Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse af RNA Processing Reaktioner Brug Cell Free Systems: 3 'End spaltning af præ-mRNA Underlag Published: May 3, 2014 doi: 10.3791/51309
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

Summary

RNA-polymerase II syntetiserer en precursor RNA, som strækker sig ud over 3'-enden af ​​det modne mRNA. Den ende af det modne RNA genereres cotransskriptionelt på et sted dikteret af RNA-sekvenser via endonucleaseaktivitet af spaltning kompleks. Her har vi detaljeret metode til at studere spaltningsreaktioner in vitro.

Abstract

3'-enden af ​​mammale mRNA'er dannes ikke ved brat ophør af transkription med RNA-polymerase II (RNPII). I stedet RNPII syntetiserer forløber mRNA efter udgangen af ​​modne RNA, og en aktiv proces endonucleaseaktivitet kræves på et bestemt websted. Spaltning af forstadiet RNA sker normalt 10-30 nt nedstrøms fra konsensus polyA stedet (AAUAAA) efter CA dinucleotider. Proteiner fra spaltning kompleks, en multifaktoriel protein kompleks af omtrent 800 kDa opnå dette specifikke nukleaseaktivitet. Specifikke RNA-sekvenser opstrøms og nedstrøms for poly-site kontrol rekrutteringen af ​​spaltningen kompleks. Umiddelbart efter spaltning, er præ-mRNAer polyadenylated af polyA polymerase (PAP) til at producere modne stabile RNA-beskeder.

Behandling af 3'-enden af ​​et RNA-transskript kan studeres ved hjælp af cellulære kerneekstrakter specifikke radiomærkede RNA-substrater. I summen, en lang 32 </ Sup> P-mærket uspaltet precursor RNA inkuberet med kerneekstrakter in vitro, og spaltning vurderes ved gelelektroforese og autoradiografi. Når korrekt spaltning forekommer, en kortere 5'spaltet detekteres produkt og kvantificeres. Her beskriver vi spaltningen assay i detaljer ved hjælp af, som et eksempel, 3'-enden behandling af HIV-1 mRNA'er.

Introduction

Biosyntesen af ​​de fleste modne eukaryote besked RNA'er (mRNA'er), kræver flere posttranskriptionel modifikationer såsom capping, splejsning og polyadenylering. Disse ændringer er generelt forbundet for at sikre korrekt behandling 1 og kraftigt øge stabiliteten af mRNA.

3'-enden dannelsen af pattedyr præ-mRNA'er genereres ved spaltning i kernen af den spirende RNA efterfulgt af tilsætning af adenylat-rester i 5'-spaltede produkt ved poly (A) polymerase (PAP) 2-4. I pattedyr er spaltning opnås ved en multikomponent-protein-kompleks, omtrent 800 kDa, som samler specifikke præ-RNA-sekvenser. Poly (A)-signalsekvens, et yderst konserveret kanonisk hexanukleotid sekvens AAUAAA dirigerer spaltningsstedet ved ca 10-30 nt nedstrøms. Dette site er specifikt anerkendt af spaltning og polyadenylering specificitet faktor (CPSF) og 73 kD underenheden afCSPF indeholder endonucleaseaktivitet. Spaltningen stimulering faktor (CstF) binder en mere degenereret GU-eller U-rige element sekvens nedstrøms for poly (A) site. Også påkrævet for spaltning pattedyr spaltning faktor I (CFIm) og pattedyr spaltning faktor II (CFII). CFIm binder de specifikke UGUA (N) steder i opstrømssekvensen elementer (bruger), der er defineret for en række gener, og synes at være involveret i vigtige fysiologiske processer 5-8.

In vitro RNA-forarbejdning reaktioner almindeligvis analyseret ved anvendelse af radioaktivt mærkede RNA-substrater 9-12. Disse kan syntetiseres ved afstrømning transkription fra bakteriofag-promotoren T7 eller SP6. Når man studerer et polyadenyleringssted der er ikke blevet karakteriseret før, er det nødvendigt at anvende genomisk DNA snarere end cDNA til at generere RNA-substratet, som vigtige nedstrømssekvenser ikke kan være til stede i cDNA. Design substrater omfatte mindst 150 nt upstream og 50 nt nedstrøms fra spaltningsstedet / slut på den modne mRNA. Spaltningsproduktet migrerer hurtigere end substrat; men fordi andre fragmenter kan genereres ved ikke-specifik nuklease handling, specificitet af reaktionen skal verificeres af dets afhængighed af de korrekte behandling signalsekvenserne. Derfor RNA substrater med en punktmutation i AAUAAA-sekvens (f.eks AAGAAA) tjene som en negativ kontrol for spaltningsreaktionen.

Da en lille mængde radioaktivt mærket RNA anvendes til spaltningsreaktionerne kan RNaser stede i høj overflod i de fleste kerneekstrakter være problematisk, og begrænse valget af udgangsmaterialet til ekstrakt forberedelse. HeLa-celler tendens til at indeholde lave niveauer af endogene RNaser og dermed klare sig godt i disse assays.

Den endonukleolytisk spaltning af RNA-substrater in vivo og in vitro umiddelbart efterfølges af poly (A) tilsætning, thus den spaltede mellemprodukt er ikke til stede i påviselige mængder. Derfor, for at studere enten en specifik RNA-sekvens eller proteiner involveret i en spaltningsreaktion, er forsøg gennemføres under forhold, der forhindrer polyadenylering opstår. Der er ingen afhængighed af spaltning på polyadenylering, eller vice versa, så man kan stoppe polyadenylering uden at skade spaltningsreaktionen. Således er ATP erstattet med et kædeafsluttende analog, der mangler 3'-hydroxylgruppe, således at kun et enkelt nucleotid kan inkorporeres i poly (A)-stedet og kun spaltet RNA kan påvises.

I betragtning af kompleksiteten og høje grad af særpræg ved denne type assay, beskriver vi en detaljeret video-protokol til at studere endonukleolytisk spaltning ved spaltning / Poly (A) maskiner mRNA forstadier in vitro. Vi beskriver, hvordan man forbereder kompetente kerneekstrakter, generere radiomærkede RNA substrater, udføre kløvningsreaktionen, og analysere og fortolke resultatetdukter. Figur 1 viser et eksempel på substrat RNA'er, der koder for 3'-enden af HIV-1 pre-mRNA'er, der skal anvendes til spaltning assay. 3'-enden af HIV-RNA-genom er sammensat af mange vigtige regulatoriske sekvenser, såsom poly (A) site, et G+ U rig region, og USE element, som alle er nødvendige for en effektiv modning af virale mRNA-transkripter 13 . I dette eksempel ville vi forvente input RNA substrat til at være 338 nt og ved spaltning 237 nt. Hvis polyadenylering fik lov til at ske, vil der observeres en udstrygning af produkter mellem 237 og 437 nt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Tilpasning af klæbende celler i Suspension

(Dette er et valgfrit trin. Suspension celler generelt gøre bedre kerneekstrakter imidlertid celler dyrket i plader kan også anvendes.)

  1. Adapt adhærente celler til vækst i suspensionskultur under anvendelse af Joklik modificerede MEM suppleret med 5-10% nyfødt kalveserum eller føtalt bovint serum og 1% L-glutamin: penicillin-streptomycin. Propagate celler i rotationskolber med en filterhætte ved 37 ° C med 8% CO2.
  2. Ved at tilpasse celler, skal du starte med 100 ml i en 500 ml spinner kolbe. Opretholde et minimum 0,3 x 10 6 celler / ml og erstatte mediet hver 1-2 dage, indtil den rette vækst er opnået (typisk 2-6 uger). Når tilpasset bør HeLa-celler i suspension fordobles cirka hvert 24 timers BEMÆRK:. Under adaption fase vil det tage noget tid for cellerne til at vende tilbage til deres normale fordobling sats.
  3. Oprethold cellerne ved en hulefoldighed af 0,5-0,8 x 10 6 celler / ml i det ønskede slutvolumen (typisk 1-10 L)
  4. Celler høstes typisk midt log-fase (ca. 0,5-0,65 x 10 6 celler / ml og> 90% levedygtige). Brug passende størrelse spinnerkolbe til den ønskede mængde af dyrkningsmediet.

2. Kerneekstrakter

  1. Buffer og Reagensforberedelse
    BEMÆRK: Ekstraktioner udføres efter en modificeret Dignam m.fl. (1983) 14 kerneekstrakt procedure..
    1. Forbered 1X phosphatpufret saltvand, buffer A, buffer C og buffer D (tabel 1) dagen før fortsætter med ekstraktioner og opbevares ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Højere udbytter er generelt opnås med frisklavet buffer; imidlertid bufferen er stabil i flere uger. Det er vigtigt, at alle buffere, apparater og udstyr er forkølede og holdes kold under hele ekstraktioner.Brug en kold plads til så mange trin mulige og / eller holde alt på is. Tilføj DTT og PMSF umiddelbart før brug.
  2. Indsamling og vaske celler
    1. Hæld celler i fire 250 ml koniske flasker og slynger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C i en centrifuge med en svingende eller en rotor med fast vinkel. Dekanteres supernatanter og tilføje en anden 250 ml cellekultur medium til hver flaske. Gentag spin, indtil alle celler er blevet pelleteret.
    2. Resuspender kombinerede endelige pellets i alt 250 ml iskold PBS og pool i en 250 ml konisk flaske. Spin cellerne ved 400 x g i 10 minutter ved 4 ° C i en svingende spand centrifuge.
    3. Hæld supernatanten og resuspender cellepelleten i iskold PBS, så den samlede mængde ikke overstiger 50 ml. Løsn pellet via pipettering og overføres til en 50 ml konisk centrifugerør.
    4. Spin cellerne igen ved 500 x g i 6 min ved 4 ° C i en svingende spand centrifuge. Hæld supernatant og skøn og bemærk cellepelleten volumen (CPV) så præcist som muligt. Brug vand i en separat matchende rør, til sammenligning, hvis pillen er lavere end den mængde markeringer på røret.
  3. Cellelyse
    1. Tilføj DTT til buffer A. pellet resuspenderes i buffer A ved 5 volumener den anslåede CPV. Pipette til at bryde op pelleten og inkuberes på is i 10 min.
    2. Spin cellerne ved 931 x g i 10 minutter ved 4 ° C i en svingende spand centrifuge.
    3. Aspireres forsigtigt supernatanten i stedet for dekantering. Pillen volumen burde have forøget omtrent to gange i størrelse på grund hævelse af cellerne.
    4. Tilsæt 1 CPV buffer A til cellerne. Forsigtigt opbryde pellet og fjerne en lille portion (ca. 50 ul) til et mikrocentrifugerør på is. Overfør resuspenderede celler i en passende størrelse Dounce homogenisator (normalt 15 ml størrelse), afkølet på is.
    5. Lysere cellerne med 12-15 langsom, men støt slag af en type B (TIGht) pistil. Fjern en lille prøve af lysatet og undersøges i et mikroskop for komplet lysis (intakte små mørke kerner i forhold til opsvulmede celler) ved trypanblåt-farvning. Intakte celler vil være klar). Fortsæt homogenisering indtil 90% lysis opnås og stoppe her, kan i løbet af douncing negativ indflydelse kvaliteten af ​​nukleare ekstrakter.
    6. Overfør lysat i UltraClear ultracentrifugerør og bemærk det samlede volumen. Balance ved vejning af rør og centrifugering ved 1.069 xg i 10 min ved 4 ° C.
      BEMÆRK: ultracentrifuge anvendes på dette trin trods lavt spin hastighed, idet det samme rør bliver spundet ved højere hastighed i det næste trin. Denne tur vil give en temmelig stram pille, der dækker bunden af ​​røret med cloudier supernatant ovenfor, som kan opsamles og bruges til cytosol S100 ekstrakter. Hvis der er en synlig lipid lag på toppen af ​​røret, kan det fjernes.
    7. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette og hældes anoth.. is rør Undgå at forstyrre den kernepellet BEMÆRK: Det vil være vigtigt at kende det endelige rumfang supernatant for at bestemme pakket nukleare volumen (PNV).
  4. Forberedelse af Nuclear Extract
    1. Når supernatanten er blevet omhyggeligt fjernet, respin det rå kerneekstrakt pellet 25.453 xg i 15 minutter ved 4 ° C i det samme rør.
    2. Fjern den resterende supernatant (det skal være en lille mængde klar væske), og føje den til forrige supernatant samling. Mål det endelige volumen af ​​supernatanten. Beregn PNV ved at subtrahere denne mængde fra den samlede mængde af det oprindelige lysat tidligere bemærket. Alternativt, hvis pellet er stor nok, dens volumen kan estimeres ved sammenligning med tilsvarende mængde vand i et identisk rør.
    3. Tilsæt 1 PNV volumen buffer C (ca. 1 ml / ml celler). Løsne forsigtigt pille med en pipettespids og overføres til en passende siZed Dounce homogenisator. Hvis anvendelse af den samme homogenisator som før, forskylningen homogenisatoren med sterilt deioniseret vand.
    4. Resuspender pellet med ~ 5-10 slag via en Dounce homogenisator ved hjælp af en stram pistil.
    5. Overfør den homogeniserede nukleare lysat i et afkølet rør, og bland ved inversion i 30 minutter ved 4 ° C. Hvis volumen er stort nok, agitere anvendelse af en magnetisk omrøringsplade og spin-bar.
    6. Overfør lysatet til en ny Ultra centrifugeglas og spin ved 25.453 xg i 30 min ved 4 ° C. Pelleten bør være kompakt. Ca. 5 min før centrifugering er færdig, hydrat dialyse kassetter eller slanger, der har en passende molekylvægt (MWCO) (f.eks 7.000 kDa).
    7. Fjern supernatanten (kerneekstrakt) fra røret i et afkølet konisk rør ved anvendelse af en overførselspipette derefter fortsætte med dialyse.
  5. Dialyse
    1. Injicer uddrag i hydreret dialyse kassetter pr fabrikant "s instruktioner og dialyse nukleare ekstrakter i 500 ml buffer D 50 i 1 time ved 4 ° C under omrøring.
    2. Udskift buffer med 500 ml frisk, iskold Buffer D 50 og dialyseres i yderligere 4 timer ved 4 ° C. Dette 4 timer trin kan opdeles i to 2 HR ændringer i stedet.
    3. Fjern uddrag af dialyse kassette og overføre til kølede rør. Spin ekstrakter til 5 min ved 1.500 xg ved 4 ° C.
    4. Afmål af ekstrakterne i kølede, Eppendorf-rør og snap fryse i flydende nitrogen (50-100 pi per portion). Opbevar ved -80 ° C til fremtidig brug.

3.. RNA Probe Synthesis

  1. Skabelon Forberedelse
    BEMÆRK: Skabeloner anvendt til transkription kan være PCR-fragmenter eller plasmider, der indeholder en T7-eller SP6-promotor opstrøms og umiddelbart op til den ønskede probe sekvensen. Plasmid skabeloner skal lineariseret nedstrøms for templatesekvensen intpåløbne renter. Vi bemærkede højere udbytte fra PCR-skabeloner.
    1. Den T7/SP6 promotoren kan indsættes under PCR-reaktionen. Designe sense-primer med T7/SP6 promotor opstrøms for målsekvensen.
    2. Forstærk den ønskede sekvens i 2-3 reaktioner pr skabelon via PCR pr fabrikantens anvisninger ved hjælp af en high-fidelity-polymerase.
    3. Kombiner tilsvarende reaktioner og oprense ved gel ekstraktion.
    4. Sequence PCR-produkterne for at verificere skabelon nøjagtighed. (Valgfri)
  2. RNA transskription med 32P Mærkning
    1. Udfør in vitro-transskription fra 1 ug skabelon med et kommercielt tilgængeligt kit, der er kompatibel med projektlederen (SP6 eller T7) med følgende modifikationer. Brug 1 pi frisk 3.000 Ci / mmol [α-32P] UTP, 0.5 pi 10 mM kold UTP, 0.1 pi 10 mM GTP, og 0,9 pi 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G-RNA cap i et samlet endeligt volumen på 20 ul.
      BEMÆRK: G-cap forbedrer stabiliteten af RNA-transkriptioner i kerneekstrakter (cap: GTP) 10:1. Tilføjes kolde UTP at forhindre 32P-UTP fra at være den begrænsende reagens.
    2. Syntetisere en RNA størrelse stigen, som anført ovenfor, uden G cap. Kommercielle skabeloner fås til frembringelse af RNA-størrelse markør.
    3. Inkubér transkriptionsreaktioner ved 37 ° C i 1 time (for SP6 anvendelse 40 ° C). Når afsluttet, udfører DNase-fordøjelse af templaten i 15 minutter ved 37 ° C.
    4. Efter fordøjelsen tilsættes 1 ml af 0,5 M EDTA og 5 pi loading buffer II til RNA-substrater. Tilsæt 20 pi loading buffer II til markøren.
    5. Opvarm RNA markør og prober ved 95 ° C i 3 minutter og derefter placere på is.
  3. Polyakrylamidgel Casting / Probe elektroforese
    1. Klargør 1 L 6% polyacrylamidgel (PAGE) blanding og 400 ml 10% PAGE. For at gøre 6%, blandes 150 ml 40% 19:01 acrylamid: bis-acrylamide med 100 ml 10X Tris / borat / EDTA (TBE) og 460 g urea. Bring op til 800 ml med sterilt deioniseret vand og omrøres på en varmeplade, mens anvendelse svag varme (ca. 50-80 ° C). Komplet til 1 L med demineraliseret vand.
      BEMÆRK: Reaktionen er endoterm. Varme fremmer solubilisering af urinstof. Fjern fra varmen, så snart urea opløses og bringe løsningen på 1 L med demineraliseret vand. Alternativt omrøres ved stuetemperatur natten over; for meget varme kan initiere polymerisation.
    2. Beskyt SIDE mix fra lys med aluminiumfolie og opbevares ved stuetemperatur. PAGE blandinger kan tilberedes i god tid og er stabile i flere måneder.
    3. Forbered 400 ml 10% side mix ved at kombinere 100 ml af 40% 19:01 acrylamid: bis-acrylamid, 40 ml 10x TBE og 184 g urea. Efter urinstof opløses, fyld op til 400 ml med deioniseret vand.
      Alternativt forberede en 20% 19:01 acrylamid løsning og en 0% acrylamid løsning with puffer og med urinstof; disse kan derefter blandes i ethvert forhold til at give nogen procent mellem 0 og 20%; urinstof er altid langsom at opløse.
    4. Forbered 10-50 ml 10% ammoniumpersulfat (APS) opløsning i sterilt demineraliseret vand, afhængigt af antallet af geler at blive kastet.
    5. Vask 20 cm x 22 cm glas gelplader med 70% ethanol (EtOH). Tør med store fnugfri klude.
    6. Vask regelmæssig plade med 1 ml 5 N natriumhydroxid (NaOH) og derefter rewash med 70% EtOH. Coat det takkede plade med gel frastøder siliconizing løsning ved at tørre plade med en mættet lille Kimwipe.
    7. Saml pladerne ved at placere regelmæssig plade på en tom pipettespids boks eller et stykke Styrofoam at ophøje den fra bordet med det rensede opad. Lay 0,4 mm afstandsstykker på kanten af ​​hver langside.
    8. Forsigtigt notched plade over afstandsstykkerne så den coatede side vil være på indersiden af ​​gelen. Brug en barbermaskine eller en anden tynd instrument til at flytteafstandsstykkerne for en flush justering i bunden og siderne af gelplader og fastgør med bindemiddel klip på hver side af de gelplader over afstandsstykker.
    9. Forbered 30 ml 8% PAGE blanding pr gel ved at blande 15 ml 10% og 6% blander hver i et 50 ml rør. Hurtigt tilsættes 300 pi 10% APS efterfulgt af 30 pi N, N, N ', N'-tetra-methylethylenediamine (TEMED) til 8% gel mixet.
      BEMÆRK: Passende gel procenter for de enkelte sonde størrelser bør udvælges af forsøgslederen.
