinyl alcohol- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable sequencing unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| 20 cm x 22 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| 20 cm x 42 cm aluminum cooling plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| 0.4 mm x 22 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| 0.4 mm x 42 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| 8-well comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| 16-well comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 EA |
| 32-well comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel loading tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μl |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech vacuum pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 size available |
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