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Biology

पूर्व mRNA Substrates के 3 'अंत विखंडन: सेल फ्री सिस्टम का प्रयोग शाही सेना प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण Published: May 3, 2014 doi: 10.3791/51309
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

Summary

शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय परिपक्व mRNA की 3 'के अंत से परे फैली हुई है कि एक अग्रदूत आरएनए synthesizes. परिपक्व शाही सेना के अंत दरार परिसर के endonuclease गतिविधि के माध्यम से, आरएनए दृश्यों से तय एक साइट पर, cotranscriptionally उत्पन्न होता है. इधर, विस्तार विट्रो में दरार प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विधि हम.

Abstract

स्तनधारी mRNAs का 3 'अंत शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (RNPII) द्वारा प्रतिलेखन की अचानक समाप्ति द्वारा गठित नहीं है. इसके बजाय, RNPII परिपक्व RNAs के अंत से परे अग्रदूत mRNA synthesizes, और endonuclease गतिविधि के एक सक्रिय प्रक्रिया एक विशिष्ट स्थल पर आवश्यक है. अग्रदूत शाही सेना के विखंडन सामान्य रूप से सीए dinucleotides के बाद आम सहमति Pólya साइट (AAUAAA) से नीचे की ओर NT 10-30 होता है. दरार जटिल, लगभग 800 केडीए के एक multifactorial प्रोटीन जटिल, से प्रोटीन इस विशिष्ट nuclease गतिविधि को पूरा. विशिष्ट शाही सेना दृश्यों नदी के ऊपर और Polya साइट के बहाव दरार जटिल की भर्ती पर नियंत्रण. तुरंत दरार के बाद, पूर्व mRNAs परिपक्व स्थिर आरएनए संदेशों का उत्पादन करने के लिए Pólya पोलीमर्स (पीएपी) द्वारा polyadenylated रहे हैं.

एक शाही सेना प्रतिलेख के 3 'अंत के प्रसंस्करण विशिष्ट radiolabeled शाही सेना substrates के साथ सेलुलर परमाणु अर्क का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. संक्षेप में, एक लंबे समय 32 </ Sup> पी लेबल uncleaved अग्रदूत आरएनए विट्रो में परमाणु निष्कर्षों के साथ incubated है, और दरार जेल वैद्युतकणसंचलन और autoradiography द्वारा मूल्यांकन किया है. उचित दरार होती है, जब '5 एक छोटी उत्पाद का पता चला और मात्रा निर्धारित है cleaved. यहाँ, हम एक उदाहरण के रूप में, का उपयोग कर विस्तार से एचआईवी -1 mRNAs का 3 'अंत प्रसंस्करण दरार परख का वर्णन.

Introduction

सबसे परिपक्व यूकेरियोटिक संदेश RNAs (mRNAs) के biosynthesis ऐसे कैपिंग, splicing और polyadenylation के रूप में कई बाद transcriptional संशोधनों की आवश्यकता है. इन संशोधनों को आम तौर पर सही प्रसंस्करण 1 सुनिश्चित करने और जोरदार mRNA की स्थिरता को बढ़ाने के लिए मिलकर कर रहे हैं.

3 'स्तनधारी पूर्व mRNAs का अंत गठन से 5 adenylate अवशेषों के अलावा द्वारा पीछा नवजात शाही सेना के endonucleolytic दरार से उत्पन्न होता है' पाली (ए) पोलीमर्स (पीएपी) 2-4 से उत्पाद cleaved. स्तनधारियों में, दरार विशिष्ट पूर्व शाही सेना दृश्यों पर assembles जो लगभग 800 केडीए, के, एक multicomponent प्रोटीन जटिल द्वारा पूरा किया है. पाली (ए) संकेत अनुक्रम, एक उच्च संरक्षित विहित hexanucleotide अनुक्रम AAUAAA, पर लगभग 10-30 NT नीचे की ओर दरार साइट निर्देशन. इस साइट में विशेष रूप से दरार और polyadenylation विशिष्टता कारक (CPSF) और 73 केडी सबयूनिट द्वारा मान्यता प्राप्त हैCSPF endonuclease गतिविधि में शामिल है. दरार उत्तेजना कारक (CstF) नीचे की ओर पाली (ए) साइट की एक अधिक पतित गुजरात या यू युक्त तत्व अनुक्रम बांधता है. इसके अलावा स्तनधारी दरार कारक मैं (CFIm), और स्तनधारी दरार कारक द्वितीय (CFII) दरार के लिए आवश्यक है. CFIm जीनों के एक नंबर के लिए परिभाषित और महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं 5-8 में शामिल होने लगते किया गया है कि नदी के ऊपर अनुक्रम तत्वों (का उपयोग करता है) में विशिष्ट UGUA (एन) साइटों बांधता है.

इन विट्रो में, शाही सेना प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं आमतौर पर radiolabeled शाही सेना substrates 9-12 के उपयोग से विश्लेषण कर रहे हैं. ये जीवाणुभोजी प्रमोटर T7 या SP6 से रन ऑफ प्रतिलेखन द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है. पहले विशेषता नहीं किया गया है कि एक polyadenylation साइट का अध्ययन करते हैं, यह महत्वपूर्ण अनुप्रवाह दृश्यों सीडीएनए में उपस्थित नहीं हो सकता है, के रूप में शाही सेना सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए जीनोमिक डीएनए के बजाय सीडीएनए का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. कम से कम 150 NT upstrea शामिल करने के लिए डिजाइन substratesमीटर और 50 NT बहाव के परिपक्व mRNA पर दरार साइट / अंत से. दरार उत्पाद सब्सट्रेट की तुलना में तेजी प्रवास करती है; अन्य टुकड़े गैर विशिष्ट nuclease कार्रवाई से उत्पन्न हो सकता है क्योंकि हालांकि, प्रतिक्रिया की विशिष्टता सही प्रसंस्करण संकेत दृश्यों पर अपनी निर्भरता द्वारा सत्यापित किया जाना है. इसलिए, AAUAAA अनुक्रम (जैसे AAGAAA) में एक बिंदु उत्परिवर्तन के साथ शाही सेना substrates दरार प्रतिक्रिया के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.

Radiolabeled शाही सेना की एक छोटी राशि दरार प्रतिक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है यह देखते हुए कि ज्यादातर परमाणु अर्क में उच्च बहुतायत में मौजूद RNases समस्याग्रस्त हो, और निकालने की तैयारी के लिए शुरू सामग्री के विकल्प सीमित कर सकते हैं. HELA कोशिकाओं अंतर्जात RNases के निम्न स्तर के होते हैं, और इस प्रकार इन assays में अच्छा प्रदर्शन करते हैं.

vivo में इन विट्रो में शाही सेना के substrates endonucleolytic दरार तुरंत पाली (ए) के अलावा, गुरु द्वारा पीछा किया जाता हैएस cleaved मध्यवर्ती detectable मात्रा में मौजूद नहीं है. इसलिए, एक विशिष्ट शाही सेना अनुक्रम या एक दरार प्रतिक्रिया में शामिल प्रोटीन या तो अध्ययन करने के लिए, प्रयोगों से होने वाली polyadenylation रोकने कि परिस्थितियों में किया जाता है. एक दरार प्रतिक्रिया को नुकसान पहुँचाने के बिना polyadenylation रोक सकता है तो कोई polyadenylation पर दरार की निर्भरता, या इसके विपरीत, वहाँ है. इस प्रकार, एटीपी केवल एक एकल nucleotide पाली (ए) साइट पर शामिल किया जा सकता है और सिर्फ cleaved आरएनए का पता लगाया जा सकता है कि इतनी 3 'हाइड्रॉक्सिल समूह का अभाव है कि एक श्रृंखला समाप्त एनालॉग साथ बदल दिया है.

जटिलता और परख के इस प्रकार की ख़ासियत के उच्च स्तर को देखते हुए, हम इन विट्रो में mRNA व्यापारियों की दरार / पाली (ए) मशीनरी द्वारा endonucleolytic दरार अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल का वर्णन. हम सक्षम परमाणु अर्क तैयार radiolabeled शाही सेना substrates उत्पन्न, दरार प्रतिक्रिया करते हैं, और परिणाम का विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए कैसे का वर्णनआईएनजी उत्पादों. चित्रा 1 एक दरार परख के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एचआईवी -1 पूर्व mRNAs का 3 'अंत के लिए एन्कोडिंग सब्सट्रेट RNAs के एक उदाहरण से पता चलता है. एचआईवी आरएनए जीनोम की 3 'अंत पाली (ए) साइट, एक जी यू समृद्ध क्षेत्र, और सभी वायरल mRNA टेप 13 के कुशल परिपक्वता के लिए आवश्यक हैं का उपयोग करें जो तत्व के रूप में कई महत्वपूर्ण विनियामक दृश्यों से बना है . इस उदाहरण में हम इनपुट शाही सेना सब्सट्रेट 338 NT और दरार 237 पर NT होने की उम्मीद है. Polyadenylation होने की अनुमति दी गई थी, तो उत्पादों की एक धब्बा 237 और 437 NT के बीच मनाया जाएगा.

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Protocol

निलंबन में पक्षपाती कोशिकाओं की 1. अनुकूलन

(यह एक वैकल्पिक कदम है. निलंबन कोशिकाओं आम तौर पर, हालांकि प्लेटों में विकसित कोशिकाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है बेहतर परमाणु अर्क हैं.)

  1. पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन: 5-10% नवजात बछड़ा सीरम या भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एल glutamine के साथ पूरक Joklik के संशोधित सदस्य का उपयोग निलंबन में वृद्धि के लिए पक्षपाती कोशिकाओं को अपनाना. 8% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक फिल्टर टोपी के साथ स्पिनर बोतल में कोशिकाओं प्रचार.
  2. कोशिकाओं आदत डाल करते हैं, एक 500 मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी में 100 मिलीलीटर के साथ शुरू करते हैं. एक न्यूनतम 0.3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल बनाए रखें और समुचित विकास दर (आमतौर पर 2-6 सप्ताह) हासिल की है जब तक हर 1-2 दिनों मध्यम बदलें. . एक बार अनुकूलित, निलंबन में HELA कोशिकाओं लगभग हर 24 घंटा नोट डबल चाहिए: कक्षों अपने सामान्य दोहरीकरण दर पर लौटने के लिए रूपांतरण चरण के दौरान, यह कुछ समय लगेगा.
  3. एक मांद में कोशिकाओं को बनाए रखनेवांछित अंतिम मात्रा में 0.5-0.8 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की sity (आमतौर पर 1-10 एल)
  4. कोशिकाओं को आमतौर पर मध्य लॉग चरण (लगभग 0.5-0.65 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल और> 90% व्यवहार्य) में काटा जाता है. संस्कृति मीडिया के वांछित राशि के लिए उपयुक्त आकार स्पिनर कुप्पी का प्रयोग करें.

2. परमाणु अर्क

  1. बफर और अभिकर्मक तैयार
    नोट: एक्सट्रैक्शन एक संशोधित Dignam एट अल के बाद किया जाता है (1983) 14 परमाणु निकालने की प्रक्रिया..
    1. , 1X फॉस्फेट बफर खारा को तैयार एक, बफर सी बफर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक्सट्रेक्शन और दुकान के साथ आगे बढ़ने से पहले दिन डी (1 टेबल) बफर
      नोट: अधिक पैदावार आम तौर पर हौसले से तैयार बफर के साथ प्राप्त कर रहे हैं; हालांकि, बफर कई हफ्तों के लिए स्थिर है. यह सभी buffers, apparatuses और उपकरणों पूर्व ठंडा और एक्सट्रेक्शन की सम्पूर्णता के लिए ठंडा रखा जाता है महत्वपूर्ण है.संभव के रूप में कई चरणों के लिए एक ठंडे कमरे का उपयोग करें और / या बर्फ पर सब कुछ रखना. तुरंत उपयोग करने से पहले डीटीटी और PMSF जोड़ें.
  2. कोशिकाओं को इकट्ठा करने और वाशिंग
    1. एक झूलते या एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर चार 250 मिलीलीटर शंक्वाकार बोतलें और स्पिन में कोशिकाओं डालो. निथारना supernatants और हर बोतल के लिए एक और 250 एमएल सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें. सभी कोशिकाओं pelleted किया गया है जब तक दोहराएँ घूमती है.
    2. एक 250 मिलीलीटर शंक्वाकार बोतल में 250 ठंडा पीबीएस के मिलीलीटर और पूल के कुल में संयुक्त अंतिम छर्रों Resuspend. एक झूलते बाल्टी अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं स्पिन.
    3. सतह पर तैरनेवाला डालो और कुल मात्रा 50 मिलीग्राम से अधिक नहीं है तो ठंडा पीबीएस में सेल गोली resuspend. Pipetting और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण के माध्यम से गोली ढीला.
    4. एक झूलते बाल्टी अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं को फिर से स्पिन. Supernatan डालोटी और अनुमान है और सही रूप में संभव के रूप में सेल गोली मात्रा (सीपीवी) ध्यान दें. गोली ट्यूब पर मात्रा चिह्नों से कम है, तो तुलना के लिए, एक अलग मिलान ट्यूब में पानी का प्रयोग करें.
  3. सेल
    1. ए Resuspend अनुमानित सीपीवी के 5 संस्करणों का उपयोग बफर में गोली बफर डीटीटी जोड़ें. गोली तोड़ने के लिए और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते पिपेट.
    2. एक झूलते बाल्टी अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 931 XG पर कोशिकाओं स्पिन.
    3. ध्यान बजाय decanting की सतह पर तैरनेवाला aspirate. गोली मात्रा के कारण कोशिकाओं में सूजन को आकार में लगभग दो गुना बढ़ जाना चाहिए था.
    4. कोशिकाओं के लिए बफर के 1 सीपीवी जोड़ें. धीरे गोली तोड़ने के लिए और बर्फ पर एक microfuge ट्यूब के लिए एक छोटे से विभाज्य (लगभग 50 μl) को हटा दें. बर्फ पर ठंडा एक उचित आकार Dounce homogenizer (आमतौर पर 15 मिलीलीटर आकार) में resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण.
    5. एक ग्रुप बी के 12-15 धीमी लेकिन स्थिर स्ट्रोक (स्पर्श के साथ lyse कोशिकाओंहिंदुस्तान टाइम्स) मूसल. Lysate के एक छोटे से विभाज्य निकालें और trypan नीले रंग धुंधला द्वारा पूरा सेल (बरकरार छोटे अंधेरे नाभिक में सूजन कोशिकाओं की तुलना में) के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जांच. बरकरार कोशिकाओं) स्पष्ट हो जाएगा. 90% सेल हासिल की है जब तक homogenation जारी है और यहाँ बंद, douncing अधिक नकारात्मक परमाणु निष्कर्षों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं.
    6. Ultraclear ultracentrifuge ट्यूबों में lysate स्थानांतरण और कुल मात्रा को ध्यान दें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,069 XG पर ट्यूब और स्पिन वजन द्वारा संतुलन
      नोट: एक ही ट्यूब अगले चरण में उच्च गति से घूमती किया जाएगा क्योंकि ultracentrifuge कम स्पिन गति के बावजूद इस कदम पर प्रयोग किया जाता है. इस स्पिन एकत्र और साइटोसोलिक S100 अर्क के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो ऊपर cloudier सतह पर तैरनेवाला के साथ ट्यूब के नीचे कवर करने के लिए एक काफी तंग गोली, निकलेगा. ट्यूब के शीर्ष पर एक दृश्य लिपिड परत होती है, तो यह हटाया जा सकता है.
    7. ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटाने और anoth में स्थानांतरण.. एर ट्यूब परमाणु गोली परेशान बचें नोट: यह पैक परमाणु मात्रा (PNV) निर्धारित करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के अंतिम मात्रा को पता करने के लिए महत्वपूर्ण होगा.
  4. परमाणु निकालने की तैयारी
    1. सतह पर तैरनेवाला ध्यान से हटा दिया गया है एक बार, एक ही ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 25,453 XG पर कच्चे तेल की परमाणु निकालने गोली respin.
    2. शेष सतह पर तैरनेवाला निकालें (यह स्पष्ट तरल पदार्थ की एक छोटी राशि होना चाहिए) और पिछली सतह पर तैरनेवाला संग्रह में जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला के अंतिम मात्रा को मापने. मूल lysate की कुल मात्रा से इस मात्रा को घटाकर की PNV की गणना पहले से उल्लेख किया. गोली काफी बड़ी है अगर वैकल्पिक रूप से, इसकी मात्रा एक समान ट्यूब में पानी का समान मात्रा के साथ तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है.
    3. बफर सी (कोशिकाओं के लगभग 1 मिलीग्राम / एमएल) की 1 PNV मात्रा में जोड़ें. ध्यान से एक विंदुक टिप के साथ गोली बेदखल और एक उचित सी में स्थानांतरितजेड Dounce homogenizer. पहले की तरह ही homogenizer का उपयोग करते हैं, तो बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ homogenizer prerinse.
    4. एक तंग मूसल का उपयोग करते हुए एक Dounce homogenizer के माध्यम से 5-10 स्ट्रोक ~ साथ गोली Resuspend.
    5. एक ठंडा ट्यूब में homogenized परमाणु lysate स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए उलटा द्वारा मिश्रण मात्रा काफी बड़ी है, तो एक चुंबकीय हलचल थाली और स्पिन पट्टी का उपयोग कर आंदोलन.
    6. एक नए ultraclear अपकेंद्रित्र ट्यूब में lysate स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 25,453 XG पर स्पिन गोली कॉम्पैक्ट होना चाहिए. स्पिन के बारे में पहले 5 मिनट के पूरा हो गया है, एक उपयुक्त आणविक वजन काट (MWCO) है कि डायलिसिस कैसेट या ट्यूबिंग हाइड्रेट (जैसे 7,000 केडीए).
    7. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक ठंडा शंक्वाकार ट्यूब में ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला (परमाणु निकालने) निकालें तो डायलिसिस के साथ आगे बढ़ना.
  5. अपोहन
    1. निर्माता के अनुसार हाइड्रेटेड डायलिसिस कैसेट में अर्क इंजेक्षन 'निर्देशों और सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बफर डी 50 की 500 मिलीलीटर में परमाणु अर्क dialyze.
    2. 500 मिलीलीटर ताजा, ठंडा बफर डी 50 के साथ बफर बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए dialyze इस 4 घंटा कदम बजाय दो 2 घंटा परिवर्तन में विभाजित किया जा सकता है.
    3. डायलिसिस कैसेट से अर्क निकालें और ठंडा ट्यूब को हस्तांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 XG पर 5 मिनट के लिए अर्क स्पिन
    4. ठंडा, Eppendorf ट्यूबों में अर्क विभाज्य और तरल नाइट्रोजन (विभाज्य प्रति 50-100 μl) में फ्रीज तस्वीर. भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

