Un ensayo rápido y específico de microplacas para la Determinación de ascorbato intra y extracelular en células cultivadas
Summary
El ascorbato desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Aquí se describe un rendimiento medio, ensayo específico y de bajo costo de microplacas para la determinación tanto de ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.
Abstract
La vitamina C (ascorbato) desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Por ejemplo, dentro del cerebro, ascorbato actúa de una manera neuroprotector y neuromodulador que implica el ciclismo ascorbato entre las neuronas y astrocitos vecinales – una relación que parece ser crucial para la homeostasis ascorbato cerebro. Además, la evidencia emergente sugiere fuertemente que el ascorbato tiene un papel ampliado en gran medida en la regulación del metabolismo del hierro celular y sistémica que se reconoce clásicamente. El creciente reconocimiento del papel integral de ascorbato en la fisiología celular y del organismo normal y desregulado exige un rango de mediano rendimiento y alta sensibilidad técnicas analíticas que se pueden ejecutar sin la necesidad de equipo especializado altamente costoso. Aquí proporcionamos instrucciones explícitas para un medio de rendimiento, ensayo específico y relativamente barato microplaca para la determinación de la boª ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.
Introduction
El descubrimiento de la naturaleza química del ácido ascórbico (vitamina C), y su identificación como el largamente buscado "factor anti-escorbuto", de Albert Szent-Györgyi y otros en los artículos publicados desde 1928 hasta 1934 1 han sido hitos importantes en la historia de la bioquímica. De hecho, estos descubrimientos han contribuido a Szent-Györgyi siendo galardonado con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1937. La suite en constante expansión de los roles de ascorbato en la fisiología animal y vegetal, así como la salud humana, siguen siendo los temas de activo científica investigación y controversia.
L-ascorbato es una abundante reductor fisiológica y la enzima cofactor en sistemas de mamíferos, y contribuye a numerosas reacciones enzimáticas bien definidas que implican la hidroxilación del colágeno, carnitina y la biosíntesis de norepinefrina, metabolismo de la tirosina y de la hormona péptido amidación 2. Curiosamente, evide montajena vez que sugiere que el ascorbato juega un papel en la estimulación de otras dioxigenasas dependientes de hierro, tales como las prolil hidroxilasas y asparaginilo implicados en la hidroxilación y la orientación de los factores inducibles por hipoxia (HIF) 1α y 2α 3. Un informe reciente sugiere que el ascorbato juega un papel en la maduración de células T a través de desmetilación que afecta a la cromatina a través de su actividad en la estimulación de las hidroxilasas nucleares, Jumonji C (JmjC) dominio de las proteínas; el último de los cuales parecen requerir ascorbato para la plena actividad 4. De hecho, la estimulación de tales enzimas por el ascorbato parece ocurrir por un mecanismo similar a la estimulación por el ascorbato de las hidroxilasas de HIF y de colágeno. Entre otros efectos clásicos, ascorbato contribuye significativamente a la antioxidación celular como una cadena-romper eliminador de radicales soluble en agua 5 y para el reciclaje de membrana plasmática α-tocoferol (vitamina E) a través de la reducción de la α-tocoferoxilo radical 6, Which es importante en la protección contra la peroxidación lipídica de la membrana 7. Es importante destacar que, aunque la mayoría de los mamíferos son capaces de la síntesis hepática de novo de ascorbato a partir de D-glucosa, primates superiores, conejillos de indias y algunos murciélagos dependen de fuentes dietéticas de la vitamina 8. Esto es debido a la inactivación del gen GULO, los ortólogos de mamíferos que en no afectados codifican la enzima, γ-gulono-lactona oxidasa 9-13. Esta enzima es necesaria para la reacción final en la biosíntesis de ascorbato a partir de glucosa 13.
Después de la absorción mediada por transportador desde la luz intestinal en los seres humanos, ascorbato se distribuye por todo el cuerpo por el sistema circulatorio. La vitamina se encuentra típicamente en su forma reducida en concentraciones milimolares intracelularmente (con la notable excepción de los eritrocitos en la que las concentraciones son típicamente similar a la concentración de plasma que prevalece), y en HCl conc micromolarentrations (por ejemplo 50-200 micras) en la mayoría de los fluidos extracelulares 14,15.
En condiciones fisiológicas, ascorbato típicamente se somete a una oxidación de un electrón reversibles a la libre radical ascorbilo (AFR; también conocido como monodehydroascorbate o semidehydroascorbate). Mientras que la AFR es un radical relativamente estable 16, en ausencia de su rápida reducción enzimática de un electrón de nuevo a ascorbato, dos AFR pueden más dismutan a uno ascorbato y uno deshidroascorbato (DHA) 9,13,17. En el interior de la célula, el producto de oxidación de dos electrones de ascorbato, el DHA, se puede reducir rápidamente de nuevo a ascorbato por el glutatión-y NAD (P) H-enzimática dependiente y reacciones no enzimáticas 13.
Si bien se acepta que clásicamente único papel importante de ascorbato en el metabolismo del hierro es el de estimular la absorción dietética de hierro no hemo 18, nosotros y otros han aportado pruebas de strongly lo que sugiere que el ascorbato juega un papel ampliado en gran medida en el metabolismo de este metal. En primer lugar, ascorbato que se libera por las células-ascorbato repleta parece jugar un papel importante en la modulación de la absorción de hierro no unido a transferrina por las células 19,20, y la evidencia reciente indica que el ascorbato también modula la absorción de hierro unido a transferrina por las células 21, el último de los cuales corresponde a una ruta principal de hierro-captación fisiológica 22.
Ascorbato es esencial para la función normal del sistema nervioso central de los mamíferos 23,24. Junto con la corteza suprarrenal, glándula pituitaria, el timo, la retina y el cuerpo lúteo, el cerebro contiene altas concentraciones de ascorbato en relación con otros tejidos del cuerpo 23,25-27. Además, la exposición de ambos astrocitos 28,29 y neuronas como las células 30 al glutamato se sabe para accionar la liberación de ascorbato en el espacio extracelular, donde el ascorbate se cree que ayuda a proteger a las neuronas contra el glutamato inducida por la disfunción neuronal 31. Aunque el mecanismo exacto de glutamato inducida por la liberación de ascorbato de astrocitos se desconoce, se ha proporcionado recientemente pruebas que indican la implicación de células inflamación causada por la captación de glutamato por el glutamato de los astrocitos y transportador de aspartato (GLAST, también conocida aminoácido excitador transportador isoforma 1 [EAAT1 ] en los seres humanos) y la consiguiente activación de osmolíticas y aniones canales sensibles al volumen (VSOACs) que son permeables a las pequeñas aniones orgánicos tales como ascorbato 32. Las identidades moleculares de los conductos de membrana de plasma implicados en la formación VSOAC quedan aún por identificar 33,34.
Aunque muchos ensayos se han desarrollado para la determinación de ascorbato en muestras biológicas, que incluyen ensayos espectrofotométricos, fluorométricos y cromatográficas 35,36, existe mucha variabilidad en la especificidad, la sensibilidad, interference por contaminantes químicos, rango lineal efectiva y la estabilidad del analito punto final. Además, otros factores importantes que influyen en la elección de ensayo son la rapidez, la facilidad de uso y acceso a equipos relativamente especializada, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) aparato.
Aquí presentamos un ensayo simple y altamente específico de microplacas colorimétrico para la determinación de ascorbato intracelular en células cultivadas, así como un ensayo separado para la determinación de ascorbato-flujo de salida a partir de células cultivadas. El último ensayo tiene como objetivo evitar el problema de la subestimación de la liberación de ascorbato a partir de células debido a la rápida re-absorción de ascorbato liberado por los transportadores de ascorbato de sodio-dependiente (SVCTs). Aunque ambos métodos han aparecido en algunas de nuestras publicaciones anteriores 19,20,32,37,38, este manuscrito proporciona un conjunto explícito de instrucciones y directrices para su ejecución efectiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se presentan dos ensayos de microplaca colorimétricos rápidos, concretos y relativamente sensibles para la determinación de ascorbato derivado de los compartimentos intra y extracelulares en las células cultivadas. Los ensayos pueden ser completados con el acceso a equipos de laboratorio estándar y los reactivos. El reactivo sólo moderadamente costosa requerida para el ensayo es AO, que es esencial, ya que imparte un alto grado de especificidad analito hacia L-ascorbato.</sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos al Dr Stephen Robinson y la Sra. Hania Czerwinska (Universidad de Monash) por la generosa oferta de cultivos de astrocitos.
Materials
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
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