Den pial ytan är en unik stamfader zon i CNS som får allt större uppmärksamhet. Häri vi detalj en metod för snabb genetisk manipulering av denna progenitor zonen med användning av en modifierad elektroporeringsmetoden. Detta förfarande kan användas för cellulära och molekylära undersökningar av cell linjer och signaleringsvägar involverade i cell-differentiering och för att belysa vad som händer och egenskaperna av dotterceller.
Under de senaste åren pial ytan har identifierats som en germinal nisch av betydelse under foster, perinatal och vuxen neuro-och gliogenesis, även efter skada. Men metoder för genetiskt förhöra dessa progenitorceller populationer och spåra deras härstamningar hade begränsats på grund av brist på specificitet eller tidskrävande produktion av virus. Således har framstegen på detta område varit relativt långsam med bara en handfull undersökningar av denna plats. Elektroporation har använts i över ett decennium för att studera neurala stamceller fastigheter i embryot, och mer nyligen i postnatal hjärnan. Här beskriver vi en effektiv, snabb och enkel teknik för genetisk manipulation av pial ytan progenitorer som baseras på ett anpassat elektroporering tillvägagångssätt. Pial yta elektroporering möjliggör facile genetisk märkning och hantering av dessa föregångare, vilket motsvarar en tidsbesparande och ekonomisk metod för att studera dessa celler.
Neurala stamceller och stamfaderceller är närvarande i hela CNS hos däggdjur 1, 2. Deras natur och egenskaper i embryonala och vuxna embryon zoner kring kammar regioner i hjärnan och ryggmärgen har utförligt dokumenterat i det senaste decenniet 1-3. Till stor del har detta berott på utvecklingen av mer exakta genetiska verktyg, såsom nervsystemet specifik Cre rekombination av floxed alleler eller retroviral lineage tracing 4. Men en stamfader region-pial ytan gångare zon-har nyligen beskrivits i detalj 5-7 och väntar omfattande undersökning.
Pial hjärnans yta definieras som gränsytan mellan ytan av hjärnan och de omgivande hjärnhinnorna 8. Under utveckling, neuroepiteliala och, senare, radiella gliaceller slut fötter fäster denna yta 9,10. En del av granst nervceller i den mänskliga hjärnan och många neuronala mitoser observeras i denna region 11. Senare, under foster neurogenes, är kortikala intern kända för att korsa pial regionen, utöver sina flyttvägar i mellanzonen och subventrikulära zonen 12-14. Under denna period kan stamceller odlas från denna zon och det verkar vara ett aktivt ställe av neuro-och gliogenesis 5. I den vuxna hjärnan, har det rapporterats att intern kan födas från pial ytan stamceller efter hypoxisk utmaning 7. Däremot har bidrag i denna region till hans att genensis under foster-och postnatal utveckling var fortsatt oklar delvis på grund av svårigheten att specifikt utreda denna region 6. I den överlägsna colliculi och i hjärnbarken, kan ytliga (eller skikt I i cortex) intern modulera utgångskretsen underliggande excitatoriska neuronpopulationer och därmed bidra signifikantaoch art till funktionen hos dessa strukturer. Särskilt lager 1 interneuronen är i utmärkt läge för att reglera bränning av nervceller under de övre lagren av hjärnbarken med tanke på deras omfattande anslutningsmöjligheter till de ytliga och djupa lager av bark-kolonner 15,16. På ett liknande sätt, horisontella interneuronen får excitatoriska input från kortikala och retinala fibrer, projekt över ett relativt stort område och spekulerade att förmedla hämning av neuronala populationer svarar på fjärr visuella stimuli 17,18. Dessutom är deras morfologi väl lämpad för att spela en potentiell roll i den mönstrade våg aktivitet i framkallnings synsystemet 19. Interestingly interneuron utveckling och mognad sker i stor utsträckning postnatalt. Vidare har denna mognadsprocess visat att regleras av nervaktivitet och är därför ett substrat av utvecklings plasticitet med livslånga konsekvenser för kretsfunktion 20,21. Notably, no tagare beskrivs som specifikt kan rikta dessa celler transgent. Delnings progenitorer kan riktas med retrovirus 7 men virusproduktionen är tidskrävande och kräver skicklighet för att ge de höga titrar som behövs för cellöverföring.
Elektroporation har lett till en renässans i studiet av nervsystemets utveckling eftersom det möjliggör snabb och effektiv genetisk förhör av signalvägar i neurala stamceller 4, 22, 23. Elektroporation innebär injektion av plasmid-DNA, följt av avgivning av elektriska pulser till utsidan av huvudet, att ensriktat driva DNA i de prolifererande ursprungsceller som omger kamrarna 4, 22, 23. Elektroporation verkar kräva transitering av celler genom M-fasen av cellcykeln för expression av plasmid-transgener 24. Specifikt har man funnit att endastceller som passerar genom M fas inom 8 timmar av elektroporering av plasmider kommer att uttrycka transgener trots deras effektiva leveranser till alla celler i ~ 160 nm av kammarväggen 24. Det spekuleras i att detta beror på behovet av kärnhöljet uppdelning i att låta för nukleär åtkomst av de episomala plasmider, såsom kemikalier som orsakar nukleär permeabilization kan inducera expression av plasmidema i post mitotiska celler 25. Ursprungligen användes i embryot 22 ades elektroporering anpassad för användning i den postnatala hjärnan mycket senare 26, 27. Nyligen har vi anpassat elektroporation för användning i genetisk manipulation av pial yta gångare 6. Vidare, genom att använda denna metod har vi visat att det finns uppenbarligen två olika linjerna av progenitorer i denna region-interneuronal och astrocytisk 6. Detta protokoll detaljer en enkel, snabb, och kraftfullt sätt att rikta dessa celler för det undersökandeav de mekanismer som styr utvecklingen av dessa celler.
Den mest kritiska aspekten för framgångsrik elektroporation av pial yta gångare är: 1) inriktning av plasmiden mix till pial ytan; 2) undvika alstringen av hematom vid injektionsstället; och 3) att undvika dödlighet i samband med mitthjärnan elektroporation.
Lämpligt riktar pial ytan sker genom uppmätt och noggrann punktering av skallen för att undvika penetration av pial ytan. Felaktig inriktning för att den överliggande huden eller underliggande ventrikel eller hjärnparenkymet…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för stöd från Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award samt medel från Regenerative Medicine Institute of Cedars-Sinai, och Guerin Familj. Projektet beskrivs stöddes i form av en CTSI Kärna Voucher finansieras av National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, och är nu på National Center for Advancing Translational Vetenskaper, Grant UL1TR000124. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Item Name | Vendor | Catalog Number |
Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |