Summary

Неонатальный пиальных поверхности Электропорацию

Published: May 07, 2014
doi:

Summary

Пиальных поверхности зона является уникальной предшественников в ЦНС, что уделяется все большее внимание. При этом мы подробно способ быстрого генетической манипуляции этой зоны предшественников с использованием модифицированного метода электропорации. Эта процедура может быть использована для клеточных и молекулярных исследований клеточных линий и сигнальных путей, участвующих в дифференцировке клеток и выяснить судьбу и свойства дочерние клетки.

Abstract

За последние несколько лет пиальных поверхность была определена в качестве зародышевого нише значение во время эмбрионального, перинатальной и взрослых нейро-и глиогенеза, в том числе после травмы. Тем не менее, методы генетически допрашивать этих групп населения предшественников и отслеживания их клоны были ограничены из-за отсутствия специфичности или времени производство вирусов. Таким образом, прогресс в этой области был довольно медленным только с горсткой исследований этого месте. Электропорация была использована уже более десяти лет, чтобы изучить нервные свойства стволовых клеток в эмбрион, а в последнее время в послеродовом мозга. Здесь мы опишем эффективную, быструю и простую технику для генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников на основе адаптированной для электропорации подхода. Пиальных поверхность электропорации позволяет легкому генетической маркировки и манипуляции этих предшественников, тем самым представляя экономия времени и экономичный подход к изучению этих клеток.

Introduction

Нервные стволовые и клетки-предшественники присутствуют в ЦНС млекопитающих 1, 2. Их природа и свойства в эмбриональных и взрослых зародышевых зонах, окружающих желудочковой области мозга и спинного мозга были хорошо документированы в последнее десятилетие 1-3. В значительной степени это было связано с развитием более точных генетических инструментов, таких как нервная система конкретного Cre рекомбинации floxed аллелей или ретровирусов линии трассировки 4. Тем не менее, один регион-прародитель относящийся к мягкой мозговой оболочке поверхность предшественников зона-недавно был описан только в деталях 5-7 и ждет комплексное обследование.

Пиальных поверхность мозга определяется как интерфейс между поверхностью мозга и окружающих мозговых оболочек 8. Во время развития нейроэпителиальные, а позднее, радиальные глиальные конечные футов приложить к этой поверхности 9,10. Некоторые из пихтыул нейроны в мозге человека и многих нейронных митозов наблюдаются в этом регионе 11. Позже, во время эмбрионального нейрогенеза, корковых интернейронов, как известно, пройти пиальных регион, в дополнение к их миграционных путей в промежуточной зоне и субвентрикулярной зоне 12-14. В течение этого периода, стволовые клетки можно культивировать из этой зоны, и это, кажется, активный центр нейро-и глиогенеза 5. Во взрослом мозге, было сообщено, что интернейроны может родиться от пиальных поверхностных предшественников следующее гипоксического вызов 7. Тем не менее, вклад этой области, чтобы его в genensis во время эмбрионального и постнатального развития остается неясным, в частности в связи с трудностью специально расследование этого региона 6. В верхний бугорок и в коре головного мозга, поверхностные (или слой I в коре) интернейроны может модулировать схему вывода основных возбуждающих популяций нейронов и тем самым способствовать significantly к функции этих структур. В частности, слой 1 интернейроны находятся в позиции, чтобы регулировать возбуждения нейронов на протяжении верхних слоях коры головного мозга с учетом их Широкие возможности подключения к поверхностных и глубоких слоев коры колонн 15,16. Аналогичным образом, горизонтальные интернейронов возбуждающих получать ввод от коры и сетчатки волокон, проекта в относительно широком области и предположили, посредником ингибирование нейрональных популяций, ответивших на удаленном зрительных стимулов 17,18. Кроме того, их морфология хорошо подходит играть потенциальную роль в узорной волновой активности в развивающихся зрительной системы 19. Интересно, что развитие интернейронов и созревание происходит в значительной степени после рождения. Кроме того, этот процесс созревания было установлено, регулируется нейронной активности и, следовательно, субстрат пластичности развития с пожизненных последствий для функции схемы 20,21. Примечательно, что пO промоторы описаны который может специфически нацелены эти клетки трансгенно. Разделительные предшественники могут быть направлены с ретровируса 7, но производство вируса занимает много времени и требует навыков, получая высокие титры клеток, необходимых для трансдукции.

Электропорацию привело к возрождению в изучении нервной системы, так как позволяет для быстрого и эффективного генетического допроса сигнальных путей в нейронных клеток-предшественников 4, 22, 23. Электропорации включает инъекции плазмидной ДНК, после чего доставки электрических импульсов к внешней части головы, в одном направлении приведения в действие ДНК в пролиферирующих клеток-предшественников, окружающих желудочки 4, 22, 23. Электропорации, как представляется, требуют транзит через клеток М-фазе клеточного цикла для экспрессии трансгенов плазмидных 24. В частности, было обнаружено, что толькоклетки, проходящие через M фазы в 8 часов электропорации плазмид выразит трансгены, несмотря на их эффективной доставки всех клеток в ~ 160 мкм желудочковой стенки 24. Он предположил, что это связано с необходимостью срыва ядерной оболочки в разрешении ядерной доступа из эписомные плазмид, как химические вещества, вызывающие ядерной пермеабилизации может индуцировать экспрессию плазмид в пост митотических клеток 25. Первоначально использовали в эмбрионе 22, электропорацию был адаптирован для использования в послеродовом мозга гораздо позже 26, 27. В последнее время мы приспособились электропорации для использования в генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников 6. Кроме того, с помощью этого подхода мы показали, что там, по-видимому два различных происхождений предшественников в этой области-межнейронной и астроцитов 6. Этот протокол детали простой, быстрый, и мощный способ предназначаться эти клетки для допросаразвития механизмов, регулирующих этих клеток.

Protocol

Эта процедура в соответствии с требованиями Cedars-Sinai IACUC. Следователи должны обеспечить институциональную соответствие IACUC до судебного разбирательства. Все инструменты и реагенты должны быть стерилизованы перед использованием. 1. Подготовка Tools, решения, и ДНК смесь <…

Representative Results

Пиальных поверхностные электропорации приводит к экспрессии ДНК плазмиды в клетки-предшественники в основном-на или вблизи пиальных поверхности 6. Более конкретно, ориентация электродов имеет решающее значение в диктовать направление движения плазмиды и последующей экспресси…

Discussion

Самый важный аспект для успешного электропорации пиальных поверхностных предшественников являются: 1) адресности плазмиды смеси, чтобы пиальных поверхности; 2) предотвращение генерацию гематом в месте инъекции; и 3) избежать смертности, связанных с среднего мозга электропорации.

<p cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность поддержки со стороны Самуэль Ошина всеобъемлющем институт рака онкологического научного форума премии, а также средства от регенеративной медицины Института Cedars-Sinai, и Герена семьи. Проект описывается была поддержана в виде CTSI Основной ваучером, финансируемого Национальным центром исследований ресурсов, Грант UL1RR033176, и в настоящее время в Национальном центре для продвижения поступательного науки, Грант UL1TR000124. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Materials

Item Name Vendor Catalog Number
Fire Polished Borosilicate Tubing World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Micropipette Puller Sutter Instruments Company P-30
Fast Green FCF Sigma Aldrich, Inc. F7528
XenoWorks Digital Microinjector Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0052
3mm Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0487
SignaGel Electrode Gel Cardinal Health 70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 Integrated DNA Technologies, Inc. 11-01-02-05
Infrared Heat Lamp VWR 36547-009
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09

References

  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  4. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  5. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  6. Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
  7. Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
  8. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
  9. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
  10. Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
  11. Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
  12. Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
  13. Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
  14. Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
  15. Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
  16. Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
  17. Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
  18. Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
  19. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  20. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
  21. Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
  22. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  23. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  24. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
  25. De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
  26. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
  27. Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
  28. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
  29. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
  32. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  33. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).

Play Video

Cite This Article
Levy, R., Molina, J., Danielpour, M., Breunig, J. J. Neonatal Pial Surface Electroporation. J. Vis. Exp. (87), e51319, doi:10.3791/51319 (2014).

View Video