3. शाही सेना जांच संश्लेषण

  1. खाका तैयार
    नोट: प्रतिलेखन के लिए प्रयुक्त साँचे पीसीआर टुकड़े या एक T7 या SP6 प्रमोटर नदी के ऊपर और तुरंत आसन्न इच्छित जांच अनुक्रम के लिए होते हैं कि plasmids हो सकता है. प्लाज्मिड टेम्पलेट्स int के टेम्पलेट अनुक्रम के बहाव linearized किया जाना चाहिएerest. हम पीसीआर टेम्पलेट्स से अधिक उपज का उल्लेख किया.
    1. T7/SP6 प्रमोटर पीसीआर प्रतिक्रिया दौरान डाला जा सकता है. लक्ष्य अनुक्रम की T7/SP6 प्रमोटर नदी के ऊपर के साथ भावना प्रथम डिजाइन.
    2. एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर के माध्यम से टेम्पलेट प्रति 2-3 प्रतिक्रियाओं में वांछित अनुक्रम बढ़ाना.
    3. बराबर प्रतिक्रियाओं का मिश्रण है और जेल निष्कर्षण द्वारा शुद्ध.
    4. अनुक्रम पीसीआर उत्पादों टेम्पलेट सटीकता की पुष्टि करने के लिए. (वैकल्पिक)
  2. 32 पी लेबलिंग के साथ शाही सेना ट्रांसक्रिप्शन
    1. निम्नलिखित संशोधनों के साथ प्रमोटर (SP6 या T7) के साथ संगत है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ टेम्पलेट के 1 ग्राम से इन विट्रो प्रतिलेखन में प्रदर्शन करते हैं. ताजा 3,000 सीआइ / mmol [α-32 पी] UTP के 1 μl, 10 मिमी ठंड UTP के 0.5 μl, 10 मिमी जीटीपी के 0.1 μl, और 10 मिमी m7G (5) पीपीपी (5) जी शाही सेना के 0.9 μl का प्रयोग करें 20 μl की कुल अंतिम मात्रा में टोपी.
      नोट: (: जीटीपी कैप) 10:1 अनुपात जी टोपी परमाणु अर्क में शाही सेना टेप की स्थिरता में सुधार. ठंड UTP सीमित अभिकर्मक होने से 32 पी UTP रोकने के लिए जोड़ा है.
    2. जी टोपी के बिना ऊपर चिह्नित के रूप में एक शाही सेना आकार सीढ़ी synthesize. वाणिज्यिक टेम्पलेट्स आरएनए आकार मार्कर पैदा करने के लिए उपलब्ध हैं.
    3. (SP6 उपयोग 40 डिग्री सेल्सियस के लिए) 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं सेते हैं. एक बार जब पूरा, 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए टेम्पलेट के DNase पाचन प्रदर्शन
    4. पाचन के बाद, शाही सेना substrates के लिए 0.5 एम EDTA के 1 μl और लदान बफर द्वितीय के 5 μl जोड़ें. मार्कर के लिए 20 μl लोड हो रहा है बफर द्वितीय जोड़ें.
    5. 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना मार्कर और जांच गर्मी तो बर्फ पर जगह है.
  3. Polyacrylamide जेल कास्टिंग / जांच वैद्युतकणसंचलन
    1. 6% polyacrylamide जेल (पेज) मिश्रण और 10% के लिए पृष्ठ की 400 मिलीलीटर की 1 एल तैयार करें. बीआईएस एक 6% करने के लिए, 40% 19:01 acrylamide का 150 मिलीलीटर मिश्रण10X Tris / Borate / EDTA (TBE) के 100 मिलीग्राम और 460 ग्राम यूरिया के साथ crylamide. कम गर्मी (लगभग 50-80 डिग्री सेल्सियस) आवेदन करते समय बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 800 मिलीलीटर तक लाने और एक hotplate पर हलचल. विआयनीकृत पानी के साथ 1 एल को पूरा करें.
      नोट: प्रतिक्रिया एन्दोठेर्मिक है. ताप यूरिया की solubilization को बढ़ावा देता है. जैसे ही यूरिया भंग कर रहा है के रूप में गर्मी से निकालें और विआयनीकृत पानी के साथ 1 एल का हल ले आओ. वैकल्पिक रूप से रात भर कमरे के तापमान पर हलचल; बहुत ज्यादा गर्मी polymerization आरंभ कर सकते हैं.
    2. कमरे के तापमान पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ प्रकाश से पृष्ठ मिश्रण को सुरक्षित रखें. पृष्ठ घोला जा सकता है समय से आगे तैयार है और कई महीनों के लिए स्थिर किया जा सकता है.
    3. बीआईएस acrylamide, 10x TBE के 40 मिलीग्राम और 184 ग्राम यूरिया: 40% 19:01 acrylamide का 100 मिलीलीटर के संयोजन के द्वारा 10% पृष्ठ मिश्रण की 400 मिलीलीटर की तैयारी. यूरिया घुल के बाद, विआयनीकृत पानी के साथ 400 मिलीलीटर के लिए ऊपर लाने के लिए.
      वैकल्पिक रूप से, एक 20% 19:01 acrylamide समाधान और एक 0% acrylamide समाधान वाई तैयारवें बफर और यूरिया ही; ये तो 0 और 20% के बीच किसी भी प्रतिशत देने के लिए किसी भी अनुपात में मिलाया जा सकता है; यूरिया हमेशा भंग करने के लिए धीमी है.
    4. डाली जा जैल की संख्या के आधार पर बाँझ विआयनीकृत पानी में 10% अमोनियम persulfate (ए पी एस) समाधान के 10-50 मिलीलीटर की तैयारी.
    5. 70% इथेनॉल (EtOH) के साथ 20 सेमी x 22 सेमी गिलास जेल प्लेटें धो लें. बड़े प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे के साथ सूखी.
    6. 5 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के 1 मिलीलीटर के साथ नियमित रूप से थाली धो लें और फिर 70% EtOH के साथ rewash. कोट एक संतृप्त छोटे Kimwipe साथ थाली पोंछते द्वारा जेल पीछे हटाना siliconizing समाधान के साथ वील थाली.
    7. एक खाली पिपेट टिप बॉक्स या ऊपर का सामना करना पड़ साफ पक्ष के साथ तालिका से यह तरक्की के लिए स्टायरोफोम के एक टुकड़े पर नियमित रूप से थाली रखकर प्लेटों को इकट्ठा करो. प्रत्येक लंबे पक्ष के किनारे पर 0.4 मिमी spacers निर्धारित करना.
    8. लेपित ओर जेल के अंदर पर होगा ध्यान इतना है कि spacers के ऊपर नोकदार प्लेट रखें. शिफ्ट करने के लिए एक उस्तरा या अन्य पतली साधन का उपयोगजेल प्लेटों के नीचे और पक्षों पर एक फ्लश संरेखण के लिए spacers तो spacers पर जेल प्लेटों के प्रत्येक पक्ष पर बांधने की मशीन क्लिप के साथ सुरक्षित है.
    9. 15 से 10% की मिलीलीटर और 6% एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक घोला जा सकता है मिश्रण से जेल 8% प्रति पृष्ठ मिश्रण की 30 मिलीलीटर की तैयारी. जल्दी से 8% जेल मिश्रण करने के लिए एन, एन, एन 'के 30 μl, n' टेट्रा-methylethylenediamine (TEMED) के बाद 10% ए पी एस के 300 μl जोड़ें.
