Аскорбат играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только вышли на свет в последние годы. Здесь мы опишем средне-пропускную способность, конкретное и недорогой микропланшетного анализ для определения как внутри-и внеклеточной аскорбиновой кислоты в клеточной культуре.
Витамин С (аскорбиновая кислота) играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только приходят на свет в последние годы. Например, в головном мозге, аскорбиновая кислота действует в нейропротективного и нейромодуляторного образом, что включает в себя аскорбат велосипеде между нейронами и вицинальных астроцитов – отношения, которые, как представляется, решающее значение для мозга аскорбат гомеостаза. Кроме того, новые данные наводит на мысль, что аскорбиновая кислота имеет значительно расширенную роль в регуляции клеточного и системного метаболизма железа, чем в классическом признается. Растущее признание интегральной роли аскорбиновой кислоты в нормальной и разрегулированной клеточном и организменном физиологии требует ряд средне-пропускной и высокочувствительных аналитических методов, которые могут быть выполнены без необходимости сильно дорогой специального оборудования. Здесь мы предлагаем четкие инструкции для средней пропускной, конкретные и относительно недорогой микропланшетного анализ для определения бой внутри-и внеклеточной аскорбиновая кислота в клеточной культуре.
Открытие химической природы аскорбиновой кислоты (витамин С), и его идентификации в качестве долгожданного "антицинготными фактора», Альберт Сент-Дьерди и другие в статьях, опубликованных с 1928 по 1934 1 были знаковые события в истории биохимии. В самом деле, эти открытия способствовали Сент-Дьерди присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1937 году. Постоянно расширяющийся набор ролей для аскорбиновой кислоты в животных и физиологии растений, а также на здоровье человека, по-прежнему являются субъекты активная научная Расследование и споры.
L-аскорбат является обильное физиологический восстановитель и кофактор фермента в системах млекопитающих, и вносит свой вклад в многочисленных хорошо определенных ферментативных реакций с участием коллагена гидроксилирование, карнитин и норадреналина биосинтез, метаболизм и тирозина пептидного гормона, амидирование 2. Интересно, монтаж evideNCE предполагает, что аскорбат играет важную роль в стимулировании других железа зависит от диоксигеназ, такие как пролил и аспарагинила гидроксилазы, вовлеченных в гидроксилирование и ориентации из гипоксии-индуцируемых факторов (ОПО) 1α 2α и 3. В недавнем докладе о том, что аскорбиновая кислота играет важную роль в Т-клеточной созревания до влияние хроматина деметилирования через его деятельности в стимулировании ядерных гидроксилаз, Jumonji C (JmjC) белки домена; последний из которых, кажется, требуют аскорбат для полноценной деятельности 4. Действительно, стимуляция таких ферментов по аскорбат-видимому, происходит такой же механизм для стимуляции аскорбата из HIF и коллагеновых гидроксилазы. Среди других классических эффектов, аскорбат вносит значительный вклад в клеточной антиоксидантной качестве водорастворимого цепи разорвать акцептора радикалов 5 и утилизации плазматической мембраны α-токоферол (витамин Е) через снижению α-tocopheroxyl радикал 6, шHICH играет важную роль в защите от перекисного окисления липидов мембраны 7. Важно отметить, что хотя большинство млекопитающих способны процессов нового печени синтеза аскорбиновой кислоты из D-глюкозы, высшие приматы, морские свинки и некоторые летучие мыши зависит от пищевых источников витамина 8. Это связано с инактивации гена Gulo, то ортологи которых в незатронутых млекопитающих кодирует фермент, γ-лактон gulono-оксидазы 9-13. Этот фермент необходим для окончательного реакции в аскорбат биосинтеза глюкозы из 13.
После транспортера-опосредованной всасывания из просвета кишечника в организме человека, аскорбиновая кислота распространяется по всему телу по кровеносной системе. Витамин обычно можно найти в восстановленной форме в миллимолярных концентрации внутри клеток (с исключением эритроцитов, в которых концентрации обычно похож на преобладающей концентрации в плазме), и в микромолярном концentrations (например 50-200 мкМ) в большинстве внеклеточных жидкостях 14,15.
В физиологических условиях, аскорбиновая кислота обычно претерпевает обратимое одноэлектронную окисление в аскорбил свободных радикалов (AFR, также известный как monodehydroascorbate или semidehydroascorbate). В то время как AFR является относительно стабильный радикал 16, в отсутствие его быстрого одноэлектронного снижению ферментативной обратно в аскорбат, два AFRs может дополнительно dismutate одному аскорбата и один дегидроаскорбат (DHA) 9,13,17. В внутрь клетки, окисление продукта двухэлектронного аскорбата, DHA, могут быть быстро снижается обратно в аскорбат на глутатион-и NAD (P) H-зависимой ферментной и не ферментативных реакций 13.
В то время как в классическом принято считать, что только значительную роль аскорбиновой кислоты в метаболизме железа является стимулирование диетическое всасывание не тема железа 18, мы и другие предоставили доказательств сtrongly предполагая, что аскорбат играет значительно более значительную роль в метаболизме этого металла. Во-первых, аскорбат, который высвобождается аскорбата-изобилует клеток по-видимому, играют важную роль в модуляции поглощения не-трансферрином железа связаны клетками 19,20, и совсем недавно данные показывают, что аскорбиновая кислота также модулирует поглощение трансферрином железа неизбежно 21 клетками, последний из которых соответствует основным физиологическим захватывающие железо маршрута 22.
Аскорбат необходим для нормального центральной нервной системной функции у млекопитающих 23,24. Вместе с коры надпочечников, гипофиза, вилочковой, сетчатки и желтого тела, мозг содержит высокие концентрации аскорбата по отношению к другим тканям организма 23,25-27. Кроме того, воздействие как астроциты 28,29 и нейроноподобных элементов 30 на глутамат, как известно, вызывают высвобождение аскорбата во внеклеточное пространство, где ascorbatе, как полагают, чтобы помочь защитить нейроны против индуцированной глутаматом нейронов дисфункции 31. В то время как точный механизм глутамат-индуцированный аскорбат выхода из астроцитов неизвестно, недавно мы представили доказательства, указывающий участие клетки опухоль, вызванная захвата глутамата на астроцитов глутамата и аспартата транспортера (GLAST, также известный возбуждающих аминокислот транспортер изоформы 1 [EAAT1 ] у людей) и, как следствие активация объема чувствительных осмолита и анионных каналов (VSOACs), которые проницаемы для малых органических анионов, таких как аскорбиновая кислота 32. Молекулярные тождества плазменных мембранных каналов, участвующих в образовании VSOAC остаются должны быть определены 33,34.
Хотя многие тесты были разработаны для определения аскорбиновой кислоты в биологических образцах, которые включают в спектрофотометрических, флуорометрические и хроматографические анализы 35,36, есть много изменчивость в специфичности, чувствительности, interferencэ на химических загрязнителей, эффективного линейного диапазона и стабильности аналита конечной точки. Кроме того, другие важные факторы, влияющие на выбор анализа являются быстрота, простота в использовании и доступ к относительно специализированного оборудования, таких как жидкостной хроматографии высокоэффективной (ВЭЖХ) аппарата.
Здесь мы приводим простой и очень специфический колориметрический микропланшет-анализ для определения внутриклеточного аскорбата в культивируемых клетках, а также в качестве отдельного анализа для определения аскорбат-отток из культивируемых клеток. Последний анализ направлен на обойти проблему недооценки аскорбат освобождение от клеток из-за быстрого обратного захвата высвобожденного аскорбата по транспортеров аскорбата натрия (в зависимости от SVCTs). Хотя оба этих метода появились в некоторых из наших предыдущих публикаций 19,20,32,37,38, эта рукопись обеспечивает явное набор инструкций и руководящих принципов для их эффективного выполнения.
В этой статье мы представляем два быстрых, конкретных и относительно чувствительных колориметрических микропланшета тесты для определения аскорбиновой кислоты, полученной из внутри-и внеклеточных отсеков в культивируемых клетках. Анализы могут комплектоваться доступа к стандартны…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны доктору Стивену Робинсон и г-жи Хании Czerwinska (Monash University) за щедрую поставку астроцитов культур.
Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
General-purpose buffers | |||
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
General chemicals | |||
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
Glacial acetic acid | |||
0.2 M citric acid | |||
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
30 mM ferene-S | |||
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
AO (120 U/ml) | |||
2.4 mM ferene-S | |||
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |