Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Protein-protein interaktioner visualiseret ved bimolekylær Fluorescens komplementering i tobaksprotoplaster og blade

Published: March 9, 2014 doi: 10.3791/51327
Automatic Translation
1, 1
1Department Biologie I, Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität, München

Summary

Dannelse af protein-komplekser in vivo kan visualiseres ved bimolekylær fluorescens komplementering. Interaktionspartnere fusioneres til komplementære dele af fluorescerende tags og udtrykt transient i tobaksblade, hvilket resulterer i et rekonstitueret fluorescenssignal ved tæt nærhed af de to proteiner.

Abstract

Mange proteiner interagerer transient med andre proteiner eller er integreret i multi-protein-komplekser til at udføre deres biologiske funktion. Bimolekylær fluorescens komplementering (BiFC) er en in vivo metode til at overvåge sådanne interaktioner i planteceller. I de præsenterede protokol de undersøgte kandidat proteiner fusioneret til komplementære halvdele af fluorescerende proteiner, og de respektive konstruktioner introduceres i planteceller via Agrobacterium-medieret transformation. Efterfølgende proteinerne udtrykt transient i tobaksblade og de gendannede fluorescerende signaler kan detekteres med et konfokalt laserscanningmikroskop i intakte celler. Dette giver ikke kun visualisering af samspillet selv, men også den subcellulære lokalisering af protein-komplekser kan bestemmes. Til dette formål kan markørgener indeholder en fluorescerende tag blive coudtrykt sammen med BiFC konstruktioner, og dermed visualisere cellulære strukturer såsom than endoplasmatiske reticulum, mitokondrier, Golgi-apparatet eller plasmamembranen. Kan overvåges fluorescerende signal enten direkte i epidermale bladceller eller i enkelte protoplaster, som let kan isoleres fra de transformerede tobaksblade. BiFC er velegnet til at studere protein-protein interaktioner i deres naturlige omgivelser i den levende celle. Det skal dog tages i betragtning, at udtrykket skal være drevet af stærke promotorer, og at samspillet partnerne er ændret som følge af fusion af de relativt store fluorescens tags, som kan interferere med interaktionen mekanisme. , BiFC er ikke desto mindre en glimrende tilgang, der supplerer andre almindeligt anvendte metoder undersøger protein-protein interaktioner, såsom coimmunoprecipitation, in vitro pull-down-analyser eller gær-to-hybrid eksperimenter.

Introduction

Studere dannelsen af protein-komplekser og deres lokalisering i planteceller i vivo er vigtigt at undersøge mobilnetværk, signalering og metaboliske processer. BiFC tillader visualisering af protein-protein interaktioner i deres naturlige miljø direkte i den levende plantecelle 1-5.

I BiFC nærmer komplementering af to fluorescerende N-og C-terminale fragmenter af et fluorescerende protein fører til en rekonstitueret fluorescerende protein. Fragmenter af mange forskellige fluorescerende proteiner er blevet anvendt til påvisning af protein-interaktioner, fx det grønne fluorescerende protein (GFP) kromoforen som er kemisk dannet af tre forskellige rester 6. Fluorescerende proteiner kan halveres i en løkke eller ß-streng til at resultere i de to fluorescerende fragmenter, der kan være fusioneret til begge proteiner af interesse. Assayet kan anvendes til at detektere interaktioner i enhver subcellulære rum firent i nogen aerobt voksende organisme eller celler, der kan være genetisk modificeret til at udtrykke fusionsproteiner. Hvis de to proteiner stammer i tæt nærhed i cellen fluorescens rekonstitueres og kan overvåges ved hjælp af mikroskopi uden tilsætning af exogene fluorophorer eller farvestoffer 3.

Tobacco (Nicotiana benthamiana) har vist sig at være en bekvem model organisme at visualisere samspillet af vegetabilske proteiner, da proteiner nemt kan udtrykkes ved at udnytte Agrobacterium-medieret transformation af tobaksblade med de genererede konstruktioner. Agrobakterier bruge en såkaldt Ti-plasmid (tumorinducerende), der koder for enzymer, der medierer transduktionen af ​​genet af interesse i planteceller. BiFC er vel gælder for opløseligt samt membranproteiner inden for alle cellulære rum, og har været anvendt med succes i de seneste år til at identificere interagerende proteiner in vivo såvel som at analysere interaktionsstederinden proteinerne 7-9. Efter ekspression af de indførte gener, kan interaktionen af ​​de fluorescerende proteiner visualiseres direkte i blade, der er egnet til større cellulære strukturer, såsom det endoplasmatiske reticulum (ER), plasmamembranen eller chloroplaster. For at overvåge lokalisering i mere raffinerede strukturer, for eksempel, chloroplast konvolut, er det tilrådeligt at visualisere fluorescens i protoplaster isoleret fra transformerede tobaksblade. Et sæt af BiFC vektorer indeholdende enten en C-terminal eller N-terminal fluorescerende mærke skal anvendes til BiFC tilgang i planter 10. Beskrevet i det følgende protokol blev anvendt til at undersøge samspillet mellem cytosol varmeshockprotein 90 (HSP90) med tetratricopeptide repeat (TPR) domæne indeholdende docking proteiner Toc64 og AtTPR7 bosat i chloroplasten yderste kuvert og det endoplasmatiske reticulum, henholdsvis 11-13. Til dette formål blev HSP90 fusioneret med Cterminal del af SCFP (SCFP C). Tag'en N-terminalt fusioneret til chaperonen for at sikre tilgængeligheden af ​​den C-terminale MEEVD bindende motiv af HSP90 at fastspænde-type TPR domæner. Samtidig blev den N-terminale del af Venus (Venus N) fusioneret til den cytosoliske domæner i TPR domæne indeholdende docking proteiner Toc64 og AtTPR7 hhv. Som en negativ kontrol klonede vi det opløselige C-terminale del af SCFP C alene, som er placeret i cytosolen og er derfor en passende kontrol.

De fluorescerende tags af de undersøgte proteiner står over for den samme cellulære rum til at tillade nærhed og dermed rekonstituering af det fluorescerende signal. For at bestemme lokaliseringen af ​​det rekonstituerede fluorescenssignal en markør fusioneret til et andet fluorescerende mærke kan cotransformeres at demonstrere den subcellulære lokalisering af interaktionen. En ER-markør fusioneret til mCherrry blev transformeret samtidigt itilfælde af ER placeret AtTPR7 14. Den autofluorescens af klorofyl tjente som chloroplasten markør i tilfælde af Toc64. Med dette ikke blot in vivo interaktionen af Toc64 og AtTPR7 med henholdsvis den cytosoliske HSP90 chaperone kan overvåges direkte i tobaksbladene, men også den subcellulære lokalisering af interaktionen kan undersøges.

BiFC er velegnet som en tilgang til andre metoder, der studerer protein-protein interaktioner. Sammenlignet med coimmunoprecipitation eller in vitro-nedtrækningsforsøg for eksempel ingen specifikke antistoffer skal være til rådighed for proteinerne af interesse, og proteinerne ikke skal udtrykkes rekombinant in vitro, hvilket kan være en udfordring, især for membranproteiner. Desuden også forbigående interaktioner kan overvåges ved hjælp BiFC, da proteinerne er fanget af samspillet mellem de sammensmeltede fluorescerende tags 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Transformation af BiFC Konstruerer i Agrobacteria