      नोट: व्यक्तिगत जांच के आकार के लिए उपयुक्त जेल प्रतिशत प्रयोगकर्ता द्वारा चुना जाना चाहिए.
    10. कैप और पलटना 2x और जेल प्लेटों के नोकदार क्षेत्र में समाधान डालना. थोड़ा हाथ से प्लेटें तरक्की और पृष्ठ मिश्रण नीचे से बाहर ड्रिप शुरू होता है जब तक एक भी डालना बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें.
    11. वापस स्तर तक प्लेटें लोअर और तुरंत 0.4 मिमी x 20 सेमी जेल के लिए बड़े 8 अच्छी तरह आयत कंघी डालें. नीचे के पास छोटे बुलबुले चल रहा कोई असर नहीं पड़ेगा, लेकिन कुओं में कोई बुलबुले होना चाहिए.
      नोट: <जेल के नीचे और ऊपर से नीचे की मेज पर / strong> प्लेस कागज तौलिये डालने का कार्य के दौरान किसी भी फैल कब्जा करने के लिए.
    12. पृष्ठ मिश्रण में कम से कम 30 मिनट के लिए भाजन करने की अनुमति दें.
    13. ठंड के कमरे में polymerized जेल स्थानांतरण और वैद्युतकणसंचलन उपकरण इकट्ठा. ऊपरी और निचले कक्षों पर लाइनों को भरने के लिए ठंड TBE बफर जोड़ें.
    14. कंघी निकालें और किसी भी मलबे को हटाने के लिए एक रेजर का उपयोग करें. तंत्र में जेल सेट और सील करने के लिए थाली रखने के लिए एक बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग करें. यह प्लेटों में बहती है जब तक शीर्ष चैम्बर के लिए ठंड TBE जोड़ें.
    15. एक 30 मिलीलीटर के साथ कुओं धो ठीक पहले लेबल शाही सेना substrates लोड करने के लिए ठंड TBE से भरा जी 1-1/2 "सुई syringe/21. चल रहा है जबकि गर्मी का भी वितरण में सहायता करने के लिए कांच के पीछे करने के लिए एक एल्यूमीनियम प्लेट रखें.
    16. मार्कर और अलग कुओं में प्रत्येक आरएनए सब्सट्रेट के पूरे 25 μl प्रतिलेखन प्रतिक्रिया का लोड 3 μl. पी को इसी आकार के टेप के बीच एक अच्छी तरह से छोड़ दोREVENT पार संदूषण. लोड हो रहा है बफर में Bromophenol नीले और xylene cyanol रंगों जेल पर आकार प्रवास का अनुमान किया जा सकता है.
    17. (600 NT की जांच के लिए 2 घंटे के लिए जैसे 25 वाट) शाही सेना जांच के आकार के लिए एक निरंतर वाट क्षमता उपयुक्त में जेल चला.
  4. लेबल शाही सेना निष्कर्षण और शोधन
    1. वैद्युतकणसंचलन के बाद, ध्यान से जेल तंत्र के शीर्ष कक्ष नाली. रेडियोधर्मिता से अधिकांश जेल और नीचे कक्ष में होगा; हालांकि, ऊपरी बफर कुछ रेडियोधर्मी सामग्री हो सकती है.
    2. एक और रेडियोधर्मी सामग्री कार्य क्षेत्र के लिए आगे बढ़ अगर जेल के परिवहन के लिए एक ट्रे का प्रयोग करें. ध्यान से बग़ल में दूर जेल से फैला हुआ टुकड़ा खींच कर spacers हटा दें.
    3. धीरे प्लेटें अलग. जेल siliconized नहीं था कि थाली के लिए रहना चाहिए. जेल और ग्लास प्लेट के ऊपर प्लास्टिक की चादर का एक टुकड़ा रखें.
    4. एक हैं पर लपेट प्लास्टिक पर एक glogos autorad मार्कर स्टीकर रखेंकिसी भी नमूने की स्पष्ट है कि जेल की एक.
    5. एक अंधेरे कमरे में, पूरी थाली पर autoradiography फिल्म का एक टुकड़ा जगह और कम से कम 1 मिनट के लिए बेनकाब. फिल्म का विकास करना.
    6. एक प्रकाश सतह पर विकसित की फिल्म रखें. फिर फिल्म पर नीचे चेहरा और फिल्म पर संपर्क में मार्कर को जेल से autorad मार्कर संरेखित जेल की प्लास्टिक पक्ष जगह. एक बार गठबंधन, कांच पर वांछित बैंड के स्थान चिह्नित करने के लिए एक काला मार्कर का उपयोग करें.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, शाही सेना के बैंड को काटने के लिए निम्नलिखित तरीके में जैल / फिल्म संरेखित. अंधेरे कमरे में, एक मेज पर लिपटे जेल जगह यह की चोटी पर फिल्म जगह है और फिल्म के टुकड़े के शीर्ष पर एक कैसेट (या पुस्तक, आदि) रखें. बंद अगर संक्षेप में कमरे में प्रकाश स्विच पर झाड़, तो बदले. इस 'preflash' के कारण शीर्ष पर कैसेट प्रदान करता है कि प्रकाश से दबाव / संरक्षण के लिए इस फिल्म पर सभी कुओं की एक रूपरेखा पैदा फिल्म करेंगे. यह आसान जेल पर फिल्म संरेखित और कटौती करने के लिए बनाता हैफ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग किए बिना बैंड बाहर.
    7. सावधानी से प्लास्टिक की चादर को हटा दें और प्रत्येक शाही सेना सब्सट्रेट के लिए एक ताजा स्केलपेल या रेजर का उपयोग करें और जेल से बैंड उत्पाद शुल्क और अलग 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में जगह है. क्षालन दौरान कोमल आंदोलन के लिए एक nutator का प्रयोग करें.
    8. प्रत्येक ट्यूब आरएनए क्षालन बफर के 500 μl (0.5 एम अमोनियम एसीटेट, 10 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EDTA, 0.2% एसडीएस) जोड़ें. संक्षेप में जेल टुकड़ा डूब अपकेंद्रित्र. जांच के आकार के आधार पर 3-16 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    9. एक नया ट्यूब में eluted सामग्री के पूरे 500 μl स्थानांतरण. वे शुद्धि के साथ हस्तक्षेप करेगा के रूप में किसी भी जेल टुकड़े को स्थानांतरित करने से बचें. (आरएनए के लिए) ठंड, अम्लीय फिनोल के क्लोरोफॉर्म की 500 μl के साथ ग्लाइकोजन के 1 μl (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.
    10. संक्षेप में भंवर, समाधान बादलमय दिखाई देनी चाहिए. 5-6 मिनट के लिए शीर्ष गति (~ 16,000 XG) में कमरे के तापमान पर स्पिन.