    10. Og vend 2x og hæld opløsningen i hak område af gelen plader. Vær sikker på at lidt ophøje pladerne i hånden og holde en jævn hælde indtil siden mix begynder at dryppe ud af bunden.
    11. Sænk pladerne tilbage til niveau og straks indsætte stor 8-godt rektangel kam til 0,4 mm x 20 cm gel. Små bobler nær bunden, vil ikke påvirke driften, men der bør ikke være bobler i brøndene.
      BEMÆRK: </ Strong> Place papirservietter på bordet under bunden og toppen af ​​gelen til at fange eventuelle udslip under hælde.
    12. Tillad PAGE blanding til at polymerisere i mindst 30 minutter.
    13. Overfør den polymeriserede gel til kølerummet og samle elektroforese-apparatet. Tilføj kold TBE buffer til fyld linjer på de øvre og nedre kamre.
    14. Kammen og bruge et barberblad til at fjerne eventuelle rester. Indstil gel i apparatet og anvender et bindemiddel clips til at holde pladen til tætningen. Føj kold TBE til den øverste kammer, indtil det flyder ind i pladerne.
    15. Brøndene vaskes med en 30 ml syringe/21 G 1-1/2 "nål fyldt med kold TBE lige før du lægger de mærkede RNA-substrater. Placer en aluminiumplade på bagsiden af ​​glasset for at hjælpe med ensartet fordeling af varme, mens den kører.
    16. Last 3 pi af markøren og hele 25 pi transkriptionsreaktion af hver RNA-substrat i separate brønde. Efterlad et godt mellem samme størrelse udskrifter til pRevent krydskontaminering. Bromphenolblåt og xylencyanol farvestoffer i loadingpufferen kan anvendes til at estimere størrelsen af ​​migration i gelen.
    17. Gelen løbe ved en konstant wattforbrug passende for størrelsen af RNA-prober (fx 25 watt i 2 timer for prober 600 nt).
  4. Mærket RNA ekstraktion og oprensning
    1. Efter elektroforese omhyggeligt dræne det øverste kammer i gel-apparatet. Det meste af radioaktiviteten vil være i gelen og den nederste kammer; imidlertid kan den øvre buffer indeholde noget radioaktivt materiale.
    2. Brug en bakke til at transportere gelen hvis flytte til et andet radioaktivt materiale arbejdsområde. Forsigtigt fjerne afstandsstykkerne ved at trække det udragende stykke sideværts bort fra gelen.
    3. Forsigtigt adskille pladerne. Gelen bør holde sig til den plade, der ikke var siliconiseret. Læg et stykke plastfolie over gel og glaspladen.
    4. Placer en glogos autorad markør mærkat på plastikfolie i en eren af ​​gelen, der er fri for eventuelle prøver.
    5. I et mørkt rum, anbringe et stykke af autoradiografi film over hele pladen og udsætte mindst 1 min. Udvikle filmen.
    6. Anbring den fremkaldte film på en lys overflade. Derefter placere plastik side af gelen med forsiden nedad på filmen og tilpasse autorad markør fra gelen til den udsatte markør på filmen. Når linie, skal du bruge en sort markør til at markere placeringen af ​​de ønskede bands på glasset.
      BEMÆRK: Alternativt justere geler / film på følgende måde at skære ud RNA bands. I det mørke rum, skal du placere den indpakkede gel på et bord, skal du placere filmen på toppen af ​​det og læg en kassette (eller bog, etc.) oven på det stykke af filmen. Flick på lyskontakten i rummet kortvarigt, derefter slå hvis off. Dette vil "prøveflashen 'filmen genererer en oversigt over alle brønde på film som følge af tryk / beskyttelse mod lys, at kassetten på toppen giver. Dette gør det nemt at tilpasse filmen på gelen og senderdet bånd, uden anvendelse af fluorescerende markører.
    7. Fjern forsigtigt plastfolie og bruge en frisk skalpel eller barberblad for hver RNA substrat og punktafgifter båndene fra gelen og anbringes i separate 1,7 ml mikrocentrifugerør. Brug en nutator for blide Bevægelser under eluering.
    8. Tilsæt 500 pi RNA elueringspuffer (0,5 M ammoniumacetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) til hvert rør. Kort fortalt centrifugeres at oversvømme gelfragmentet. Der inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 3-16 h afhængig af sonde størrelse.
    9. Overfør hele 500 pi eluerede materiale i et nyt rør. Undgå at overføre eventuelle gelstykker da de vil forstyrre rensning. Tilsæt 1 pi glycogen (20 mg / ml) sammen med 500 pi kold, sur phenol-chloroform (for RNA).
    10. Kortvarigt vortex, skal opløsningen synes uklar. Spin ved stuetemperatur ved tophastighed (~ 16.000 xg) i 5-6 min.
    11. Omhyggeligt transfer toppen (vandige) lag til nye rør indsamle så meget som muligt og samtidig undgå eventuelle rester fra interfasen. Tilføj en lige mængde chloroform til den overførte vandige lag. Gentag trin 3.4.10 og overføre den øverste (vandige) lag til et nyt rør. Der tilsættes 1 ml iskold 95-100% EtOH til det indsamlede materiale. Inkuberes ved -80 ° C i 10 minutter BEMÆRK:. RNA kan opbevares natten over, hvis det ønskes.
    12. Pelletere RNA i 30 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C. Hæld forsigtigt supernatanten i et radioaktivt affald beholder, og der tilsættes 1 ml iskold 70% af molekylærbiologisk kvalitet EtOH til hver pellet.
    13. Pelletere RNA ved 16.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, hæld supernatant spinde i 1 min og fjerne enhver rest EtOH via pipette og henstår ved stuetemperatur med hætter åbne for at muliggøre fordampning af resterende EtOH.
    14. Resuspendere pillerne i 20-30 ul RNase-frit vand. Mærket RNA kan opbevares ved -80 ° C.
      BEMÆRK: En radioaktiv undersøgelse måler bør anvendes i hele udvinding procedure at kontrollere, at de mærkede RNA ikke er gået tabt i løbet af en trin.
  5. Kvantificering af mærket RNA til et præ-mRNA 3'-mRNA spaltningsreaktion
    1. Tilnærme molariteten af ​​spalt substrater ved hjælp af følgende procedure.
      1. Tag for eksempel 1 ul 3000 Ci / mmol [α-32P] UTP og 10 mCi / ml. (På etiketten skæringsdatoen, vil den kemiske koncentration denne bestand løsning være 3,3 uM UTP. Inden denne dato det er højere, og en halveringstid (~ 13 dage) efter den dato, det er ~ 1,6 mM, etc.) Det mærkede UTP bidrag til den endelige koncentrationen i reaktionsblandingen er typisk ubetydelige, når en endelig kold UTP koncentration over UTP K m anvendes. T7 RNAP K m for UTP er 114 mM 15.
      2. Fortynd 1 ml i 39 pi vand. Derefter tilsættes 1 ml af fortyndet [α- (BEMÆRK: scintillationsfluid faktisk ikke nødvendig for denne specifikke aktivitet af 32P som Cerenkov optælling vil give pålidelige cpm værdier også Kontroller scintillationstælleren manual for at vælge den korrekte kanal for Cerenkov optælling og tælle en 1 ml volumen i 1 min.).
    2. Fortyndes 1 ml af hver mærket RNA substrat i separate hætteglas med et tilsvarende beløb af scintillationsvæske anvendt i det foregående trin. Sørg for at have et hætteglas med kun scintillationsvæske at beregne baggrund. Kvantificere radioaktivitet i en scintillationstæller.
    3. Gang tællinger pr min (cpm) for [α-32P] UTP prøve med 40 til faktor i den indledende fortynding og trække baggrunden opnået ved scintillationsfluid alene. Multiplicer tællinger for hver RNA-probe af mængden af ​​RNase-frit vand (20-30 pi), der anvendes for at opblande RNA prober. Dette giver den totale cpm af det oprensede RNA.
      Eksempel:. Maks. CPM = (CPM [α-32P] UTP - baggrund) x 40 mærket RNA Prøve 1 = 20.000 cpm x 20 = 400.000 cpm (hvis 20 pi benyttes til resuspension)
    4. Hvis en anden end 1 pi [α-32P] UTP beløb blev anvendt til at fremstille transkripter, så faktor dette volumen i den endelige cpm af [α-32P] UTP ved at multiplicere cpm for [α-32P] UTP prøven ved den anvendte mængde.
      Eksempel: 2 pi [α-32P] UTP bruges til at lave udskrifter. Den beregnede cpm for 1 pi [α-32P] UTP er 500.000 cpm. Multiplicer 500.000 * 2 = 1.000.000 cpm
    5. Divider den beregnede mærkede RNA cpm af den beregnede CPM for [α-32P] UTP alene. Det vil groft estimere andelen af ​​mærket UTP indarbejdet.
      Eksempel: 400.000 / 1.000.000 = 0,40 eller 40%indarbejdet
    6. Da et enzym ikke kan skelne mellem isotoper, er den samme procentdel af mærket og umærket UTP inkorporeret i RNA under transkriptionen. Mængden af kold UTP i mol, der er tilføjet til transskriptionsreaktionen (0,5 pi af en 10 mM opløsning = 5,0 x 10 -9 mol UTP).
    7. Multiplicer mol UTP i reaktionen af ​​procent indarbejdet (kendt fra den varme UTP tælle ovenfor), og derefter dividere dette med antallet af uridines i RNA-sekvensen.
      Eksempel: 5,0 x 10 -9 mol UTP x 0,40 = 2 x 10 -9 mol UTP
      2 x 10 -9 mol UTP / 73 E pr udskrift = 2,7 x 10 -11 mol RNA
    8. Konverter mol RNA til molaritet ved at dividere mængden af ​​den udvundne RNA resuspension løsning.
      Eksempel: 2,7 x 10 -11 mol RNA / 20 gl = 1.370 nM RNA. For T7 RNAP transkripter fremstillet fra omkring 1 ug lineærliseret plasmid og resuspenderet i 20 pi vand, værdier på 200 til 1.400 nM er typiske.
      BEMÆRK: Den molære koncentration af RNA anvendes til at sikre, at den endelige præ-mRNA substratkoncentration i in vitro-spaltningsreaktionen er mindre end 5 nM pr spaltningsreaktion. Spaltning effektivitet kan falde, hvis RNA-koncentrationen er hævet væsentligt over 5 nM.