  1. Kloning af BiFC konstruktioner
    1. Forstærk genet af interesse fra et passende skabelon ved hjælp af oligonukleotider indeholdende flankerende attB-sites. Udføre en PCR under anvendelse af en korrekturlæsning polymerase. Tilpasse længden af ​​udglødningstrin til designet primer kombination, og længden af ​​forlængelsen trin ifølge størrelsen fragment. Kontroller PCR-produktet ved agarosegelelektroforese og rense det ved hjælp af en PCR Clean-up kit.
    2. Udfør BP reaktion med det opnåede fragment og posten vektor ved hjælp af en BP rekombinase. Bland 15-150 ng af attB-PCR-produkt med 150 ng af posten vektor, tilsættes 2 ul af BP rekombinasen og fylde op med TE buffer til et samlet volumen på 8 pl. Inkuberes reaktionsblandingen i 1 time ved stuetemperatur, og reaktionen stoppe ved tilsætning af 2 ul af proteinase K i 10 minutter ved 37 ° C.
    3. Omdan hele reaktion i kompetent E. coli DH5a; Celler og screene de opnåede kolonier af koloni PCR for korrekt isætning af DNA-fragment i vektoren. DNA-sekventering af positive plasmider udføres for at bekræfte fraværet af mutationer.
    4. Brug den opnåede post klon LR rekombination med den passende destination vektor under anvendelse af en LR rekombinase. Bland 50-150 ng posten vektor med 150 ng af destination vektor tilsættes 1 ul LR rekombinase og fylde op med TE-buffer til et samlet volumen på 5 ul. Inkuberes reaktionsblandingen i 1 time ved stuetemperatur, og reaktionen standse ved tilsætning af 1 ml proteinase K i 10 minutter ved 37 ° C.
    5. Omdan hele reaktionen i kompetente E. coli DH5a-celler og skærm er fremstillet kolonier af koloni-PCR for korrekt indføring af DNA-fragmentet i vektoren. DNA-sekventering er ikke nødvendigt på dette trin.
    6. Isoler plasmid-DNA med et plasmid mini kit til at sikre en høj grad af renhed.
  2. Fremstilling af kemisk kompetente Agrobacteria (stamme AGL1, Rifampicin og carbenicillinresistens)
    1. Streak ud agrobakterier fra en bestand kultur og vokse i 24 timer ved 28 ° C.
    2. Podes 5 ml LB-medium med en enkelt koloni og inkuberes natten over ved 28 ° C.
    3. Pode 50 ml LB-medium med 2 ml af natten over kultur og vokse i cirka 4 timer ved 28 ° C til en OD600 på 1,0.
    4. Centrifuger cellerne ved 3000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, og pellet resuspenderes i 1 ml steriliseret iskold CaCl2 (10 mM). Hold celler på is efter dette trin.
    5. Forbered aliquoter (100 ul) af de celler, fryses straks i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
  3. Transformation af kemisk kompetent Agrobacteria
    1. Tø en portion af de kompetente AGL1 celler på is. Læg 1-2 pg plasmid-DNA til cellerne. Der inkuberes i 5 minutter på is, 5 min i flydende nitrogen og 5 minutter ved 37 ° C. Tilføj 600 pi LB-medium til cellerne, og skulmule ved 650 rpm i 4 timer ved 28 ° C.
    2. Centrifuger cellerne i 1 min ved 8.000 xg og supernatanten. Pelleten resuspenderes i 50 pi af den resterende LB-medium og plade på LB-plader indeholdende passende antibiotika. Pladerne forsegles og inkuberes i 2 dage ved 28 ° C. Kolonier Screen for tilstedeværelsen af ​​plasmidet ved koloni-PCR.
    3. Podes én positiv koloni i 5 ml LB-medium indeholdende passende antibiotika og inkuberes ved 28 ° C natten over. Bland 500 ul af natten over kultur med 500 pi 50% steriliseret glycerol og nedfryses ved -80 ° C.
    4. Pode agrobakterier i LB-medium indeholdende passende antibiotika direkte fra glycerol lager til transient transformation af tobaksblade.

2. Forbigående Transformation af tobaksblade

  1. Agrobakterierne vækst
    1. Forbered følgende stamopløsninger: acetosyringon (150 mM, opløses i 70% EtOH), gem som alikvoter ved -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, opbevares ved 4 ° C (sterilfilter gennem et 0,2 um filter for at forhindre bakterievækst under længere tids opbevaring), MgCl2 (1 M) lager, butik ved RT.
    2. Podes 10 ml LB-medium indeholdende passende antibiotika med 50 pi af AGL1 glycerol stamkultur indeholdende plasmidet af interesse i et sterilt 50 ml rør og inkuberes ved 28 ° C i mindst 24 timer under omrystning ved 190 rpm, indtil en OD600 mellem 1,0 -2.0 er nået.
    3. Centrifugér bakterier ved 3.000 xg i 15 min. Pelleten resuspenderes i frisk gjort infiltration medium [MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, acetosyringon (150 uM)] for at justere suspensionen til en OD600 på 1,0.
    4. Inkubér Agrobacteria celler i en overhead shaker i 2 timer i mørke. Cellerne kan derefter anvendes til infiltration.
  2. Infiltration af tobaksblade
    1. Brug treuge gammel tobak (Nicotiana benthamiana) planter. Vælg flere ældre blade for infiltration.
    2. Bland lige dele Agrobacteria bærer konstruktioner af interesse (3 ml hver). Tag en 5 ml sprøjte uden kanyle til infiltration. Infiltrere cellesuspensionen forsigtigt ind tobaksbladene ved at trykke sprøjten på undersiden af ​​bladene flere steder.
    3. Vande planter og efterlade dem i mørket i to dage.

3. Protoplast Forberedelse

Protoplast udarbejdelse af tobaksblade blev tilpasset fra Koop et al. 16 og ændret en anelse.

  1. Forberedelse Buffer
    1. Forbered F-PCN medium: Makro-salte [KNO3 (1012 mg / ml), CaCl2 • 2H 2 O (440 mg / ml), MgSO4 • 7H 2 O (370 mg / ml), KH 2 PO 4 ( 170 ug / ml), NH4-succinat [(20 mM; udarbejde en 2 M stamopløsning solution (succinat (236 mg / ml) og NH4Cl (106 mg / ml), indstilles til pH 5,8 for at opløse)], Micro-salte [EDTA-Fe (III) x Na-salt (40 mg / ml), KJ (0,75 ug / ml), H 3 BO 3 (3 ug / ml), MnSO4 • H2O (10 ug / ml), ZnSO4 • 7H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 mg / ml), CuSO4 • 5H 2 O (0,025 mg / ml), CoCI2 • 6H 2 O (0,025 mg / ml)], MES (390 mg / ml), glucose (ca. 80 ug / ml) osmolaritet 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Opbevares i alikvoter ved -20 ° C.
    2. Forbered F-PIN medium: Alle ingredienser som F-PCN, men i stedet for glukose brug saccharose (ca. 110 mg / ml), osmolaritet 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Opbevares i alikvoter ved -20 ° C.
    3. Forbered W5 medium: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCI, 2 mM MES, osmolaritet 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Opbevares ved 4 °; K (sterilfilter gennem et 0,2 um filter for at forhindre bakterievækst under længere tids opbevaring).
    4. Fremstilles frisk enzymopløsning til protoplastisolering (0,1 g cellulase, 0,03 g macerozym i 10 ml F-PIN). Inkuberes opløsningen ved 55 ° C i 10 minutter og afkøles til stuetemperatur. Tilsæt 100 pi af 10% BSA til 10 ml opløsning.
  2. Isolering af protoplaster
    1. Placer en infiltreret blad i en petriskål, og der tilsættes frisk enzymopløsning. Brug en ny barberblad til at skære bladet i ca 0,5 cm 2 store stykker. Overfør blad-stykker med enzymet opløsning i en vakuum-infiltration kolbe og vakuum infiltrere ca 20 sek indtil luftbobler dukke op fra bladene (release vakuum meget omhyggeligt).
    2. Ryst kolben i 90 min ved 40 omdrejninger i mørke.
    3. Slip protoplaster ved omrystning i 1 min ved 90 rpm. Opløsningen filtreres gennem gaze (100 uM) i et 15 ml centrifugerør (rund bund). Overlay protoplast opløsning med 2 ml F-PCN puffer og centrifugeres i 10 min ved 70 x g (langsom acceleration og deceleration) ved stuetemperatur.
    4. Intakte protoplaster akkumulerer ved grænsefladen enzymopløsning og F-PCN. Tag en bred åbning 1 ml pipette spids til at overføre de intakte protoplaster i en frisk centrifugeglas, og fylde op med W5 buffer. Centrifuger i 2 minutter ved 100 xg (langsom acceleration og deceleration) for at pelletere protoplasterne.
    5. Fjern omhyggeligt supernatanten ved hjælp af en pipette og resuspender pellet i cirka 200 ul W5 buffer, afhængigt af mængden af ​​protoplaster.
    6. Brug altid brede dyse tips til at forhindre brud af intakte protoplaster.