    11. ध्यान से पारfer शीर्ष (जलीय) अंतरावस्था से किसी भी मलबे से परहेज करते हुए जितना संभव एकत्रित नए ट्यूबों को परत. तबादला जलीय परत को क्लोरोफॉर्म के बराबर राशि जोड़ें. दोहराएँ कदम 3.4.10 और शीर्ष हस्तांतरण (जलीय) एक नया ट्यूब परत. एकत्र सामग्री को ठंडा 95-100% EtOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें. . 10 मिनट के लिए नोट -80 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं: अगर वांछित शाही सेना रात भर संग्रहित किया जा सकता है.
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर 30 मिनट के लिए शाही सेना गोली ध्यान से एक रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला बंद डालना और प्रत्येक गोली से ठंडा 70% आणविक ग्रेड EtOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    13. सतह पर तैरनेवाला टपकना 1 मिनट के लिए फिर से स्पिन और विंदुक के माध्यम से किसी भी अवशिष्ट EtOH हटाने और किसी भी शेष EtOH के वाष्पीकरण के लिए अनुमति देने के लिए खुला टोपी के साथ कमरे के तापमान पर छोड़, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 XG पर शाही सेना गोली.
    14. RNase मुक्त पानी की 20-30 μl में छर्रों Resuspend. लेबल शाही सेना सेल्सियस -80 पर संग्रहीत किया जा सकता है
      ध्यान दें: एक रेडियोधर्मी सर्वेक्षण मीटर लेबल शाही सेना किसी भी कदम के दौरान खो नहीं किया गया है, इसकी पुष्टि करने के लिए पूरे निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाना चाहिए.
  5. एक पूर्व mRNA 3 'mRNA विखंडन प्रतिक्रिया के लिए लेबल शाही सेना के quantitation
    1. निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग दरार substrates के molarity लगभग.
      1. उदाहरण के लिए, 3000 सीआइ / mmol [α-32 पी] UTP और 10 एमसीआई / मिलीलीटर की 1 μl ले लो. लेबल (लेबल संदर्भ तिथि पर, इस शेयर समाधान के रासायनिक एकाग्रता उस तारीख से पहले यह यह ~ 1.6 मिमी, आदि है की तारीख के बाद उच्च और एक आधा जीवन (~ 13 दिन) है. 3.3 माइक्रोन UTP होगा) अंतिम प्रतिक्रिया एकाग्रता के लिए UTP योगदान UTP कश्मीर मीटर ऊपर एक अंतिम ठंड UTP एकाग्रता प्रयोग किया जाता है जब आम तौर पर नगण्य है. UTP के लिए T7 RNAP कश्मीर मीटर 114 मिमी 15 है.
      2. पानी के 39 μl में 1 μl पतला. तब पतला [1 μl α जोड़ (नोट:. Cerenkov गिनती भी विश्वसनीय सीपीएम मूल्यों दे देंगे के रूप में Cerenkov गिनती के लिए सही चैनल चयन और 1 मिनट के लिए एक 1 मिलीलीटर मात्रा गिनने के लिए जगमगाहट काउंटर पुस्तिका की जाँच जगमगाहट तरल पदार्थ वास्तव में 32 पी की इस विशिष्ट गतिविधि के लिए आवश्यक नहीं है).
    2. पिछले चरण में इस्तेमाल किया जगमगाहट तरल पदार्थ की एक समान राशि के साथ अलग शीशियों में प्रत्येक लेबल शाही सेना सब्सट्रेट के 1 μl पतला. पृष्ठभूमि की गणना करने के लिए केवल जगमगाहट तरल पदार्थ के साथ एक शीशी है सुनिश्चित करें. एक जगमगाहट काउंटर में रेडियोधर्मिता quantitate.
    3. प्रारंभिक कमजोर पड़ने में कारक और अकेले जगमगाहट तरल पदार्थ से प्राप्त की पृष्ठभूमि घटाना 40 से [α-32 पी] UTP नमूना के लिए न्यूनतम (सीपीएम) प्रति मायने रखता गुणा करें. RNase मुक्त पानी की मात्रा (20-30 μl) द्वारा प्रत्येक शाही सेना जांच के लिए मायने रखता है गुणा आर.एन. resuspend करने के लिए इस्तेमाल कियाएक जांच. यह शुद्ध आरएनए की कुल सीपीएम देता है.
      उदाहरण:. अधिकतम सीपीएम = (सीपीएम [α-32 पी] UTP - पृष्ठभूमि) 40 x लेबल शाही सेना नमूना 1 = 20,000 सीपीएम x 20 = 4,00,000 सीपीएम (20 μl मेजबान के लिए इस्तेमाल किया हो)
    4. [Α-32 पी] UTP के 1 μl के अलावा किसी अन्य राशि टेप बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तो [α-32 पी] के लिए सीपीएम गुणा करके [α-32 पी] UTP के अंतिम सीपीएम में इस मात्रा का पहलू इस्तेमाल राशि से UTP नमूना.
      उदाहरण: [α-32 पी] UTP के 2 μl टेप बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. 1 μl [α-32 पी] UTP के लिए गणना सीपीएम 500,000 सीपीएम है. गुणा 500,000 * 2 = 1000000 सीपीएम
    5. अकेले [α-32 पी] UTP के लिए गणना सीपीएम द्वारा गणना लेबल शाही सेना सीपीएम फूट डालो. यह मोटे तौर पर शामिल लेबल UTP के प्रतिशत का अनुमान जाएगा.
      उदाहरण: 400000/1000000 = 0.40 या 40%निगमित
    6. एक एंजाइम आइसोटोप के बीच भेद नहीं कर सकते, लेबल और unlabeled UTP की इसी प्रतिशत प्रतिलेखन के दौरान शाही सेना में शामिल किया है. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया (UTP 5.0 x 10 -9 मोल्स एक 10 मिमी समाधान के 0.5 μl =) को जोड़ा गया है जो मोल में ठंड UTP की राशि की गणना.
    7. (उपरोक्त गिनती गर्म UTP से जाना जाता है) शामिल प्रतिशत की प्रतिक्रिया में मोल्स UTP गुणा, तो शाही सेना अनुक्रम में uridines की संख्या से है कि विभाजित करते हैं.
      उदाहरण: UTP 5.0 x 10 -9 मोल एक्स 0.40 = 2 एक्स 10 -9 मोल UTP
      2 एक्स 10 -9 मोल UTP / 73 यू प्रतिलेख प्रति = शाही सेना के 2.7 x 10 -11 मोल
    8. बरामद आरएनए मेजबान समाधान की मात्रा को विभाजित करके molarity को शाही सेना के मोल में कनवर्ट करें.
      उदाहरण: शाही सेना / 20 μl = 1,370 एनएम शाही सेना के 2.7 x 10 -11 मोल. लगभग 1 ग्राम रैखिक से बना T7 RNAP टेप के लिएप्लाज्मिड ized और 20 μl पानी में resuspended, 200 1400 एनएम के मूल्यों विशिष्ट हैं.
      नोट: शाही सेना की दाढ़ एकाग्रता में इन विट्रो दरार प्रतिक्रिया में अंतिम पूर्व mRNA सब्सट्रेट एकाग्रता दरार प्रतिक्रिया प्रति कम से कम 5 एनएम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. शाही सेना एकाग्रता काफी 5 एनएम ऊपर उठाया है अगर विखंडन दक्षता में कमी कर सकते हैं.

4. 3 'mRNA विखंडन अभिक्रिया

  1. विखंडन अभिक्रिया अभिकर्मक तैयार
    1. दरार प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सभी अभिकर्मकों तैयार करें. उबलते पानी से 10% polyvinyl शराब (PVA) बनाने के लिए और धीरे धीरे PVA पाउडर की सही मात्रा में जोड़ें. 10% PVA चिपचिपा हो और भंग करने के लिए समय लगता होगा. कमरे के तापमान या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम creatine फॉस्फेट (सीपी) और दुकान की तैयारी यह कम से कम 4 महीने पुरानी है कि 1 एम सी.पी. उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    3. 1 एम डीटीटी और दुकान की तैयारी-20 डिग्री सेल्सियस पर सिर्फ पूर्व दरार प्रतिक्रिया कर रही है 1 एम डीटीटी से एक ताजा 0.2 एम डीटीटी कमजोर पड़ने बनाओ.
    4. टिकट (दरार स्थान पर समाधान) तैयार: 10 मिमी Tris पीएच 7.8, 10 मिमी EDTA, 0.5% एसडीएस. कमरे के तापमान पर स्टोर.
  2. विखंडन अभिक्रिया
    1. 2 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए लेबल शाही सेना गर्मी तो बर्फ पर जगह है.
    2. धीरे भंवर और फिर बुलबुले को दूर करने के लिए 2-3 मिनट के लिए शीर्ष गति से 10% PVA स्पिन.
    3. मास्टर मिश्रण 1: एक भी प्रतिक्रिया के लिए, 3.125 μl 10% PVA, 0.625 μl 1 एम सी.पी., 0.25 μl 0.5 एम tRNA, 0.125 μl 100 मिमी dATP, 0.13 μl 40 यू / μl RNase अवरोध करनेवाला, 0.25 μl 0.1 एम EDTA पीएच 8 गठबंधन , 0.1 μl 0.2 एम डीटीटी, और 0.645 μl RNase मुक्त पानी. बर्फ पर ट्यूब प्रति 5.25 μl मास्टर मिश्रण 1 बांटना.
    4. मास्टर मिक्स 2: प्रयोग 2 मिलीग्राम / एमएल से अधिक सांद्रता में परमाणु अर्क के 6.25 μl / प्रतिक्रिया. परमाणु अर्क बफर डी 50 से पतला किया जा सकता है अगर needed.
    5. पहले मास्टर मिश्रण 1 से 5.25 μl तिरस्कृत साथ परमाणु निकालने की 6.25 μl जुडा है. 50 एनएम को पतला है कि लेबल शाही सेना सब्सट्रेट के 1 μl जोड़ें. . का प्रयोग करें लेबल शाही सेना सब्सट्रेट <5 एनएम: वैकल्पिक रूप से, आरएनए 1 यह RNase अवरोध करनेवाला, डीटीटी और tRNA नोट के बाद कहा है कि उपलब्ध कराई मास्टर मिश्रण में शामिल किया जा सकता है.
    6. धीरे बुलबुले को दूर करने के लिए प्रत्येक नमूना भंवर और त्वरित स्पिन. अप करने के लिए 2 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, लेकिन एक समय के पाठ्यक्रम के इष्टतम परिणामों के लिए किया जाना चाहिए. लंबे समय तक incubations पृष्ठभूमि गिरावट बढ़ सकता है.
  3. Proteinase कश्मीर पाचन और शोधन
    1. गर्मी से नमूने निकालें और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए टिकट स्थान पर समाधान के 182.5 μl जोड़ें. 20 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के 5 μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं.
    2. 3 एम सोडियम की 1 एसिड phenol के क्लोरोफॉर्म की मात्रा (200 μl), 1/10 वें मात्रा (20 μl) जोड़कर शाही सेना निकालेंएसीटेट, और 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन की 1 μl. वर्गों 3.4.9-3.4.14 में वर्णित के रूप में एक्सट्रेक्शन के साथ आगे बढ़ें.
    3. शाही सेना निकासी के पूरा होने पर, सभी अवशिष्ट EtOH निकाल लें. (Bromophenol ब्लू (BFB) (और या Xylene Cyanol नीला) के साथ 90% formamide, 10 मिमी EDTA,) लोड हो रहा है बफर के 8 μl में गोली Resuspend. नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ आगे बढ़ना हो सकता है.
  4. विखंडन अभिक्रिया वैद्युतकणसंचलन
    1. के रूप में पहले से कुछ संशोधनों के साथ वर्गों 3.3.1-3.3.17 में कहा गया है एक 6% acrylamide जेल तैयार करें. प्रत्येक लंबे पक्ष पर 2 बांधने की मशीन क्लिप के साथ 20 सेमी x 42 सेमी अनुक्रमण जेल प्लेट का उपयोग करें. एक 32 अच्छी तरह कंघी का प्रयोग करें और जेल मिश्रण की 40 मिलीलीटर की तैयारी.
    2. मार्कर के 3 μl और प्रत्येक नमूने के 5 μl के साथ जेल लोड करें. पूर्व दरार और cleaved उत्पाद आकार के अनुसार वैद्युतकणसंचलन सेटिंग्स को अनुकूलित.
    3. वैद्युतकणसंचलन पूरा हो गया है, वर्गों 3.4.1-3.4.3 पालन <जेल जुदा करने के लिए> / मजबूत. इसके बजाय प्लास्टिक की चादर की, जेल थाली के आकार के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े में कटौती और ध्यान से अवगत कराया जेल के एक तरफ रखें.
    4. फिल्टर पेपर तल पर है और कांच शीर्ष पर है कि इतनी मजबूती से जेल पर फिल्टर पेपर प्रेस, तो थाली पर फ्लिप. मजबूती से जेल में समान रूप से फिल्टर पेपर उत्साहित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मेज पर गिलास नीचे प्रेस.
    5. धीरे धीरे संलग्न जेल के साथ फिल्टर पेपर के सभी शीशे के प्लेट से हटा दिया जाता है जब तक कम एक छोर से, यह करने के लिए संलग्न जेल होनी चाहिए जो फिल्टर पेपर, छील.
    6. प्लास्टिक की चादर के साथ संपर्क में जेल पक्ष को कवर. फिल्टर पेपर के लिए प्लास्टिक की चादर टेप.
    7. वैक्यूम पक्ष का सामना करना पड़ फिल्टर पक्ष के साथ एक जेल ड्रायर पर जेल रखें. 15 मिनट के लिए या जेल तक सूखी पूरी तरह से सूखा है.
      नोट: एक जेल ड्रायर उपलब्ध नहीं है, तो एक्स - रे फिल्म शाही सेना के बैंड कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक्सपोजर एक ligh में बाहर किया जाना चाहिए-80 डिग्री सेल्सियस पर गहनता स्क्रीन के साथ टी तंग कैसेट एक्सपोजर समय अनुभव से निर्धारित होता है. सावधानी: कम प्रतिशत acrylamide जैल ठंड पर दरार हो सकता है.
    8. जेल अब फिल्म का पर्दाफाश करने के लिए या एक phospho-इमेजर के साथ इस्तेमाल किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. एक्सपोजर समय लेबल शाही सेना की ताकत पर निर्भर करता है. शुरू में एक 24 घंटा जोखिम इस्तेमाल किया जा सकता है. फिल्म का उपयोग करते हैं, तो एक गहनता स्क्रीन के साथ -80 डिग्री सेल्सियस पर बेनकाब और पूर्व के विकास के लिए कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
    9. दरार दक्षता quantitate प्रत्येक नमूने में cleaved और संयुक्त राष्ट्र cleaved शाही सेना के बीच अनुपात को मापने.

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Representative Results

आरएनए पाली (ए) एचआईवी -1 की साइटों (चित्रा 2) की एक दरार परख के प्रतिनिधि परिणाम. हम जेल के शीर्ष पर धीरे पलायन बैंड है जो uncleaved शाही सेना सब्सट्रेट, निरीक्षण कर सकते हैं. विशिष्ट cleaved उत्पाद तेजी से उम्मीद आकार में जेल में चलता है कि सबसे तीव्र कम टुकड़ा बैंड है, और Polya अनुक्रम (mutPolyA) शाही सेना में एक बिंदु उत्परिवर्तन होता है कि mutpoly (ए) के नियंत्रण की दरार परख से विशेष रूप से अनुपस्थित है सब्सट्रेट. इनपुट सब्सट्रेट की गिरावट उत्पादों कभी कभी देखा जा सकता है. दरार गतिविधि की मात्रा uncleaved शाही सेना के लिए 100% के लिए सामान्यीकृत cleaved शाही सेना को uncleaved के अनुपात के densitometric साजिश से निर्धारित किया जा सकता है.

चित्रा 1
के एचआईवी पूर्व चित्रा 1. योजनाबद्ध चित्रणmRNA 3 'अंत प्रसंस्करण substrates, और इन विट्रो दरार और polyadenylation प्रतिक्रियाओं की उम्मीद उत्पादों. दरार साइट, डाईन्यूक्लियोटाइड-सीए, झूठ 25 NT बहाव के Pólya साइट AAUAAA से. लीटर क्षेत्रों: U3 (अद्वितीय 3 'अनुक्रम), आर (दोहराया अनुक्रम), और U5 (अद्वितीय 5' अनुक्रम).

चित्रा 2
चित्रा 2. (ए) पाली (ए) साइट दरार. एचआईवी -1 की पाली (ए) और दरार (mutPolyA) को समाप्त करता है कि पाली (ए) संकेत के एक बिंदु उत्परिवर्तन युक्त 32 पी लेबल RNAs परमाणु अर्क में incubated रहे थे एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में हेला-S3 कोशिकाओं या बीएसए की. बोल्ड तीर 5 'cleaved उत्पाद को इंगित करता है. 3 'टुकड़ा अक्सर जेल से चलाता है या अपमानित और हमेशा दिखाई नहीं देता है. (बी) दरार गतिविधियों की densitometric साजिशTy uncleaved शाही सेना के लिए 100% के लिए सामान्यीकृत cleaved शाही सेना को uncleaved के अनुपात के रूप में व्यक्त किया.

बफर (100 मिलीलीटर) 10 मिमी Tris (7.9 पीएच), 1.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी KCl, 0.5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी). बस से पहले निकासी के दौरान बफर का उपयोग करने के लिए डीटीटी जोड़ें. बफर ए के 1 मिलीग्राम प्रति 1 एम डीटीटी का 1 μl जोड़ें
बफर सी (50 मिलीलीटर) 20 मिमी Tris (7.9 पीएच), 25% (v / v) ग्लिसरॉल, 0.42 एम NaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 0.5 मिमी डीटीटी, 0.5 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF). एक protease अवरोध कॉकटेल गोली एक्सट्रेक्शन सुबह जोड़ें.
बफर डी 50 (2-4 एल) 20 मिमी Tris (pH7.9), 20% (v / v) ग्लिसरॉल, 0.2 मिमी EDTA, 0.5 मिमी डीटीटी, 50 मिमी अमोनियम सल्फेट. HEPES-KOH बफर ए, सी और डी में Tris लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है
0.5 एम Amonium एसीटेट, 10 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EDTA, 0.2% सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस) कमरे के तापमान पर स्टोर.
बंद करो बफर (टिकट) 10 मिमी Tris (pH8.0), 10 मिमी EDTA, 0.5% एसडीएस कमरे के तापमान पर स्टोर.
विखंडन लोड हो रहा है बफर 90% formamide, 5 मिमी EDTA PH8, 0.025% Bromophenol ब्लू -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

बफ़र्स की तालिका 1. संरचना.

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Discussion

हेला सेल परमाणु अर्क में या इन निष्कर्षों से fractionated दरार कारकों के साथ किए गए इन विट्रो पूर्व mRNA 3 'दरार प्रतिक्रिया,, कोर दरार कारकों और उनके मुख्य परिसरों 16-21 की पहचान के लिए सक्षम है. इन कारकों के साथ जुड़े कई और अधिक प्रोटीन हाल ही में 22 की पहचान की गई है, और इन विट्रो प्रतिक्रिया इन प्रोटीनों की प्रतिक्रिया में योगदान पर प्रकाश डाला करने के लिए जारी रख सकते हैं. विवो में प्रतिक्रिया cotranscriptional 23 प्रतीत होता है, या कुछ योगदान कारकों निष्कर्षण और डायलिसिस के दौरान खो दिया जा सकता क्योंकि, दक्षता अक्सर गरीब है, और शायद ही कभी 30% से अधिक दरार हासिल की है शायद इसलिए. इसके अलावा, प्रतिक्रिया दक्षता अचानक कोई स्पष्ट कारण के लिए दिन से दिन में छोड़ सकते हैं. इसलिए, यह कदम संशोधित या virally संक्रमित हेला सीईएल की प्रतिक्रिया अनुकूल करने के लिए प्रयास कर रहा है, खासकर जब सबसे महत्वपूर्ण हैं जो सराहना करने के लिए महत्वपूर्ण हैरास, अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए या नई substrates के लिए.

राजनीति RNase मुक्त परिस्थितियों में काम करने की जरूरत है के रूप में शक के बिना, निकालने की गुणवत्ता और इन विट्रो लिखित शाही सेना की ताजगी, सर्वोपरि हैं. वे निकासी के लिए काटा जाता है समय में कोशिकाओं का स्वास्थ्य भी महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं को स्वस्थ, वे कम से कम 24 घंटे में दोहरीकरण किया जाना चाहिए प्रकट करना चाहिए, वे में या मध्य लॉग चरण आ जाना चाहिए, और कुछ मृत कोशिकाओं या अन्य अस्पष्टीकृत मलबे होना चाहिए. जाहिर है, कोशिकाओं Mycoplasma या अन्य बैक्टीरिया से दूषित नहीं किया जाना चाहिए. सब्सट्रेट यह स्पष्ट गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जैसा कि बहुत अधिक एक विशिष्ट गतिविधि के साथ नहीं बनाया जाना चाहिए.

दरार साइट के दोनों तरफ एक बड़ा पर्याप्त अनुक्रम में माना जाता है, और वैकल्पिक polyadenylation के लिए जिम्मेदार है, जब अलग पाली मानव जीनोम में (ए) अनुक्रम संकेतों की संख्या बेशक जीन 24 की संख्या अधिक 25. एक कमजोर पाली मानक HELA कोशिकाओं की तुलना में अन्य कोशिकाओं के साथ (ए) संकेत अनुक्रम का संयोजन निराशा साबित हो सकता है, और यह एक संभावित कमजोर Pólya सब्सट्रेट के साथ नई कोशिकाओं, या असंशोधित HELA कोशिकाओं के साथ एक मजबूत सब्सट्रेट का उपयोग करने के पहले बेहतर है.

यहां तक कि सफल प्रयोग के इतने सालों के बाद, इन विट्रो 3 'दरार प्रतिक्रिया के साथ जुड़े नाबालिग रहस्यों वहाँ अब भी कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, क्यों creatine फॉस्फेट की जरूरत है? एटीपी पूल पुनर्जीवित करने के लिए - 26 - मान्य नहीं है यह सहित के लिए मूल कारण यह है कि प्रदर्शन किया गया है. दिलचस्प बात यह है कि यह परमाणु अर्क हैं जब गतिविधि के केवल आंशिक हानि के साथ छोड़ा जा सकता हैइस्तेमाल किया, लेकिन निकालने प्रतिक्रिया पुनर्गठित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि आंशिक रूप से शुद्ध दरार कारकों में fractionated है के रूप में उत्तरोत्तर अधिक आवश्यक हो जाता है. वास्तव में, phosphocholine, एक फॉस्फेट समूह और एक सकारात्मक आरोप लगाया अमाइन, लेकिन संभावना प्रतिक्रिया में कोई vivo में भूमिका होने के साथ एक और छोटा सा अणु, कम से कम पुनर्गठन प्रतिक्रिया 27 में creatine फॉस्फेट, की तुलना में अधिक प्रभावी होना पाया गया है. PVA जिसका आवश्यकता पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है एक और घटक है. यह दरार कारक एकाग्रता में एक प्रभावी वृद्धि के लिए अग्रणी, एक भीड़ एजेंट मान लिया जाता है, लेकिन अन्य भीड़ एजेंटों, पॉलीथीन ग्लाइकॉल की तरह, लगभग के रूप में अच्छी तरह से काम नहीं करते. इन कारकों को समझना विधि प्रकार की कोशिकाओं और आरएनए substrates के लिए कम कुशल के विस्तार को सक्षम करने, बेहतर क्षमता के लिए नेतृत्व कर सकता है, और विभिन्न कारकों कैसे काम करने के लिए सुराग उपज सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एसवी एनआईएच K22AI077353 और Landenberger फाउंडेशन से धन समर्थन के लिए आभारी है. के.आर. कृतज्ञता एनआईएच (5SC1GM083754) से धन स्वीकार करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Celstir flask Wheaton 356884 Different sizes available
4 position slow speed stirrer VWR 12621-076
Swinging bucket centrifuge Beckman Coulter Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R Eppendorf Refridgerated
Thermomixer incubator Eppendorf
250 ml conical tubes Corning 430776
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
Ultraclear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
JOKLIK modified MEM Lonza 04-719Q
Fetal bovine serum Atlas F-0500-A Heat inactivated
L-glut:pen:strep Gemini Bio-Products 400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0 Mediatech 46-031-CM
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Potassium chloride MP Biomedicals 194844
HEPES Fisher BP310-500
DTT Alexis Biomedicals 280-001-G-010
Glycerol Fisher BP229-4
5 M sodium chloride solution Mediatech 46-032-CV
EDTA 0.5 M solution Sigma-Aldrich E7889-100ml
EDTA Fisher BP120-500
PMSF Thermo Scientific 36978
Ammonium sulfate Fisher A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit Thermo Scientific 66372 MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D9938-1SET Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit Roche 11 732 650 001
10 mM dNTP Mix Invitrogen Y02256 10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit Ambion AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap New England Biolabs S1404S
Century Marker Template Plus Ambion AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi Perkin Elmer BLU507H250UC
Gel loading buffer II Ambion 8546G
DEPC treated water Ambion AM9906
10x TAE Fisher BP13354
10x TBE Ameresco Life Sciences 0658-4L
10x PBS Fisher BP399-20
Urea Fisher BP169-212
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
TEMED Fisher BP150-20
Ammonium acetate Fisher A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide Bio-Rad 161-0144
Glycogen Roche 10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof Acros 61509-0040
Acid phenol:chloroform Ambion 9720 For RNA
Scintilation fluid Fisher SX18-4
Rnase inhibitor Promega N261B
Polyvinyl alcohol- PVA Sigma-Aldrich P8136-250G
Creatine phosphate Calbiochem 2380
100 mM dATP Fisher BP2560-4
SDS Acros 23042-5000
Proteinase K Fisher BP1700-100
Adjustable sequencing unit Sigma-Aldrich Z351881-1EA
Binder clips Office Depot 838-056
20 cm x 42 cm glass plates Sigma-Aldrich Z352543 1 SET
20 cm x 22 cm glass plates Sigma-Aldrich Z35252-7 1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates Sigma-Aldrich Z352667 1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers Sigma-Aldrich Z35230-6 1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers Sigma-Aldrich Z352314-1 1 SET
8-well comb Sigma-Aldrich Z35195-4 1 EA
16-well comb Sigma-Aldrich Z351962 1 EA
32-well comb Sigma-Aldrich Z351970 1 EA
Gel repel coating C.B.S. Scientific SGR-0401 or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips Rainin GT-10-4 0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV Bio-Rad PowerPac HV 5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583 Bio-Rad Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers Agilent 420201
Film 8 x 10 Midsci BX810
Film 14 x 17 Phenix F-BX1417
Autoradiography cassette Fisher FBCA 1417 8 x 10 size available

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References

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संक्रामक रोगों अंक 87 विखंडन polyadenylation mRNA प्रसंस्करण परमाणु अर्क 3 'प्रसंस्करण परिसर
पूर्व mRNA Substrates के 3 &#39;अंत विखंडन: सेल फ्री सिस्टम का प्रयोग शाही सेना प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण<em&gt; इन विट्रो</em
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Jablonski, J., Clementz, M., Ryan,… More

Jablonski, J., Clementz, M., Ryan, K., Valente, S. T. Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro. J. Vis. Exp. (87), e51309, doi:10.3791/51309 (2014).

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