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Analisi delle reazioni RNA di trasformazione che utilizzano cellulari Sistemi gratis: 3 'Fine Decolleté di pre-mRNA Substrati Published: May 3, 2014 doi: 10.3791/51309
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

Summary

RNA polimerasi II sintetizza un RNA precursore che si estende oltre l'estremità 3 'del mRNA maturo. La fine del RNA maturo viene generato cotranscriptionally, in un sito dettata da sequenze di RNA, tramite l'attività di endonucleasi del complesso scissione. Qui, dettaglio il metodo per studiare le reazioni di dissociazione in vitro.

Abstract

L'estremità 3 'degli mRNA di mammifero non è formata da improvvisa di trascrizione di RNA polimerasi II (RNPII). Invece, RNPII sintetizza mRNA precursore oltre la fine degli RNA maturi, e un processo attivo di attività endonucleasica è richiesto in un luogo specifico. Clivaggio del precursore dell'RNA avviene normalmente 10-30 nt a valle del sito poliA consenso (AAUAAA) dopo i dinucleotidi CA. Proteine ​​del complesso clivaggio, un complesso proteico multifattoriale di circa 800 kDa, realizzare questa attività nucleasi specifica. Sequenze di RNA specifici a monte ea valle del sito poliA controllano il reclutamento del complesso scissione. Subito dopo la scissione, pre-mRNA sono poliadenilato dalla polimerasi poliA (PAP) per la produzione di maturare messaggi RNA stabili.

Lavorazione di estremità 3 'di un trascritto di RNA può essere studiata utilizzando estratti nucleari cellulari con specifici substrati di RNA radioattivi. In somma, una lunga 32 </ Sup> P-marcato uncleaved precursore RNA viene incubata con estratti nucleari in vitro, e clivaggio viene valutata mediante gel elettroforesi e autoradiografia. Quando si verifica la corretta scissione, un corto 5 'spaccati prodotto viene rilevato e quantificato. Qui, descriviamo il saggio di clivaggio in dettaglio utilizzando, ad esempio, l'elaborazione 3 'estremità di HIV-1 mRNA.

Introduction

La biosintesi della maggior parte degli RNA maturi messaggio eucarioti (mRNA) richiede diverse modificazioni post-trascrizionali, quali capping, splicing e di poliadenilazione. Queste modifiche sono generalmente accoppiati per garantire la corretta elaborazione 1 e fortemente aumentare la stabilità del mRNA.

Il 3 'formazione dell'estremità di mammiferi pre-mRNA è generato da taglio endonucleolitico dell'RNA nascente seguita da aggiunta di residui adenilato al 5' spaccati prodotto da poli (A) polimerasi (PAP) 2-4. Nei mammiferi, clivaggio viene realizzato un complesso proteico multicomponente, di circa 800 kDa, che assembla su specifiche sequenze pre-RNA. Il poli (A) sequenza segnale, una sequenza altamente conservata AAUAAA hexanucleotide canonica, dirige il sito di scissione a circa 10-30 nt a valle. Questo sito è specificamente riconosciuto il fattore di clivaggio e poliadenilazione specificità (CPSF) e il 73 kD subunitàCSPF contiene l'attività endonucleasi. Il fattore di stimolazione clivaggio (CstF) lega una più degenerato GU-o U sequenza ricca elemento a valle del poli (A) sito. Necessari anche per la scissione è il fattore di scissione mammiferi I (CFIm), e il fattore di scissione mammiferi II (CFII). CFIm lega specifici UGUA (N) siti in elementi di sequenza a monte (impieghi) che sono stati definiti per un certo numero di geni sembrano essere coinvolti in importanti processi fisiologici 5-8.

In vitro, reazioni di trasformazione RNA sono comunemente analizzati mediante l'utilizzo di substrati di RNA radiomarcati 9-12. Questi possono essere sintetizzati mediante trascrizione deflusso dal batteriofago promotore T7 o SP6. Quando si studia un sito di poliadenilazione che non è stato caratterizzato prima, è necessario utilizzare il DNA genomico anziché cDNA per generare il substrato RNA, come importanti sequenze a valle potrebbero non essere presenti in cDNA. Substrati di design per includere almeno 150 nt upstream e 50 nt a valle del sito di clivaggio / fine sul mRNA maturo. Il prodotto di scissione migra più velocemente del substrato; Tuttavia, poiché altri frammenti possono essere generate per azione non specifico nucleasi, la specificità della reazione deve essere verificata da sua dipendenza corrette sequenze segnale trasformazione. Pertanto, i substrati di RNA con una mutazione puntiforme nella sequenza AAUAAA (es AAGAAA) servono come controllo negativo per la reazione di scissione.

Dato che una piccola quantità di RNA radiomarcato viene utilizzato per le reazioni di clivaggio, RNasi presenti in grande abbondanza nella maggior estratti nucleari può essere problematico, e limitare la scelta del materiale di partenza per la preparazione dell'estratto. Cellule HeLa tendono a contenere bassi livelli di RNasi endogeni, e quindi eseguire bene in questi saggi.

Il taglio endonucleolitico dei substrati di RNA in vivo e in vitro è immediatamente seguito da poli (A) Inoltre, gios l'intermedio spaccati non è presente in quantità rilevabili. Pertanto, per studiare sia una sequenza o proteine ​​coinvolte in una reazione di scissione di RNA specifico, gli esperimenti sono fatti in condizioni che impediscono poliadenilazione verifichi. Non vi è alcuna dipendenza della scissione sulla poliadenilazione, o viceversa, così si può smettere di poliadenilazione senza danneggiare la reazione di scissione. Così, ATP viene sostituito con un analogo catena che chiude che manca il gruppo ossidrile 3 'in modo che solo un singolo nucleotide può essere incorporato nel sito poly (A) e appena RNA spaccati può essere rilevato.

Data la complessità e alto grado di particolarità di questo tipo di saggio, si descrive un protocollo dettagliato video da studiare taglio endonucleolitico dal clivaggio / Poly (A) macchine di precursori di mRNA in vitro. Si descrive come preparare estratti nucleari competenti, generare substrati di RNA radioattivi, eseguire la reazione di scissione, e analizzare e interpretare il risultatoprodotti ing. Figura 1 mostra un esempio di RNA substrato codificanti per l'estremità 3 'di HIV-1 pre-mRNA da utilizzare per un saggio di scissione. L'estremità 3 'del genoma di RNA di HIV è composto di molte importanti sequenze regolatrici, come il poli (A) sito, una regione ricca G+ U, e l'elemento USE, che sono tutti necessari per la maturazione efficiente dei trascritti di mRNA virali 13 . In questo esempio ci aspettiamo il substrato RNA ingresso per essere 338 nt e sulla scollatura 237 nt. Se poliadenilazione è stato permesso di accadere, uno striscio di prodotti sarebbe stata osservata tra 237 e 437 nt.

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Protocol

1. Adeguamento delle cellule aderenti in sospeso

(Questo passaggio è facoltativo. Cellule in sospensione in generale rendere migliori estratti nucleari, tuttavia cellule cresciute in piastre possono anche essere utilizzati.)

  1. Adattare cellule aderenti per la crescita in sospensione utilizzando MEM modificata di Joklik integrato con siero 5-10% neonato vitello o di siero fetale bovino e 1% di L-glutammina: penicillina-streptomicina. Propagare cellule in fiasche ogiva con un tappo filtro a 37 ° C con 8% di CO 2.
  2. Quando adattamento cellule, iniziare con 100 ml in un pallone da 500 ml filatrice. Mantenere un minimo di 0,3 x 10 6 cellule / ml e sostituire il mezzo ogni 1-2 giorni fino a quando il tasso di crescita corretta si ottiene (in genere 2-6 settimane). Una volta adattato, cellule HeLa in sospensione dovrebbe raddoppiare approssimativamente ogni 24 ore. NOTA: Durante la fase di adattamento, ci vorrà del tempo per le cellule per tornare al loro tasso di raddoppio normale.
  3. Mantenere le cellule in un covosità di 0,5-0,8 x 10 6 cellule / ml di volume finale desiderata (tipicamente 1-10 L)
  4. Le cellule sono in genere raccolte in fase di log metà (circa 0,5-0,65 x 10 6 cellule / ml e> 90% praticabile). Utilizzare il matraccio filatore dimensioni adeguate per la quantità desiderata di coltura.

2. Estratti nucleari

  1. Buffer e Preparazione dei reagenti
    NOTA: Estrazioni vengono eseguite a seguito di una modifica Dignam et al (1983) 14 Procedura estratto nucleare..
    1. Preparare 1X tampone fosfato, tampone A, tampone C, D e buffer (Tabella 1) il giorno prima di procedere con estrazioni e conservare a 4 ° C.
      NOTA: i rendimenti più elevati sono generalmente realizzati con tampone appena preparato; Tuttavia, il tampone è stabile per diverse settimane. È importante che tutti i buffer, apparati e attrezzature sono pre-raffreddata e mantenuta fredda per la totalità delle estrazioni.Utilizzare una stanza fredda a molti passi possibili e / o tenere tutto in ghiaccio. Aggiungi DTT e PMSF immediatamente prima dell'uso.
  2. La raccolta e lavaggio Celle
    1. Versare cellule in quattro bottiglie da 250 ml coniche e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C in una centrifuga con un oscillante o un rotore ad angolo fisso. Surnatanti decantare e aggiungere un altro terreno di coltura cellulare da 250 ml per ogni bottiglia. Ripetere gira finché non sono stati in granuli tutte le cellule.
    2. Risospendere pellet finali combinate in un totale di 250 ml di PBS freddo e la piscina in un flacone da 250 ml conica. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga oscillante secchio.
    3. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PBS freddo in modo che il volume totale non superi i 50 ml. Allentare il pellet tramite pipettaggio e trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml conica.
    4. Spin le cellule di nuovo a 500 xg per 6 minuti a 4 ° C in una centrifuga oscillante secchio. Versare supernatant e stima e notare il volume pellet cellulare (CPV) nel modo più accurato possibile. Usare acqua in un tubo separato corrispondente, per confronto, se il pellet è inferiore alle marcature volume sul tubo.
  3. Lisi cellulare
    1. Aggiungi DTT per tamponare A. Risospendere il pellet in tampone A con 5 volumi della CPV stimata. Pipetta per rompere il pellet e incubare in ghiaccio per 10 min.
    2. Centrifugare le cellule a 931 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga oscillante secchio.
    3. Con attenzione aspirare il surnatante invece di decantazione. Il volume pellet avrebbe dovuto aumentare di circa due volte nelle dimensioni a causa di gonfiore delle cellule.
    4. Aggiungere 1 CPV di tampone A per le cellule. Rompere delicatamente il pellet e rimuovere una piccola aliquota (circa 50 ml) in una provetta per microcentrifuga su ghiaccio. Trasferire le cellule risospese in una di dimensioni adeguate omogeneizzatore Dounce (di solito 15 ml dimensione) raffreddata su ghiaccio.
    5. Lisare le cellule con 12-15 colpi lenti ma costanti di tipo B (tight) pestello. Rimuovere una piccola aliquota del lisato e esaminare al microscopio per lisi completa (intatti piccoli nuclei scuri rispetto alle cellule gonfie) da trypan colorazione blu. Cellule intatte sarà chiaro). Continua omogeneizzazione fino a raggiungere il 90% di lisi e ferma qui, oltre douncing possono influire negativamente sulla qualità di estratti nucleari.
    6. Trasferire il lisato in UltraClear tubi ultracentrifuga e prendere nota del volume totale. Bilanciare pesando i tubi e centrifugare a 1.069 xg per 10 min a 4 ° C.
      NOTA: Il ultracentrifuga viene utilizzato in questa fase nonostante la bassa velocità di centrifuga perché lo stesso tubo verrà centrifugato a velocità elevata nel passaggio successivo. Questo spin produrrà una pallina abbastanza stretto che copre la parte inferiore del tubo con surnatante torbida di cui sopra, che può essere raccolta e utilizzata per gli estratti citosolici S100. Se vi è uno strato lipidico visibile sulla parte superiore del tubo, può essere rimosso.
    7. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta e le trasferisce in anoth.. tubo er Evitare di disturbare il pellet nucleare NOTA: Sarà importante conoscere il volume finale di surnatante, al fine di determinare il volume nucleare compresso (PNV).
  4. Preparazione dell'estratto nucleare
    1. Una volta che il surnatante è stato accuratamente rimosso, respin grezzo estratto nucleare pellet a 25.453 xg per 15 min a 4 ° C nella stessa provetta.
    2. Rimuovere il surnatante rimanente (dovrebbe essere una piccola quantità di liquido chiaro) e aggiungerlo alla collezione surnatante precedente. Misurare il volume finale del surnatante. Calcolare il PNV sottraendo questo volume dal volume totale del lisato originale precedentemente indicato. In alternativa, se il pellet è abbastanza grande, il volume può essere stimata confrontando con volume analogo di acqua in un tubo identico.
    3. Aggiungere 1 volume di tampone PNV C (circa 1 ml / ml di cellule). Rimuovere con cautela il pellet con un puntale e trasferire in un modo appropriato SIzed Dounce omogeneizzatore. Se si utilizza la stessa omogeneizzatore come prima, Prerisciacquare l'omogeneizzatore con acqua deionizzata sterile.
    4. Risospendere il pellet con ~ 5-10 colpi attraverso un omogeneizzatore Dounce utilizzando un pestello stretto.
    5. Trasferire il lisato nucleare omogeneizzato in un tubo raffreddato e mescolare per inversione per 30 min a 4 ° C. Se il volume è abbastanza grande, agitare utilizzando una piastra di agitazione magnetica e bar centrifuga.
    6. Trasferire il lisato in un nuovo tubo da centrifuga ultraclear e girare a 25.453 xg per 30 min a 4 ° C. Il pellet deve essere compatto. Circa 5 minuti prima che lo spin è completa, idratare le cassette dialisi o tubi che hanno un peso molecolare opportuno tagliare (MWCO) (ad esempio 7.000 kDa).
    7. Rimuovere il surnatante (estratto nucleare) dal tubo in un tubo conico refrigerati utilizzando una pipetta di trasferimento quindi procedere con la dialisi.
  5. Dialisi
    1. Iniettare gli estratti in cassette dialisi idratati secondo produttore 's istruzioni e Dializzare gli estratti nucleari in 500 ml di tampone D 50 per 1 ora a 4 ° C con agitazione.
    2. Sostituire il tampone con 500 ml fresca, ghiacciata Buffer D 50 e Dializzare per altre 4 ore a 4 ° C. Questo passaggio 4 ore può essere suddiviso in due modifiche 2 hr invece.
    3. Rimuovere gli estratti dal cassetto di dialisi e trasferire ai tubi refrigerati. Spin estratti per 5 min a 1500 xga 4 ° C.
    4. Aliquota gli estratti in provette Eppendorf refrigerati e far scattare congelare in azoto liquido (50-100 microlitri per ogni aliquota). Conservare a -80 ° C per un uso futuro.

3. RNA Probe Synthesis

  1. Preparazione del modello
    NOTA: Template utilizzati per la trascrizione possono essere frammenti o plasmidi che contengono un promotore T7 o SP6 monte e immediatamente adiacente alla sequenza di sonda desiderata PCR. Modelli plasmidi linearizzati devono essere valle della sequenza template di interest. Abbiamo notato maggiore resa da modelli PCR.
    1. Il promotore T7/SP6 può essere inserito durante la reazione PCR. Progettare il primer senso con il T7/SP6 promotore a monte della sequenza bersaglio.
    2. Amplificare la sequenza desiderata in 2-3 reazioni al modello tramite PCR da istruzioni del produttore utilizzando un polimerasi ad alta fedeltà.
    3. Unire le reazioni equivalenti e purificare per estrazione gel.
    4. Sequenza prodotti di PCR per verificare l'accuratezza del modello. (Facoltativo)
  2. RNA Trascrizione con 32 P etichettatura
    1. Eseguire trascrizione in vitro da 1 mg di modello con un kit disponibile in commercio che sia compatibile con il promotore (SP6 o T7) con le seguenti modifiche. Utilizzare 1 ml di fresca 3.000 Ci / mmol [α-32 P] UTP, 0,5 ml di 10 mM UTP freddo, 0,1 ml di GTP 10 mm, e 0,9 ml di M7G 10 mm (5 ') ppp (5') G RNA tappo in un volume finale di 20 microlitri.
      NOTA: Il G-cap migliora la stabilità dei trascritti di RNA in estratti nucleari (cap: GTP) 10:1. Il UTP freddo viene aggiunto per impedire la 32 P-UTP dall'essere il reagente limitante.
    2. Sintetizzare una dimensione di scala di RNA, come indicato sopra, senza il tappo G. Modelli commerciali sono disponibili per generare il marcatore di formato RNA.
    3. Incubare le reazioni di trascrizione a 37 ° C per 1 ora (per uso SP6 40 ° C). Una volta completato, eseguire DNasi digestione del modello per 15 min a 37 ° C.
    4. Dopo la digestione, aggiungere 1 ml di 0,5 M EDTA e 5 ml di caricamento del buffer II ai substrati di RNA. Aggiungere 20 microlitri di buffer di caricamento II al marcatore.
    5. Riscaldare il marcatore RNA e sonde a 95 ° C per 3 min poi disporli sul ghiaccio.
  3. Gel Poliacrilamide Casting / Sonda elettroforesi
    1. Preparare 1 L di 6% gel di poliacrilammide (PAGE) mix e 400 ml di 10% PAGE. Per rendere il 6%, mescolare 150 ml di 40% 19:01 acrilamide: bis-acrylamide con 100 ml di 10X Tris / Borato / EDTA (TBE) e 460 g di urea. Portare a 800 ml con acqua deionizzata sterile e mescolare su una piastra durante l'applicazione a basse temperature (intorno a 50-80 ° C). Completare a 1 L con acqua deionizzata.
      NOTA: La reazione è endotermica. Riscaldamento favorisce la solubilizzazione del urea. Togliere dal fuoco non appena l'urea viene disciolta e portare la soluzione a 1 L con acqua deionizzata. In alternativa, agitare a temperatura ambiente per una notte; troppo calore può avviare la polimerizzazione.
    2. Proteggere il mix PAGE dalla luce con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente. Le miscele PAGE possono essere preparati in anticipo e sono stabili per diversi mesi.
    3. Preparare 400 ml di 10% della miscela PAGE combinando 100 ml di 40% di acrilammide: 19:1 bis-acrilammide, 40 ml di TBE 10x e 184 g di urea. Dopo le dissolve urea, portare a 400 ml con acqua deionizzata.
      In alternativa, preparare una soluzione di acrilammide 19:01 del 20% e una soluzione di acrilammide 0% wisolo esimo buffer e urea; questi possono poi essere miscelati in qualsiasi proporzione invia qualsiasi percentuale fra 0 e 20%; urea è sempre lenta a dissolversi.
    4. Preparare 10-50 ml di soluzione al 10% di persolfato di ammonio (APS) in acqua deionizzata sterile a seconda del numero di gel di essere espressi.
    5. Lavare 20 centimetri x 22 cm lastre di gel di vetro con il 70% di etanolo (EtOH). Asciugare con grandi salviette lint libero.
    6. Lavare la piastra regolare con 1 ml di idrossido di sodio 5 N (NaOH) e poi rilavare con il 70% EtOH. Rivestire la piastra dentata con la soluzione di gel respingono siliconatura pulendo il piatto con una piccola Kimwipe saturo.
    7. Montare le piastre posizionando la piastra regolare su una scatola vuota punta della pipetta o un pezzo di polistirolo per elevare dalla tabella con il lato rivolto verso l'alto pulito. Lay 0,4 millimetri distanziali sul bordo di ogni lato lungo.
    8. Posizionare accuratamente la piastra dentata sui distanziali in modo che il lato rivestito sarà all'interno del gel. Utilizzare un rasoio o un altro strumento sottile per spostarei distanziali per un allineamento a filo sul fondo e sui lati delle lastre di gel poi fissare con clip legante su ogni lato delle lastre di gel sui distanziatori.
    9. Preparare 30 ml di 8% PAGE miscela per gel miscelando 15 ml di 10% e 6% mescola ciascuno in un tubo da 50 ml. Aggiungere rapidamente 300 ml di 10% APS seguiti da 30 ml di N, N, N ', N'-tetra-methylethylenediamine (TEMED) alla miscela gel 8%.
      NOTA: appropriate percentuali di gel per le dimensioni delle singole sonde dovrebbero essere selezionati dallo sperimentatore.
    10. Cap e 2x invertito e versare la soluzione nella zona dentellata delle lastre di gel. Assicurarsi di elevare leggermente le piastre a mano e mantenere lo stesso versare finché la miscela PAGE inizia a gocciolare fuori dal fondo.
    11. Abbassare le piastre torna a livello e inserire immediatamente la grande 8-bene rettangolo pettine per 0,4 millimetri x 20 cm gel. Piccole bolle vicino al fondo non influenzano il funzionamento, ma non ci dovrebbero essere bolle nei pozzetti.
      NOTA: <Tovaglioli di carta / strong> Posizionare sul tavolo sotto la parte inferiore e superiore del gel per catturare eventuali sversamenti durante il getto.
    12. Lasciare la miscela PAGE polimerizzare per almeno 30 min.
    13. Trasferire il gel polimerizzato alla camera fredda e montare l'apparato elettroforesi. Aggiungere tampone TBE freddo alle linee di riempimento sulle camere superiore ed inferiore.
    14. Togliere il pettine e utilizzare un rasoio per rimuovere eventuali detriti. Impostare il gel nell'apparato e utilizzare un legante clip per tenere la piastra alla guarnizione. Aggiungi TBE freddo per la camera superiore fino a sfociare nelle piastre.
    15. Lavare i pozzetti con 30 ml syringe/21 G 1-1/2 ago "piena di freddo TBE appena prima di caricare i substrati di RNA etichettati. Collocare una lastra di alluminio sul retro del vetro per facilitare la distribuzione uniforme del calore durante il funzionamento.
    16. Carico 3 microlitri del marcatore e l'intero 25 microlitri reazione di trascrizione di RNA in ciascun substrato pozzetti separati. Lascia un bene tra trascrizioni di dimensioni simili a prevent contaminazione incrociata. Blu di bromofenolo e xilene coloranti cyanol nel tampone di caricamento possono essere usate per stimare la migrazione formato sul gel.
    17. Attivare il gel a una potenza costante appropriata per le dimensioni delle sonde di RNA (es 25 watt per 2 ore per sonde di 600 nt).
  4. Etichettato RNA estrazione e purificazione
    1. Dopo l'elettroforesi, drenare accuratamente la camera dall'alto dell'apparato gel. La maggior parte della radioattività sarà nel gel e la camera inferiore; Tuttavia, il tampone superiore può contenere materiale radioattivo.
    2. Utilizzare un vassoio per trasportare il gel se trasferirsi in un'altra area di lavoro materiale radioattivo. Rimuovere accuratamente i distanziali tirando il pezzo sporgente lateralmente dal gel.
    3. Separare delicatamente le piastre. Il gel dovrebbe attenersi alla piastra che non è stato siliconato. Posizionare un pezzo di pellicola trasparente sopra la lastra di gel e vetro.
    4. Posizionare un glogos autorad marcatore adesivo sulla plastica aderente un sonouna del gel che sia privo di qualsiasi campione.
    5. In una stanza buia, inserire un pezzo di pellicola autoradiografica su tutta la piastra ed esporre per almeno 1 min. Sviluppare il film.
    6. Posizionare la pellicola sviluppata su una superficie di luce. Poi posizionare il lato di plastica del gel faccia in giù sulla pellicola e allineare il marker autorad dal gel al marcatore esposta sulla pellicola. Una volta allineati, utilizzare un pennarello nero per contrassegnare la posizione delle bande desiderati sul vetro.
      NOTA: In alternativa, allineare gel / pellicola nel modo seguente per tagliare bande di RNA. Nella camera oscura, collocare il gel avvolto su un tavolo, posizionare il film su di esso e inserire una cassetta (o libro, ecc) in cima al pezzo di pellicola. Flick l'interruttore della luce nella stanza brevemente, poi girare se spento. Questo sarà 'preflash' del film generando una descrizione di tutti i pozzetti sulla pellicola a causa della pressione / protezione dalla luce che la cassetta sopra fornisce. Ciò rende facile allineare la pellicola sul gel e tagliarela band senza l'utilizzo di marcatori fluorescenti.
    7. Rimuovere con cautela l'involucro di plastica e utilizzare un bisturi fresco o rasoio per ciascun substrato RNA e asportare le bande dal gel e riporre in 1,7 ml tubi microcentrifuga separate. Utilizzare un nutator per agitazioni dolci durante l'eluizione.
    8. Aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione RNA (0,5 M di acetato di ammonio, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) a ciascun tubo. Centrifugare brevemente per immergere il frammento gel. Incubare a temperatura ambiente al buio per 3-16 ore a seconda delle dimensioni della sonda.
    9. Trasferire l'intero 500 ml di materiale eluito in un nuovo tubo. Evitare di trasferire eventuali pezzi di gel in quanto interferiscono con la purificazione. Aggiungere 1 ml di glicogeno (20 mg / ml) con 500 ml di freddo, acido fenolo-cloroformio (per RNA).
    10. Brevemente vortice, la soluzione dovrebbe apparire torbida. Spin a temperatura ambiente alla massima velocità (~ 16.000 xg) per 5-6 min.
    11. Attenzione transfer all'inizio (acquosa) strato di nuovi tubi di raccolta, per quanto possibile, evitando i detriti dall'interfase. Aggiungere una quantità uguale di cloroformio allo strato acquoso trasferito. Ripetere il punto 3.4.10 e trasferire la parte superiore (acquosa) livello in un nuovo tubo. Aggiungere 1 ml di ghiacciata 95-100% EtOH al materiale raccolto. Incubare a -80 ° C per 10 min. NOTA: L'RNA può essere conservato durante la notte se lo desideri.
    12. Il pellet di RNA per 30 minuti a 16.000 xg a 4 ° C. Versare con cautela il surnatante in un contenitore di rifiuti radioattivi e aggiungere 1 ml di grado molecolare ghiacciata del 70% EtOH a ciascun pellet.
    13. Pellet l'RNA a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C, versare il surnatante, girare ancora per 1 min e rimuovere eventuali residui di EtOH tramite pipetta e lasciare a temperatura ambiente con i tappi aperti per consentire l'evaporazione di qualsiasi residuo EtOH.
    14. Risospendere il pellet in 20-30 ml di acqua RNase-free. RNA etichettati, possono essere conservati a -80 ° C.
      NOTA: Un metro sondaggio radioattivo deve essere utilizzato durante tutta la procedura di estrazione per verificare che l'RNA marcato non è stato perso in ogni fase.
  5. La quantificazione di RNA etichetta per una reazione pre-mRNA 3 'mRNA Decolleté
    1. Approssimare la molarità dei substrati scissione utilizzando la seguente procedura.
      1. Prendiamo, per esempio, 1 ml di 3.000 Ci / mmol [α-32 P] UTP e 10 mCi / ml. (Alla data di riferimento etichetta, la concentrazione chimica di questa soluzione, sarà 3.3 micron UTP. Prima di tale data esso è più elevato e una emivita (~ 13 giorni) dalla data che è ~ 1,6 mm, ecc) Il marcato contributo UTP alla concentrazione di reazione finale è tipicamente trascurabile quando si usa un finale concentrazione UTP fredda sopra il UTP K m. Il T7 RNAP K m per UTP è di 114 mm 15.
      2. Diluire il 1 ml in 39 ml di acqua. Quindi aggiungere 1 ml di diluito [α- (NOTA: il fluido di scintillazione non è effettivamente necessario per questa attività specifica di 32 P come Cerenkov conteggio darà valori di cpm attendibili troppo Consultare il manuale contatore a scintillazione per scegliere il canale corretto per Cerenkov conteggio e conta un volume di 1 ml per 1 min.).
    2. Diluire 1 ml di ogni substrato RNA marcato in flaconi separati con una pari quantità di liquido di scintillazione utilizzato nel passaggio precedente. Assicurarsi di avere un flaconcino con solo liquido di scintillazione per calcolare sfondo. Quantificare la radioattività in un contatore a scintillazione.
    3. Moltiplicare i conteggi per minuto (cpm) per il campione UTP [α-32 P] dal 40 al fattore di diluizione iniziale e sottrarre lo sfondo ottenuto dal solo fluido di scintillazione. Moltiplicare i conteggi per ciascuna sonda RNA dalla quantità di acqua priva di RNasi (20-30 ml) usata per risospendere il RNA sonde. Questo dà il cpm totale del RNA purificato.
      Esempio:. Cpm Max = (cpm [α-32 P] UTP - sfondo) x 40 Esempio di RNA etichettati 1 = 20.000 cpm x 20 = 400.000 cpm (se 20 microlitri utilizzati per risospensione)
    4. Se una quantità diversa da 1 ml di [α-32 P] UTP stato usato per fare le trascrizioni, allora questo fattore di volume nel cpm finale di [α-32 P] UTP moltiplicando il cpm per il [α-32 P] campione UTP dalla quantità utilizzata.
      Esempio: 2 l di [α-32 P] UTP è usato per fare le trascrizioni. Il cpm calcolato per 1 ml [α-32 P] UTP è di 500.000 cpm. Moltiplicare 500.000 * 2 = 1.000.000 cpm
    5. Dividere il calcolo cpm RNA marcato dal cpm calcolato per [α-32 P] UTP da solo. Ciò stimare approssimativamente la percentuale di UTP etichettato incorporato.
      Esempio: 400.000 / 1.000.000 = 0,40 o 40%incorporato
    6. Da un enzima non può distinguere tra isotopi, la stessa percentuale di etichettatura e non marcato UTP viene incorporata nel RNA durante la trascrizione. Calcolare la quantità di UTP freddo in moli che viene aggiunto alla reazione di trascrizione (0,5 ml di una soluzione 10 mM = 5.0 x 10 -9 moli di UTP).
    7. Moltiplicare il UTP moli nella reazione dal cento incorporato (noto dalla UTP caldo contando sopra), poi dividere per il numero di uridines nella sequenza RNA.
      Esempio: 5.0 x 10 -9 moli di UTP x 0,40 = 2 x 10 -9 moli UTP
      2 x 10 -9 moli UTP / 73 U per trascrizione = 2.7 x 10 -11 moli di RNA
    8. Convertire moli di RNA a molarità dividendo il volume della soluzione di risospensione RNA recuperato.
      Esempio: 2.7 x 10 -11 moli di RNA / 20 l = 1.370 nM RNA. Per trascritti T7 RNAP fatte da circa 1 ug lineareized plasmide e risospeso in 20 microlitri di acqua, valori da 200 a 1.400 nm sono tipici.
      NOTA: La concentrazione molare di RNA viene utilizzato per garantire che la concentrazione finale del substrato pre-mRNA nella reazione di scissione in vitro è inferiore a 5 nM per reazione di scissione. Efficienza Decolleté può diminuire se la concentrazione di RNA è sollevata significativamente al di sopra 5 nM.

4. 3 'mRNA Decolleté Reazione

  1. Decolleté Reazione Preparazione dei reagenti
    1. Preparare tutti i reagenti necessari per la reazione di scissione. Fai alcool polivinilico 10% (PVA) di acqua bollente e aggiungere lentamente la giusta quantità di polvere PVA. 10% PVA sarà viscoso e richiede tempo a dissolversi. Conservare a temperatura ambiente o -20 ° C.
    2. Preparare 1 M creatina fosfato (CP) e conservare a -80 ° C. È importante utilizzare 1 M CP che è inferiore a 4 mesi.
    3. Preparare 1 M DTT e negozioa -20 ° C. Fare un fresco 0,2 M DTT diluizione dal 1 M DTT appena prima di fare la reazione di scissione.
    4. Preparare ETS (soluzione di arresto scissione): 10 mM Tris pH 7.8, EDTA 10 mM, 0,5% SDS. Conservare a temperatura ambiente.
  2. Decolleté Reazione
    1. Riscaldare marcati RNA a 80 ° C per 2 min poi disporli sul ghiaccio.
    2. Vortice delicatamente e poi girare il PVA 10% alla massima velocità per 2-3 minuti per rimuovere le bolle.
    3. Mix Master 1: per una singola reazione, unire 3,125 microlitri 10% PVA, 0,625 ml 1 M CP, 0,25 ml di 0,5 M tRNA, 0,125 ml 100 dATP mM, 0,13 microlitri 40 U / inibitore della RNasi ml, 0,25 ml di 0,1 M EDTA pH 8 , 0,1 microlitri 0,2 M DTT, e 0,645 di acqua RNase-free microlitri. Dispensare 5,25 microlitri mix master 1 per provetta su ghiaccio.
    4. Master Mix 2: Uso 6,25 microlitri / reazione di estratti nucleari a concentrazioni superiori a 2 mg / ml. Estratti nucleari possono essere diluiti con tampone D 50 se needed.
    5. Unire le 6.25 ml di estratto nucleare con il già erogato 5.25 ml di Master Mix 1. Aggiungere 1 ml di substrato RNA marcato che viene diluito a 50 nm. In alternativa, l'RNA può essere incluso nella miscela master 1, purché esso viene aggiunto dopo l'inibitore della RNasi, DTT e tRNA. NOTA: utilizzo <5 nM del substrato RNA marcato.
    6. Vortice delicatamente e giro veloce ogni campione per rimuovere le bolle. Incubare a 30 ° C per 2 ore, ma un corso di tempo deve essere eseguita per ottenere risultati ottimali. Incubazioni più lunghe potrebbero aumentare sfondo degradazione.
  3. Proteinase K Digestione e purificazione
    1. Rimuovere i campioni dal fuoco e aggiungere 182,5 ml di soluzione di stop ETS per ogni reazione. Aggiungere 5 ml di 20 mg / ml proteinasi K e incubare i campioni a 37 ° C per 10 min.
    2. Estrarre l'RNA aggiungendo 1 volume (200 ml) di acido fenolo-cloroformio, 1/10 del volume (20 ml) di sodio 3 Macetato, e 1 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Procedere con estrazioni come descritto nelle sezioni 3.4.9-3.4.14.
    3. Una volta che l'estrazione di RNA è stata completata, assicurarsi di rimuovere tutti i residui di EtOH. Risospendere il pellet in 8 ml di tampone di caricamento (90% formammide, EDTA 10 mm, con blu di bromofenolo (BFB) (e xilene o cyanol Blue)). I campioni possono essere conservati a -80 ° C o procedere con elettroforesi su gel.
  4. Elettroforesi Decolleté Reazione
    1. Preparare un gel di acrilammide 6% come precedentemente indicato in sezioni 3.3.1-3.3.17 con alcune modifiche. Utilizzare 20 cm x 42 centimetri lastre di gel di sequenziamento con 2 clip legante su ciascun lato lungo. Utilizzare un pettine a 32 bene e preparare 40 ml di mix gel.
    2. Caricare il gel con 3 ml di marcatore e 5 ml di ogni campione. Ottimizzare le impostazioni di elettroforesi in base alle pre-scissione e spaccati Prodotto dimensioni.
    3. Quando elettroforesi è completato, seguire le sezioni 3.4.1-3.4.3 </ Strong> per smontare il gel. Invece di pellicola trasparente, tagliare un pezzo di carta da filtro per le dimensioni della lastra di gel e depositarla su un lato del gel esposta.
    4. Premere la carta da filtro saldamente sul gel, poi capovolgere la piastra in modo che la carta da filtro è sul fondo e il vetro sia in alto. Premere saldamente il bicchiere sul tavolo per assicurarsi che il gel è presa la carta da filtro in modo uniforme.
    5. Separare lentamente la carta da filtro, che dovrebbe avere il gel collegato ad esso, da uno dei lati corti finché tutta la carta filtro con gel divisoria viene rimosso dalla lastra di vetro.
    6. Coprire il lato gel esposta con involucro di plastica. Nastro l'involucro di plastica per la carta da filtro.
    7. Porre il gel in un essiccatore gel con il lato rivolto verso il lato filtro vuoto. A secco per 15 minuti o fino a quando il gel è completamente asciutto.
      NOTA: Se un essiccatore gel non è disponibile, pellicola di raggi X può essere usato per visualizzare le bande di RNA. L'esposizione deve essere effettuata in un light-stretto di cassette con schermo intensificazione a -80 ° C. Il tempo di esposizione è determinato empiricamente. Attenzione: gel basso per cento di acrilammide possono incrinarsi momento di congelamento.
    8. Il gel può essere utilizzato per esporre pellicola o essere utilizzata con un fosfo-imager. Tempo di esposizione dipende dalla forza del RNA marcato. Inizialmente si può usare un esposizione di 24 ore. Se si utilizza film, esporre a -80 ° C con uno schermo intensificazione e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente prima di sviluppare.
    9. Misurare il rapporto tra RNA spaccati e non-spaccati in ogni campione per quantificare l'efficienza scissione.

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Representative Results

Risultati rappresentativi di un saggio di scissione del RNA poly (A) siti di HIV-1 (Figura 2). Possiamo osservare il substrato RNA uncleaved, che è la banda più lenta migrazione nella parte superiore del gel. Il prodotto spaccati specifico è la banda più breve frammento più intensa che corre più veloce nel gel alla dimensione prevista, ed è specificamente assente dal saggio di clivaggio della (A) controllo mutpoly che contiene una mutazione puntiforme nella sequenza poly (mutPolyA) RNA substrato. Possono talvolta essere osservate prodotti di degradazione del substrato ingresso. Determinazione dell'attività clivaggio può essere determinata mediante trama densitometrica del rapporto di uncleaved di RNA spaccati normalizzata a 100% di RNA non scissa.

Figura 1
Figura 1. Schematica raffigurazione della HIV-pre-substrati mRNA 3 'finali di lavorazione e prodotti attesi della vitro le reazioni di dissociazione e poliadenilazione in. sito di scissione, il dinucleotide-CA-, si trova 25 nt a valle del sito poliA AAUAAA. Regioni LTR: U3 (unico 3 'sequenza), R (sequenza ripetuta), e U5 (unico 5' sequenza).

Figura 2
Figura 2. (A) Poly (A) di sfaldatura. RNA 32 P-marcato contenenti poli (A) di HIV-1 e una mutazione puntiforme del poli (A) segnale che abolisce clivaggio (mutPolyA) sono state incubate in estratti nucleari di cellule HeLa-S3 o BSA come controllo negativo. Freccia in grassetto indica 5 'spaccati prodotto. Il 'frammento 3 corre spesso il gel o è degradato e non sempre visibile. (B) plot densitometrica della Activi scissionety espresso come rapporto di uncleaved di RNA spaccati normalizzata a 100% di RNA non scissa.

Tampone A (100 ml) Tris 10 mM (pH 7,9), 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0,5 mM ditiotreitolo (DTT). Aggiungere DTT appena prima utilizzando tampone A durante l'estrazione. Aggiungere 1 ml di 1 M DTT per 1 ml di tampone A.
Tampone C (50 ml) Tris 20 mM (pH 7,9), 25% (v / v) di glicerolo, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), DTT 0,5 mM, fluoruro phenylmethylsulfonyl 0,5 mM (PMSF). Aggiungere un cocktail tablet inibitore della proteasi la mattina delle estrazioni.
Buffer D 50 (2-4 L) Tris 20 mM (pH7.9), 20% (v / v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, DTT 0,5 mM, 50 mM di solfato di ammonio. HEPES-KOH può essere sostituito in tampone Tris A, C e D.
0,5 M di acetato di ammonio e, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 0,2% sodio dodecil solfato (SDS) Conservare a temperatura ambiente.
Arresto Buffer (ETS) Tris 10 mM (pH8.0), EDTA 10 mM, 0,5% SDS Conservare a temperatura ambiente.
Decolleté Loading Buffer 90% formammide, 5 mM EDTA pH8, 0.025% blu di bromofenolo Conservare a -20 ° C.

Tabella 1. Composizione di buffer.

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Discussion

Il pre-mRNA 3 'di reazione in vitro scissione, effettuate negli estratti nucleari di cellule HeLa o con fattori di scissione frazionati da questi estratti, ha permesso l'identificazione dei fattori scissione core e loro principali complessi 16-21. Molte altre proteine ​​associate a questi fattori sono stati recentemente identificati 22, e la reazione in vitro possono continuare a far luce su come queste proteine ​​contribuiscono alla reazione. Forse perché la reazione in vivo appare essere cotranscriptional 23, o perché alcuni fattori possono essere persi durante l'estrazione e la dialisi, l'efficienza è spesso scarsa, e raramente è superiore al 30% clivaggio è raggiunto. Inoltre, l'efficienza di reazione può cadere improvvisamente da un giorno all'altro senza alcuna ragione apparente. Pertanto, è importante apprezzare che passi sono le più critiche, specialmente quando si cerca di adattare la reazione di modifica o viralmente infettate cel HeLals, ad altri tipi di cellule o di nuovi substrati.

Senza dubbio, la qualità dell'estratto e la freschezza del RNA in vitro trascritto sono di primaria importanza, così come la necessità di lavorare in condizioni scrupolosamente RNase-free. La salute delle cellule nel momento in cui sono raccolte per l'estrazione è importante. Le cellule devono apparire sani, devono essere raddoppiare in meno di 24 ore, dovrebbero essere in fase di avvicinamento o di log a metà, e non ci dovrebbero essere poche cellule morte o altri detriti inspiegabile. Ovviamente, le cellule non devono essere contaminati da micoplasmi o altri batteri. Il substrato non deve essere fatta con troppo elevata attività specifica, in quanto questo può portare alla degradazione apparente.

Quando una sequenza abbastanza grande da qualsiasi lato del sito di clivaggio è considerato, e poliadenilazione alternativa è rappresentato, il numero di poli diverso (A) segnali di sequenza nel genoma umano supera indubbiamente il numero di geni 24 25. La combinazione di un poli debole (A) sequenza segnale con cellule diverse cellule HeLa standard può risultare frustrante, ed è meglio prima di utilizzare un forte substrato con nuove cellule, o cellule HeLa non modificati con un substrato potenzialmente debole poliA.

Anche dopo tanti anni di utilizzo con successo, ci sono ancora misteri minori connessi con la reazione vitro 3 in 'scissione. Per esempio, perché è creatina fosfato necessaria? È stato dimostrato che la ragione originale di introdurlo - per rigenerare la piscina ATP - non è valido 26. È interessante notare, può essere omesso con perdita solo parziale di attività quando estratti nucleari sonoutilizzato, ma diventa progressivamente più necessario come estratto viene frazionato in fattori scissione parzialmente purificate che vengono utilizzati per ricostituire la reazione. Infatti, phosphocholine, un'altra piccola molecola con un gruppo fosfato e una ammina carica positiva, ma che possa avere alcun ruolo in vivo nella reazione, è stato trovato per essere più efficace di creatina fosfato, almeno nella reazione ricostituita 27. PVA è un altro ingrediente il cui requisito non è pienamente spiegato. Si presume essere un agente affollamento, portando ad un aumento effettivo concentrazione fattore clivaggio, ma altri agenti affollamento, come polietilene glicole, non funzionano altrettanto bene. La comprensione di questi fattori potrebbe portare ad una maggiore efficienza, consentendo l'estensione del metodo di tipi di cellule e substrati di RNA meno efficiente, e potrebbero fornire indizi su come i vari fattori di lavoro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

SV è grata per il sostegno finanziario dal NIH K22AI077353 e la Fondazione Landenberger. KR ringrazia finanziamenti del NIH (5SC1GM083754).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Celstir flask Wheaton 356884 Different sizes available
4 position slow speed stirrer VWR 12621-076
Swinging bucket centrifuge Beckman Coulter Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R Eppendorf Refridgerated
Thermomixer incubator Eppendorf
250 ml conical tubes Corning 430776
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
Ultraclear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
JOKLIK modified MEM Lonza 04-719Q
Fetal bovine serum Atlas F-0500-A Heat inactivated
L-glut:pen:strep Gemini Bio-Products 400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0 Mediatech 46-031-CM
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Potassium chloride MP Biomedicals 194844
HEPES Fisher BP310-500
DTT Alexis Biomedicals 280-001-G-010
Glycerol Fisher BP229-4
5 M sodium chloride solution Mediatech 46-032-CV
EDTA 0.5 M solution Sigma-Aldrich E7889-100ml
EDTA Fisher BP120-500
PMSF Thermo Scientific 36978
Ammonium sulfate Fisher A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit Thermo Scientific 66372 MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D9938-1SET Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit Roche 11 732 650 001
10 mM dNTP Mix Invitrogen Y02256 10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit Ambion AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap New England Biolabs S1404S
Century Marker Template Plus Ambion AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi Perkin Elmer BLU507H250UC
Gel loading buffer II Ambion 8546G
DEPC treated water Ambion AM9906
10x TAE Fisher BP13354
10x TBE Ameresco Life Sciences 0658-4L
10x PBS Fisher BP399-20
Urea Fisher BP169-212
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
TEMED Fisher BP150-20
Ammonium acetate Fisher A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide Bio-Rad 161-0144
Glycogen Roche 10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof Acros 61509-0040
Acid phenol:chloroform Ambion 9720 For RNA
Scintilation fluid Fisher SX18-4
Rnase inhibitor Promega N261B
Polyvinyl alcohol- PVA Sigma-Aldrich P8136-250G
Creatine phosphate Calbiochem 2380
100 mM dATP Fisher BP2560-4
SDS Acros 23042-5000
Proteinase K Fisher BP1700-100
Adjustable sequencing unit Sigma-Aldrich Z351881-1EA
Binder clips Office Depot 838-056
20 cm x 42 cm glass plates Sigma-Aldrich Z352543 1 SET
20 cm x 22 cm glass plates Sigma-Aldrich Z35252-7 1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates Sigma-Aldrich Z352667 1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers Sigma-Aldrich Z35230-6 1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers Sigma-Aldrich Z352314-1 1 SET
8-well comb Sigma-Aldrich Z35195-4 1 EA
16-well comb Sigma-Aldrich Z351962 1 EA
32-well comb Sigma-Aldrich Z351970 1 EA
Gel repel coating C.B.S. Scientific SGR-0401 or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips Rainin GT-10-4 0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV Bio-Rad PowerPac HV 5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583 Bio-Rad Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers Agilent 420201
Film 8 x 10 Midsci BX810
Film 14 x 17 Phenix F-BX1417
Autoradiography cassette Fisher FBCA 1417 8 x 10 size available

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References

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