4.. 3'mRNA spaltningsreaktion

  1. Spaltning Reaktion Reagensforberedelse
    1. Forbered alle de reagenser, der er nødvendige for spaltningsreaktionen. Gør 10% polyvinylalkohol (PVA) med kogende vand og tilsæt langsomt korrekte mængde PVA pulver. 10% PVA bliver tyktflydende og tager tid at opløse. Opbevares ved stuetemperatur eller -20 ° C.
    2. Forbered 1 M kreatin fosfat (KP) og opbevares ved -80 ° C. Det er vigtigt at anvende 1 M CP, der er mindre end 4 måneder gamle.
    3. Forbered 1 M DTT og butikved -20 ° C. Lav en frisk 0,2 M DTT fortynding fra 1 M DTT lige forud for at gøre kløvningsreaktionen.
    4. Forbered ETS (spaltning stopopløsning): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Spaltning Reaktion
    1. Opvarm mærkede RNA til 80 ° C i 2 minutter og derefter placere på is.
    2. Forsigtigt Vortex og derefter dreje 10% PVA i topfart til 2-3 min for at fjerne bobler.
    3. Master mix 1: For en enkelt reaktion, kombinere 3,125 pi 10% PVA, 0,625 pi 1 M CP, 0,25 pi 0,5 M tRNA, 0,125 pi 100 mM dATP, 0,13 gl 40 U / ul RNase-inhibitor, 0,25 pi 0,1 M EDTA pH 8 , 0,1 pi 0,2 M DTT og 0.645 pi RNase-frit vand. Dispensér 5,25 gl mester mix 1 per rør på is.
    4. Master mix 2: Brug 6.25 gl / reaktion af kerneekstrakter ved koncentrationer højere end 2 mg / ml. Kerneekstrakter kan fortyndes med buffer D 50, hvis neeDED.
    5. Kombiner de 6,25 pi kerneekstrakt med den tidligere udleveret 5,25 pi mester mix 1. Tilføj 1 ml af mærket RNA substrat, der fortyndes til 50 nm. Alternativt kan RNA indgå i Master mix 1, forudsat at det tilføjes efter RNase-inhibitor, DTT og tRNA BEMÆRK:. Brug <5 nM af det mærkede RNA substrat.
    6. Forsigtigt Vortex og hurtig tur hver prøve for at fjerne bobler. Inkuber ved 30 ° C i op til 2 timer, men et tidsforløb skal udføres for at opnå optimale resultater. Længere inkubationer kan øge nedbrydning baggrund.
  3. Proteinase K fordøjelse og oprensning
    1. Fjern prøverne fra varmen og tilsæt 182,5 ul ETS stop-løsning til hver reaktion. Tilsæt 5 ul 20 mg / ml proteinase K og inkuber prøverne ved 37 ° C i 10 min.
    2. Uddrag RNA ved tilsætning af 1 volumen (200 ul) af syre phenol-chloroform, 1 / 10. volumen (20 ul) af 3 M natriumacetat og 1 ml af 20 mg / ml glycogen. Fortsæt med ekstraktioner som beskrevet i afsnit 3.4.9-3.4.14.
    3. Når RNA-ekstraktion er afsluttet, skal du sørge for at fjerne alle resterende EtOH. Pellet resuspenderes i 8 pi påsætningspuffer (90% formamid, 10 mM EDTA, med bromphenolblåt (BFB) (og eller XylenCyanol blå)). Prøverne kan opbevares ved -80 ° C eller gå videre med gelelektroforese.
  4. Spaltning Reaktion Elektroforese
    1. Forbered en 6% acrylamid gel som tidligere nævnt i afsnit 3.3.1-3.3.17 med nogle få ændringer. Brug 20 cm x 42 cm sekventeringsgel plader med 2 bindemiddel klip på hver langside. Anvend en 32-brønds kam og forberede 40 ml gel mix.
    2. Load gelen med 3 ul markør og 5 pi af hver prøve. Optimer elektroforese indstillinger i henhold til præ-spaltning og kløvet produkt størrelser.
    3. Når elektroforese er fuldført, skal du følge § § 3.4.1-3.4.3 </ Strong> for at demontere gelen. I stedet plastfolie, skære et stykke filtrerpapir til størrelsen af ​​gelpladen og omhyggeligt placere den på den ene side af den eksponerede gel.
    4. Tryk filterpapiret fast på gelen, derefter vende over pladen, således at filtrerpapiret er på bunden og glasset er på toppen. Pres glasset ned på bordet for at sikre, at gelen gribende filterpapiret jævnt.
    5. Langsomt skræl filterpapir, som bør have gelen knyttet til det, fra en af ​​de korte ender, indtil alle filtrerpapiret med gel vedhæftet fjernet fra glaspladen.
    6. Dæk den blotlagte gel side med plastfolie. Tape plastikfolie til filtrerpapir.
    7. Gelen anbringes på en gel tørretumbler med filteret vendende vakuumsiden. Tør i 15 min, eller indtil gelen er helt tørt.
      BEMÆRK: Hvis en gel tørretumbler ikke er tilgængelig, kan røntgenfilm blive brugt til at visualisere RNA bands. Eksponeringen skal udføres i en light-tight kassette med intensivering skærm ved -80 ° C. Eksponeringstid bestemmes empirisk. Forsigtig: lav procent acrylamidgeler kan revne ved frysning.
    8. Gelen kan nu anvendes til at eksponere film eller anvendes med en phospho-imager. Eksponeringstid afhænger af styrken af ​​det mærkede RNA. I første omgang en 24 timers udsættelse kan anvendes. Hvis du bruger film, udsættes ved -80 ° C med en intensivering skærm og tillade at varme op til stuetemperatur, før udviklingslandene.
    9. Mål forholdet mellem kløvet og un-spaltede RNA i hver prøve at kvantificere kavalergang effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater af en spaltning analyse af RNA-poly (A) områder af HIV-1 (figur 2). Vi kan se det uspaltede RNA-substrat, som er den langsomste vandrende bånd på toppen af ​​gelen. Den specifikke spaltede produkt er det mest intense kortere fragment band, der kører hurtigere i gelen ved den forventede størrelse, og er specielt fraværende fra spaltning analysen af ​​mutpoly (A) kontrol, som indeholder et punkt mutation i polyA sekvens (mutPolyA) RNA substrat. Nedbrydningsprodukter af input substrat kan undertiden iagttages. Kvantificeringen af spaltningen aktivitet kan bestemmes ved densitometrisk afbildning af forholdet mellem uspaltede til spaltet RNA normaliseret til 100% af ikke-spaltede RNA.

Figur 1
Fig. 1. Skematisk afbildning af HIV-præ-mRNA 3'-ende forarbejdning substrater, og forventede produkter af in vitro spaltning og polyadenylation reaktioner. spaltningsstedet, dinukleotidet-CA-, ligger 25 nt nedstrøms fra polyA stedet AAUAAA. LTR-regioner: U3 (unik 3'-sekvensen), R (gentaget sekvens), og U5 (unik 5'-sekvens).

Figur 2
Figur 2. (A) Poly (A) stedet spaltning. 32P-mærkede RNA indeholdende poly (A) af HIV-1 og et punkt mutation af poly (A)-signal, der afskaffer spaltning (mutPolyA) inkuberet i kerneekstrakter af HeLa-S3-celler eller BSA som en negativ kontrol. Fed pil indikerer 5'spaltet produkt. 3'-fragmentet ofte løber af gel eller nedbrydes og ikke altid er synlig. (B) Densitometrisk plot af spaltning aktity udtrykt som et forhold mellem uspaltet til spaltet RNA normaliseret til 100% af uspaltet RNA.

Buffer A (100 ml) 10 mM Tris (pH 7,9), 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCI, 0,5 mM dithiothreitol (DTT). Tilføj DTT lige før du bruger buffer A under udvinding. Tilføj 1 ml af 1 M DTT per 1 ml buffer A.
Puffer C (50 ml) 20 mM Tris (pH 7,9), 25% (v / v) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,5 mM DTT, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Tilføj en proteasehæmmer cocktail tablet morgenen ekstraktioner.
Buffer D 50 (2-4 L) 20 mM Tris (pH7.9), 20% (v / v) glycerol, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 50 mM ammoniumsulfat. HEPES-KOH kan erstatte Tris i puffer A, C og D.
0,5 M amonium acetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) Opbevares ved stuetemperatur.
Stop Buffer (ETS) 10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,5% SDS Opbevares ved stuetemperatur.
Spaltning Loading Buffer 90% formamid, 5 mM EDTA pH 8, 0,025% bromphenolblåt Opbevar ved -20 ° C.

Tabel 1. Sammensætning buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro-præ-mRNA 3 'kløvningsreaktionen udført i HeLa celle kerneekstrakter eller spaltningsprodukter faktorer fraktioneret fra disse ekstrakter, har gjort det muligt at identificere de centrale spaltningsprodukter faktorer og deres vigtigste komplekser 16-21. Mange flere proteiner forbundet med disse faktorer er for nylig blevet identificeret 22, og in vitro reaktionen kan fortsætte med at kaste lys over, hvordan disse proteiner bidrager til reaktionen. Måske fordi reaktion in vivo synes at være cotranscriptional 23 eller fordi nogle medvirkende faktorer kan gå tabt ved ekstraktion og dialyse effektivitet ofte er dårlig, og sjældent er mere end 30% spaltning er opnået. Desuden kan reaktionen effektivitet pludselig falde fra dag til dag uden synlig grund. Derfor er det vigtigt at værdsætte, hvilke skridt er mest kritisk, især når man forsøger at tilpasse reaktion på ændringer eller viralt inficerede HeLa-cells, til andre celletyper eller til nye substrater.

Uden tvivl, at kvaliteten af ekstrakt og friskhed af in vitro-transskriberede RNA er altafgørende, som det er nødvendigt at arbejde under pinligt RNase-fri forhold. Sundheden af ​​cellerne på det tidspunkt, de høstes til ekstraktion er også vigtig. Cellerne skal vises sundt, bør de fordobling på mindre end 24 timer, bør de være i eller nærmer sig midt log fase, og der bør være nogle døde celler eller andre uforklarlige vragrester. Naturligvis bør cellerne ikke være forurenet med mycoplasma eller andre bakterier. Substratet bør ikke gøres med en for høj specifik aktivitet, da dette kan føre til tilsyneladende nedbrydning.

Når en tilstrækkelig stor sekvens på begge sider af spaltningsstedet overvejes, og alternativ polyadenylering tegner sig for, antallet af forskellige poly (A)-sekvens signaler i det humane genom utvivlsomt overstiger antallet af gener 24 25. Kombinationen af ​​en svag poly (A) signal sekvens med andre end standard HeLa-celler celler kan bevise frustrerende, og det er bedre først at bruge en stærk substrat med nye celler, eller modificerede HeLa-celler med en potentielt svag polyA substrat.

Selv efter så mange års succesfuld brug, er der stadig mindre mysterier forbundet med in vitro-3 'spaltningsreaktion. For eksempel, hvorfor er kreatin fosfat nødvendig? Det er blevet påvist, at den oprindelige grund til at inddrage det - at regenerere ATP swimmingpool - er ikke gyldig 26. Interessant nok kan det udelades med kun delvis tab af aktivitet, når nukleare ekstrakteranvendes, men bliver gradvist mere nødvendig, da ekstrakten fraktioneret i delvist oprensede spaltningsprodukter faktorer, der anvendes til at rekonstituere reaktionen. Faktisk phosphocholin, en anden lille molekyle med en gruppe phosphat og en positivt ladet amin, men som ikke har nogen in vivo-rolle i reaktionen, har vist sig at være mere effektiv end creatinphosphat, i det mindste i den rekonstituerede reaktionen 27. PVA er en anden ingrediens, hvis kravet ikke er fuldt forklaret. Det antages at være en fortrængning agent, hvilket fører til en reel forøgelse i spaltning faktor koncentration, men andre fortrængning agenter, ligesom polyethylenglycol, fungerer ikke nær så godt. Forståelsen af ​​disse faktorer kan føre til forbedret effektivitet, således at udvidelse af metoden på mindre effektiv celletyper og RNA-substrater og vil kunne give et fingerpeg om, hvordan de forskellige faktorer virker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

SV er taknemmelig for finansieringen støtte fra NIH K22AI077353 og Landenberger Foundation. KR taknemmelig midler fra NIH (5SC1GM083754).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Celstir flask Wheaton 356884 Different sizes available
4 position slow speed stirrer VWR 12621-076
Swinging bucket centrifuge Beckman Coulter Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R Eppendorf Refridgerated
Thermomixer incubator Eppendorf
250 ml conical tubes Corning 430776
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
Ultraclear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
JOKLIK modified MEM Lonza 04-719Q
Fetal bovine serum Atlas F-0500-A Heat inactivated
L-glut:pen:strep Gemini Bio-Products 400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0 Mediatech 46-031-CM
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Potassium chloride MP Biomedicals 194844
HEPES Fisher BP310-500
DTT Alexis Biomedicals 280-001-G-010
Glycerol Fisher BP229-4
5 M sodium chloride solution Mediatech 46-032-CV
EDTA 0.5 M solution Sigma-Aldrich E7889-100ml
EDTA Fisher BP120-500
PMSF Thermo Scientific 36978
Ammonium sulfate Fisher A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit Thermo Scientific 66372 MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D9938-1SET Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit Roche 11 732 650 001
10 mM dNTP Mix Invitrogen Y02256 10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit Ambion AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap New England Biolabs S1404S
Century Marker Template Plus Ambion AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi Perkin Elmer BLU507H250UC
Gel loading buffer II Ambion 8546G
DEPC treated water Ambion AM9906
10x TAE Fisher BP13354
10x TBE Ameresco Life Sciences 0658-4L
10x PBS Fisher BP399-20
Urea Fisher BP169-212
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
TEMED Fisher BP150-20
Ammonium acetate Fisher A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide Bio-Rad 161-0144
Glycogen Roche 10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof Acros 61509-0040
Acid phenol:chloroform Ambion 9720 For RNA
Scintilation fluid Fisher SX18-4
Rnase inhibitor Promega N261B
Polyvinyl alcohol- PVA Sigma-Aldrich P8136-250G
Creatine phosphate Calbiochem 2380
100 mM dATP Fisher BP2560-4
SDS Acros 23042-5000
Proteinase K Fisher BP1700-100
Adjustable sequencing unit Sigma-Aldrich Z351881-1EA
Binder clips Office Depot 838-056
20 cm x 42 cm glass plates Sigma-Aldrich Z352543 1 SET
20 cm x 22 cm glass plates Sigma-Aldrich Z35252-7 1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates Sigma-Aldrich Z352667 1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers Sigma-Aldrich Z35230-6 1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers Sigma-Aldrich Z352314-1 1 SET
8-well comb Sigma-Aldrich Z35195-4 1 EA
16-well comb Sigma-Aldrich Z351962 1 EA
32-well comb Sigma-Aldrich Z351970 1 EA
Gel repel coating C.B.S. Scientific SGR-0401 or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips Rainin GT-10-4 0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV Bio-Rad PowerPac HV 5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583 Bio-Rad Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers Agilent 420201
Film 8 x 10 Midsci BX810
Film 14 x 17 Phenix F-BX1417
Autoradiography cassette Fisher FBCA 1417 8 x 10 size available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  2. Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
  3. Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
  4. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
  5. Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
  6. Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
  7. Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
  8. Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
  9. Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
  10. Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
  11. Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
  12. Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
  13. Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
  14. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
  15. Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
  16. Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
  17. Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
  18. Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
  19. Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
  20. Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
  21. Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
  22. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
  23. Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
  24. Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
  25. Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
  26. Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
  27. Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).

Tags

Infektionssygdomme Spaltning polyadenylering mRNA-processering Kerneekstrakter 3 'Behandling Complex
Analyse af RNA Processing Reaktioner Brug Cell Free Systems: 3 &#39;End spaltning af præ-mRNA Underlag<em&gt; In vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jablonski, J., Clementz, M., Ryan,… More

Jablonski, J., Clementz, M., Ryan, K., Valente, S. T. Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro. J. Vis. Exp. (87), e51309, doi:10.3791/51309 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter