Summary
La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d'électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d'élucider le sort et les propriétés des cellules filles.
Abstract
Au cours des dernières années, la surface pial a été identifié comme un créneau germinal de l'importance au cours embryonnaire, périnatale et adulte neuro-et gliogénèse, y compris après une blessure. Cependant, les méthodes d'interrogation génétiquement ces populations de cellules progénitrices et de suivre leurs lignées ont été limitées en raison d'un manque de spécificité ou de temps de production de virus. Ainsi, les progrès réalisés dans cette région a été relativement lente avec seulement une poignée d'enquêtes de ce lieu. L'électroporation a été utilisée pour plus d'une décennie à étudier neurones propriétés de cellules souches dans l'embryon, et plus récemment dans le cerveau postnatal. Nous décrivons ici une technique efficace, rapide et simple pour la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales fondées sur une approche d'électroporation adapté. Pial surface électroporation permet d'étiquetage génétique facile et la manipulation de ces progéniteurs, qui représente une approche gain de temps et économique pour l'étude de ces cellules.
Introduction
Cellules souches et progénitrices neurales sont présentes tout au long du mammifère CNS 1, 2. Leur nature et les propriétés dans les zones germinales embryonnaires et adultes entourant les régions ventriculaires du cerveau et de la moelle épinière ont été largement documentés dans la dernière décennie 1-3. En grande partie, cela est dû au développement d'outils génétiques de plus en plus précises, telles que le système nerveux spécifique recombinaison Cre des allèles floxé ou lignée rétroviral traçage 4. Toutefois, une région-l'ancêtre géniteur de surface pial zone-a récemment été décrite en détail 5-7 et attend examen complet.
La surface piale du cerveau est définie comme l'interface entre la surface du cerveau et des méninges entourant 8. Au cours du développement, neuro et, plus tard, radiaux gliales pieds finaux attachent à cette surface 9,10. Certains des sapinsst neurones dans le cerveau humain et de nombreux mitoses neuronales sont observés dans cette région 11. Plus tard, au cours de la neurogenèse embryonnaire, les interneurones corticaux sont connus pour traverser la région pial, en plus de leurs routes migratoires dans la zone intermédiaire et la zone sous-ventriculaire 12-14. Pendant cette période, les cellules souches peuvent être cultivées à partir de cette zone et il semble être un site actif de la neuro-et gliogénèse 5. Dans le cerveau adulte, il a été rapporté que les interneurones peuvent être nés à partir de progéniteurs de surface piales après la provocation hypoxique 7. Toutefois, la contribution de cette région à son à genensis cours du développement embryonnaire et postnatal est restée obscure en partie en raison de la difficulté d'enquêter spécifiquement cette région 6. Dans le colliculus supérieur et dans le cortex cérébral, les interneurones superficielles (couche I ou dans le cortex) peuvent moduler la sortie du circuit de populations de neurones excitateurs sous-jacentes et de contribuer ainsi significantly à la fonction de ces structures. En particulier, la couche 1 interneurones sont en position privilégiée pour réguler la décharge des neurones à travers les couches supérieures du cortex cérébral en raison de leur connectivité étendue aux couches superficielles et profondes de colonnes corticales 15,16. D'une manière similaire, les interneurones horizontales reçoivent entrée excitatrice à partir de fibres corticales et de la rétine, projet sur une zone relativement large et sont spéculé à la médiation inhibition de populations neuronales répondant aux stimuli visuels à distance 17,18. En outre, leur morphologie est bien adapté à jouer un rôle potentiel dans l'activité d'onde motifs dans le système visuel en développement 19. Fait intéressant, le développement des interneurones et la maturation se produit dans une large mesure après la naissance. En outre, ce processus de maturation a été trouvé à être réglementées par l'activité neuronale et est donc un substrat de la plasticité du développement avec des conséquences pour la vie sur la fonction de circuit 20,21. Notamment, no promoteurs sont décrits qui peuvent cibler spécifiquement ces cellules transgénique. Progéniteurs de division peuvent être ciblées avec rétrovirus 7 mais la production de virus est longue et requiert des compétences pour obtenir les titres élevés nécessaires pour la transduction cellulaire.
L'électroporation a conduit à une renaissance de l'étude de développement neurologique, car elle permet l'interrogation génétique rapide et efficace des voies de signalisation dans progéniteurs neuronaux 4, 22, 23. L'électroporation implique l'injection d'ADN de plasmide, suivie par l'envoi d'impulsions électriques à l'extérieur de la tête, à conduire de manière unidirectionnelle de l'ADN dans les progéniteurs proliférant entourant les ventricules 4, 22, 23. L'électroporation semble exiger transit à travers les cellules de la phase M du cycle cellulaire pour l'expression de transgènes plasmidiques 24. Plus précisément, il a été trouvé que seulsles cellules passant à travers l'intérieur de la phase M 8 h d'électroporation de plasmides vont exprimer des transgènes malgré une livraison efficace de toutes les cellules à l'intérieur de ~ 160 um de la paroi ventriculaire 24. On suppose que cela est dû à la nécessité d'une rupture de l'enveloppe nucléaire en permettant un accès nucléaire des plasmides épisomiques, en tant que produits chimiques provoquant la perméabilisation nucléaire peuvent induire l'expression de plasmides dans des cellules post-mitotiques 25. Oeuvre à l'origine dans l'embryon 22, l'électroporation a été adapté pour une utilisation dans le cerveau post-natal beaucoup plus tard 26, 27. Récemment, nous avons adapté électroporation pour une utilisation dans la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales 6. En outre, en utilisant cette approche, nous avons montré qu'il existe apparemment deux lignées distinctes de progéniteurs dans cette région et astrocytaire interneuronale-6. Ce protocole détaille un moyen simple, rapide et puissant pour cibler ces cellules pour l'interrogatoirele développement de mécanismes de réglage de ces cellules.
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Protocol
Cette procédure est conforme aux exigences Cedars-Sinai IACUC. Les chercheurs doivent s'assurer de la conformité institutionnelle IACUC avant de procéder. Tous les outils et les réactifs doivent être stérilisés avant leur utilisation.
1. Préparation des outils, des solutions, et l'ADN Mélange
- Insérez borosilicate poli tubes capillaires en verre de 100 mm d'incendie dans un extracteur micropipette. Régler le chauffage pour permettre traction pondérée norme pour former la pointe de la pipette d'environ 17,5 mm. Couper des conseils avec des ciseaux chirurgicaux pointus à une distance d'environ 8-9 mm depuis le début de la pointe pour créer une ouverture à peu près 100 um de diamètre.
- Faire un stock de 1% p / v solution vert rapide par mélange d'eau sans nucléase filtré (en utilisant un filtre de seringue de 20 um) en vert à séchage rapide.
- Isoler l'ADN purifié exempt d'endotoxine plasmide qui est très concentré (c.> 3 pg / pl), dilué dans du Tris-EDTA (TE) tampon. Ajouter des quantités désirées du plasmideau mélange dilué dans du tampon TE et ajouter un rapport 1:10 de la solution vert rapide à 1% (fabrication d'un 0,1% p / v de concentration finale du vert rapide). Utilisez une concentration finale de 0,5-2,0 pg / pl du plasmide pour l'expression de transgènes robuste.
2. Anesthésie des animaux, Pipette Chargement en cours, et Pial Surface plasmide injection
- Induire une hypothermie anesthésie sur des souris postnatale 1-2 jours en les plaçant sur une boîte de Pétri qui est placé sur la glace pendant 5-8 min (temps dépend de l'âge de chiot / poids). Une fois l'hypothermie est confirmée par l'absence de mouvement de pincement pincer et / ou de la queue réflexe, les souris sont prêts à être injecté. Placez animaux de retour sur la glace si les réflexes de la douleur sont évidents. La procédure d'injection et l'électroporation prennent moins de 2-3 min au total si le temps le hypothermie, injection, et les procédures d'électroporation en conséquence pour maintenir l'anesthésie appropriée.
- Pendant l'anesthésie, à l'aide d'une pipette standard, soigneusement pipette quantité souhaitée de plasmid mélanger à injecter (0,5-2 pi) sur un morceau de pellicule de cire de paraffine pour référence. Ici, un volume total de 0,5 pi de plasmide mélange est injecté. Ensuite, en utilisant un micro injecteur, insérer soigneusement assemblé pipette capillaire en verre dans le mélange de plasmide contenant des tubes. Prendre des précautions supplémentaires pour éviter la pointe de la rupture en faisant en sorte qu'il ne touche pas les bords du tube. Aspirer la solution dans la pipette en composant lentement la molette de transfert. Une fois un volume suffisant a été chargée dans la pipette, composer avant jusqu'à ce que la pression revient à la position neutre de 0 hPa.
- Utilisation de 300-450 hPa Pression pour injection pour assurer une pression appropriée pour un remplissage de la surface / espace méningé pial, placer la pointe à proximité de l'injection de paraffine de référence de film pipetté (de 2,2) et utiliser la pédale de l'injecteur micro pour éjecter un le volume sur le film de cire de paraffine. Régler la pression en conséquence jusqu'à ce que le montant est égal à la éjecté referenc auparavant pipettevolume de courrier.
- Une fois la pointe a été équilibrée et l'anesthésie a été confirmée, les chiots sont prêts à être injecté.
- Le but de l'expérience est d'injecter le mélange de plasmide sous le crâne et la surface piale ci-dessus pour permettre l'électroporation de l'ADN vers le bas dans les progéniteurs de surface pie-mère (Figure 1A). Pour les injections de cortex, tenir le chiot vers le bas avec le pouce et l'index de la main moins dominante. Les hémisphères corticaux et d'autres structures superficielles telles que les colliculi supérieures sont visibles entre P0 et P2, ce qui permet un ciblage facile de ces structures (Figure 1B). Utilisation de la région dominante de la main et la cible souhaitée du cortex (c.-moteur, somatosensoriel, etc), insérer pipette passé la peau et le crâne en prenant soin d'éviter les artères cérébrales. Assurez-vous de prévenir toute nouvelle pénétration de la pointe au-delà du crâne (qui est indiqué par l'absence de toute résistance juste après avoir percé le crâne).
- Injecter plasmasolution id utilisant la pédale de l'injecteur micro et assurez-vous qu'il répartisse uniformément à travers le tissu (figure 2A).
Remarque: Il est très important de déterminer de façon empirique une approche qui maximise la livraison de plasmide tout en évitant hématome dû à la pression du fluide. Cela peut être fait en ajustant la durée de l'injection, l'angle, le volume, et le site cible précise pour éviter la perturbation vasculaire. - Soyez sûr d'essayer de garder la pointe de sécher entre les injections en plaçant la pointe dans des gouttelettes d'essais d'injections faites précédemment sur un papier ciré ou un film de paraffine plastique. Cela est nécessaire pour éviter l'accumulation de pointe solution d'ADN évaporé et cristallisé, ce qui peut entraîner l'obstruction de la pointe et les volumes de livraison incompatibles.
3. Électroporation
- Réglez le Electroporator à 135-150 V pour cinq impulsions, d'une durée de 50 ms, avec 950 ms intervalles entre chaque impulsion. Afin d'augmenter la conductance etéviter les brûlures de la peau, couvrir tweezertrodes de platine de 3 mm avec le gel de l'électroporation. Vérifiez réflexes de pieds-pincement et la queue à ce point pour assurer l'anesthésie. Si sensible, placer sur la glace pendant plusieurs minutes à anesthésier.
- Pour cortex (colliculus supérieur) et des injections, employer une électrode de 3 mm (figure 2B) pour améliorer la viabilité des petits (par comparaison avec la 7 - et 10 mm des électrodes, qui sont utilisées pour la zone ventriculaire électroporation). Placer la sonde de charge négative de l'électrode au-dessus de la zone d'injection et la sonde chargée positivement autour de la région de l'oeil contralatéral au-dessous de telle sorte que l'orientation de l'électrode se trouve à un angle de 45 à 60 ° par rapport à la ligne médiane (Figure 2C).
- Utilisez la pédale de l'électroporation pour déclencher courant et tenir tweezertrodes en place pour 3-5 impulsions, en fonction de l'âge de chiot et le poids, en ciblant efficacement l'ADN dans les cellules de surface piales sous-jacents lors de la comptabilisation de la courburedes hémisphères.
Remarque: le pôle négatif peut être balayé au-dessus de la zone d'injection entre les deux impulsions ou une électrode plus grande peut être utilisée pour augmenter la surface électroporation. - Immédiatement après l'électroporation, soigneusement nettoyer gel de chiots et de les placer sous une lampe chauffante pendant environ 5 min.
- Chiots aiguë perdre leur teinte rougeâtre-rose naturel dans les minutes après l'électroporation en raison de cyanose. Respecter les chiots pour la récupération de couleur naturelle et le début de l'action normale avant de les renvoyer dans leurs cages.
- Assurer la resocialisation avec la mère en observant si elle apporte des petits au nid et commence à les toiletter. Si elle devient agressif, assurez-vous que les petits n'ont pas les restes de gel et de les incuber avec un peu de litière pour transférer l'odeur des petits.
4. Modifications pour le ciblage colliculi supérieure
Ciblage:
- Inject le colliculus supérieur de la même façon que le cortex mais il faut noter que la région cible se trouve juste en arrière et latérale de lambda et à peu près à la ligne médiane (figures 3A et 3B). Avec des injections de succès, le mélange de plasmide remplit naturellement les contours du colliculus supérieur. Une fois les injections ont été faites avec succès, les animaux sont prêts pour l'électroporation.
Électroporation:
- D'une façon très similaire, pour des injections de colliculus supérieur, placer la sonde chargée négativement de l'électrode sur la zone injectée et la sonde chargée positivement autour de l'oeil, museau ou le menton, la conduite de l'ADN dans les régions superficielles du colliculus supérieur (figure 3C) . Dans ce cas, l'orientation de l'électrode se trouve à un angle de 25 à 40 ° par rapport à la ligne médiane.
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Representative Results
Piales surface résultats d'électroporation dans l'expression de l'ADN plasmidique dans des cellules de la plupart des progéniteurs-à ou près de la surface pial 6. Plus précisément, l'orientation des électrodes est critique en dictant la direction de déplacement du plasmide et l'expression subséquente. Ainsi, dans les deux configurations d'électrodes, le plasmide est dirigée à peu près dans un vecteur linéaire entre l'électrode négative et positive. Par conséquent, si le pôle négatif est placée sur le site d'injection et le pôle positif est ventral au pôle négatif, le plasmide sera forcé dans la surface piale. On suppose que l'orientation des électrodes pour produire des vecteurs de courant perpendiculaire à la surface serait plus idéal. Avec l'orientation appropriée de l'électrode et l'utilisation d'électrodes plus petites, plus focalement ciblées, la survie est de 100%. Cependant, dans certaines régions, comme le mésencéphale, le soin doit être pris pour éviter la livraison de courant qui peut arrêter le cœur, et ainsi cause viabilité réduite de souriceaux électroporation. Configurations tri-électrodes nouvellement décrites ou d'autres modifications peuvent aider à cibler les régions les plus difficiles en évitant les structures impliquées dans les fonctions vitales telles que la fréquence cardiaque 28. Il est important de regarder les chiots pour une bonne re-réchauffement de la température de leur corps naturel, qui se manifeste par le mouvement et la couleur. Quand ils reviennent à la couleur, ils peuvent être replacés dans le nid. Les mères de souche CD1 de souris que nous utilisons le plus souvent commencent immédiatement nourrir les chiots retournés. Cependant, d'autres souches peuvent être plus variable, devenir agressif ou de négligence. Transfert de l'odeur de la litière pour les chiots empêche généralement ces questions. Dans souches où la négligence ou d'agression sont graves, favoriser les petits de mères de la souche CD1 est la meilleure solution.
Les cellules marquées sont généralement observés plusieurs mois après l'électroporation 6. Cependant, comme avec n'importe quel elméthode de ectroporation, l'ADN plasmidique dilue avec la division cellulaire 29. Le même degré de dilution de plasmide observé dans les populations à vélo rapide (par exemple, les progéniteurs SVZ) n'est pas observée dans la population de surface pial, suggérant moins de prolifération 6. Cependant, on emploie actuellement des technologies de transposition décrites récemment (par exemple, piggyBac) pour atténuer complètement ce problème en permettant de dilution pour l'insertion de transposons stable dans l'ADN génomique 29, 30. Sinon, Cre recombinase plasmides exprimant pourraient être soumis à une électroporation dans des souris rapporteurs Cre de médiation traçage génétique stable de ces cellules 31.
Nos résultats préliminaires ont suggéré que la majorité des cellules sont mitotique lors de l'électroporation 6, en conformité avec les données décrites dans l'embryon CNS-spécifique, que l'électroporation des étiquettes d'un ensemble de cellules proliférantes entre S et M phases du cycle cellulaire 24. Cependant, une enquête plus approfondie est nécessaire pour définir l'identité et les lignées de cellules par électroporation à la surface pial ainsi que de déterminer définitivement leur caractère prolifératif car il ya beaucoup de produits chimiques par exemple parasite et l'étiquetage génétique des cellules dans la littérature 4. En outre, nous avons constaté site d'injection locale hématome, surtout dans le cortex lorsque les soins ne sont pas prises pour fournir de petits volumes ou lorsque des précautions appropriées pour éviter la perturbation vasculaire ne sont pas respectées.
Notre caractérisation précédente indique au moins deux lignées de cellules précurseurs - astrocytaires et progéniteurs des interneurones 6. Les astrocytes ont tendance à rester à la surface pial (figure 4A) et chaque cellule forme un nuage dense de astrocytaire périphérique traite 6. Interneurones restent la plupart du temps à la surface pial mais certaines cellules peuvent être trouvés dans presque tous les couches corticales ou profondes dans le colliculus supérieur 6. Thneurones ese présentent de nombreuses dendrites, qui peuvent être aussi longtemps que plusieurs centaines de microns (Figure 4B). Nous n'avons pas observé de preuves pour l'étiquetage des oligodendrocytes ou neurones excitateurs dans le cortex 6. La majorité des cellules par électroporation semble avoir passé à travers la mitose à proximité temporelle étroite avec le Parlement européen procédure cortex 6. Plus précisément, une électroporation des cellules EGFP + sont double-étiquetés avec la réplication de l'ADN marqueur BrdU quand a battu 2 heures avant avec cet analogue de la thymidine (figures 4C-4C 3). Cependant, il est important de noter que nous avons vu des preuves de marquage cellulaire pericytic et / ou de l'endothélium dans ces régions 6.
Figure 1. Électroporation dela surface de la pie-mère du nouveau-né (A) la section coronale schématique montrant la zone du cortex qui est ciblé lors de l'injection. Les cellules sont affichés le long des couches du cortex sont des exemples de populations mixtes de cellules réelles observées électroporation, y compris des progéniteurs et des précurseurs astrocystic interneuronales. (B) Image d'un jour postnatal 2 souris avant injection, décrivant les régions d'intérêt de surface pial, le cortex (CTX) et colliculus supérieur (SC).
Figure 2. D'électroporation postnatale du cortex superficiel (A) d'injection de l'exemple de la corticale dorsale après le ciblage du point médian entre l'oeil et lambda, avant l'électroporation. (B) Selon l'âge de chiots et de la région d'intérêt, la flexibilité des tailles variées de tweezertrodes de platine peut être utilisé pour l'électroporation (3 mm, 7 mm et 9 mm). Électrodes 3 mm de diamètre sont généralement utilisés pour l'électroporation de surface pial (voir le texte pour discussion). (C) L'électroporation du cortex. Notez le placement des tweezertrodes, en plaçant la sonde positive au-dessous de l'oeil, permettre au courant d'être entraîné vers le côté ventral.
Figure 3. Colliculus supérieur ciblé électroporation postnatal (A) Injection d'un chiot âgé de 2 jours dans le colliculus supérieur, montrant la retenue manuel du chiot anesthésié et le placement de la pointe de la pipette juste au-delà du crâne. (B) injection montrant le plasma dispersésolution d'ADN id dans la région du colliculus supérieur (SC). (C) Placement des tweezertrodes pour l'électroporation de la SC, l'ADN vers la surface dorsale de la SC sur le site d'injection de conduite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Colliculus supérieur ciblé électroporation postnatal (A) En face, projection maximale de l'image confocale piles de cortex dorsolatéral ~ 2 semaines après l'électroporation de contrôle fluorescentes plasmides rapporteurs exprimant membrane marqués Clover 32 (vert) et TagBFP2 33 protéine nucléaire (fluorescence bleue pseudocolored rouge). (B) Coupe coronale d'un interneurones corticaux environ deux mois après l'électroporation, l'affichage de nombreuses dendrites. barres d'échelle mesurent 100 um (A, C) et de 40 um dans (B). (CC 3) Coupe sagittale de la surface pial du colliculus supérieur démontrant que la majorité des cellules EGFP + sont marqués par une impulsion unique de BrdU 2 h avant l'électroporation.
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Discussion
L'aspect le plus critique pour l'électroporation réussie des progéniteurs de surface piales sont: 1) le ciblage du plasmide mélange à la surface pial; 2) en évitant la génération d'hématomes au site d'injection; et 3) en évitant la mortalité associées à l'électroporation mésencéphale.
Cibler de manière appropriée la surface pial est réalisé par perforation mesurée et soignée du crâne pour éviter la pénétration de la surface pial. Incorrecte de ciblage pour la peau sus-jacente ou le ventricule sous-jacent ou le parenchyme cérébral seront attestés par: 1) le déplacement du colorant vert rapide avec la peau sur les frottant doucement le tissu (c'est à dire le vert rapide est localisée au-dessus du crâne dans la peau et du tissu conjonctif) ou 2) par la disparition du colorant vert rapide dans le cerveau, ce qui indique que le mélange de plasmide est passé dans le ventricule et / ou parenchyme. Pial bonne surface localisation du mélange de plasmide sera attestée par l'accumulation de colorant sous le crâne eà ne peuvent pas être dérangé par le déplacement doux de la peau. Néanmoins, la pratique et la dextérité sont nécessaires pour ce ciblage réussi. formation d'hématome est probablement causée par une perturbation de la vascularisation par injection de plasmide. Les caillots de sang seront observés sur le site de l'injection dans les jours et les semaines suivantes électroporation lorsque le tissu est prélevé. Pour éviter les hématomes, ajuster la longueur de l'impulsion de l'injection de fluide et / ou prendre note de la tendance générale de la vascularisation cérébrale d'éviter toute perturbation de la cuve. En général, le colliculus supérieur est moins sensible à la coagulation. Décès dus au courant électrique délivré par les tweezertrodes est facilement évité en utilisant 3 mm tweezertrodes de livrer plus focalement courant et en dirigeant les électrodes loin du mésencéphale ventral comme l'a démontré (figures 2C et 3C).
Un inconvénient principal de cette technique est que la zone ciblée est limitée par la taille de la propagation de la solution de plasmideet la taille des électrodes. A la livraison de 0,5 ul de plasmide génère une superficie d'environ 3 mm et, par conséquent, est bien adaptée à la taille de l'électrode de 3 mm. Quelle que soit la mesure est plus petite (zone solution de propagation ou électrode zone de palette) dicteront la taille finale du patch de cellules par électroporation. Par ailleurs, seul un sous-ensemble de cellules sont marqués en raison de la nécessité d'une mitose pour l'expression du transgène 24. Cependant, ce qui est avantageux pour l'étude des souches ou populations de cellules progénitrices et la différenciation cellulaire.
Pial surface électroporation est un procédé permettant la manipulation génétique des progéniteurs robuste pie-mère de surface et de leur descendance. Cette technique est rapide, simple et efficace, offrant un moyen plus précis et plus faciles de ciblage de ces cellules par rapport à la seule autre approche de la transduction rétrovirale comparable. Titre élevé production virale prend compétences, des semaines de temps, et présente des risques de sécurité - en particulier dans le cas de pseudot pantroperétrovirus yped. En outre, l'électroporation est un peu plus souple, car il ne nécessite pas de clonage et de production virale. N'importe quel vecteur d'expression eucaryote peut être utilisé, y compris des plasmides viraux. En outre, des plasmides maxiprep-ed peuvent être mélangés et combinés pour faciliter la co-électroporation. Typiquement, il existe un ~ 90-95% de co-expression de deux plasmides donnés avec des promoteurs similaires. Dans convient de noter que, même si nous avons seulement utilisé cette technique de ciblage dans le cortex et colliculus supérieur, la méthode doit être prête à la plupart des régions pie-mère ou superficielles de la CNS condition qu'il y ait de l'espace pour l'accumulation locale de l'ADN plasmidique avant la livraison de courant .
Électroporation par nature tend à favoriser la transduction des cellules en mitose 24. Ainsi, l'électroporation d'animaux adultes devrait être possible mais entraînerait probablement beaucoup moins de cellules exprimant des transgènes en raison de réduction de l'activité proliférative avec le vieillissement. Cependant, comme l'a récemment précisé par Jaubodinet ses collaborateurs, le ciblage des cellules post-mitotiques dans cette région pourrait être possible en utilisant des trans-cyclohexane-1, 2 - diol, ce qui permet un accès de plasmide nucléaire par permeablilizing l'enveloppe nucléaire 25. En outre, l'électroporation est très compatible avec les technologies Cre ou d'autres types de souris modifiées 31. Enfin, la technologie de transposon permettra de transgenèse somatique stable de cette population 29, 30. Au total, la pie-mère électroporation de surface représente un outil exceptionnel et flexible pour la manipulation génétique de ces domaines progénitrices uniques.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la recherche sur le cancer Cancer Institute Award Forum Samuel Oschin complète ainsi que des fonds de l'Institut de médecine régénérative de Cedars-Sinai, et la famille Guérin. Le projet a été financé en décrit la forme d'une base de CTSI Bon financé par le National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, et est maintenant au centre national pour l'avancement des sciences translationnelle, Grant UL1TR000124. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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