4.. Laser skanningsmikroskopi

  1. Prøveforberedelse
    1. Indsæt to små strimler af fugemasse omkring et objektglas (2 cm fra hinanden). Placer 20 ul protoplasten løsning mellem strimlerne og anbring forsigtigt et dækglaspå toppen. De fugebånd sørge for, at protoplasterne ikke smadret af dækglasset.
    2. For total bladprøver skære et stykke 1 cm fra blade og placere den på et objektglas med den nederste side af bladet vender opad. Tilsæt ca 30 pi H2O, placere et dækglas på toppen og ordne det stramt med tape på begge sider.
  2. Konfokal billedbehandling og mikroskop indstillinger
    1. Imaging udføres med en konfokal laser scanning mikroskop fra Leica, Type: TCS SP5. For forstørrelse bruge et objektiv (HCX PL APO CS) med en styrke på 63X med glycerol som billeddannende medium. Indstil den numeriske blænde til 1,3. Brug Leica Application Suite / Avanceret Fluorescens software til evaluering (se Supplemental data S1).
    2. Indstil Argon laser til 30%, og laser magt på 488 nm til en intensitet på 18% for at overvåge den rekonstituerede BiFC signalet ved 515 nm og indstille en PMT detektor emission båndbredde 495-550. At overvåge klorofyl autofluorescens indstille en anden PMT detektor emission båndbredde 650-705.
    3. At overvåge mCherry signal bruge HeNe 561 laser, indstille intensiteten af ​​laseren 561-18% og emissionen båndbredde på en tredje PMT detektor 587-610.
    4. Sørg for, at billeder af alle PMT detektor kanaler er taget med samme gain-indstillinger (gevinst bør være mellem 800-900 at udelukke baggrundssignaler).
    5. Tag billeder i et format, bredde / højde på 1024 x 1024 pixels med en scanning hastighed på 100 Hz.
    6. For Z-stackings bruger en maksimal afstand på 0,5 mM mellem hver stak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette eksempel anvendte vi BiFC metode til at overvåge interaktionen af ​​den cytosoliske molekylchaperone HSP90 med membran docking-proteiner AtTPR7 og Toc64. AtTPR7 er en del af Sec translocon og interagerer med cytosoliske chaperoner, som muligvis leverer sekretoriske preproteins for posttranslationel translokation til ER-membranen. Ligeledes Toc64 på chloroplasten kuvert optræder i post-translationel import ved at modtage HSP90 tilknyttede chloroplastproteiner preproteins. Begge proteiner omfatter en cytosolisk udsat TPR domæne, som medierer interaktion med den C-terminale MEEVD motiv af HSP90.

Proteiner blev klonet ved hjælp af specifikke rekombinaser i egnede destination vektorer fusing TPR domæne indeholdende docking proteiner til Venus N sikre, at det fluorescerende mærke er knyttet til det cytosoliske domæne og har således ikke hindre målretning og membraninsertion af proteinerne. I tilfælde af HSP90, SCFP C (figur 1 og 2).

AtTPR7 og HSP90 blev cotransformeret med en ER markør (mCherry) for at verificere lokaliseringen af ​​proteinet kompleks. Fluorescensen blev overvåget i intakte blade med en laser scanning mikroskop. Som en kontrol SCFP C alene, som er beliggende i cytosolen (som HSP90) blev udtrykt sammen med AtTPR7 og ER markør. Adskillige blade blev kontrolleret for fluorescens og billeder blev taget med identiske mikroskop indstillinger. Det er vores erfaring et typisk signal skal være synlig med gain indstillinger på 800-900, mens den negative kontrol kun skal vise meget svag baggrund fluorescens med disse indstillinger (Figur 3). En rekonstitueret signal til Venus N-AtTPR7 sammen med SCFP C-HSP90 ved 515 nm blev overvåget overlapning med ER markør. Intet signal til Venus N-AtTPR7 og den negative kontrol SCFP C kunne observeres.

I tilfælde af Toc64 og HSP90-ekspression, såvel som Toc64 og SCFP C blev protoplasterne isoleret fra infiltreret tobaksblade, da mikroskopiske billeder af hele overlader det nøjagtige lokalisering er vanskeligt at afgøre, om fluorescens er allerede synlige (figur 4 og 5). Et signal ved 515 nm blev restaureret udtrykker Toc64-Venus N sammen med SCFP C-HSP90 på ​​chloroplast konvolut, som kan påvises som ringformede strukturer, der omgiver chloroplasterne. Som ovenfor kontrollen blev fotograferet med identiske mikroskop indstillinger, og ikke vise et fluorescens ved 515 nm.

Figur 1
Figur1.. Kloning procedure BiFC konstruktionerne. Generne af interesse blev amplificeret med oligonukleotider flankeret af that B sider for at tillade BP rekombination i en post vektor med att P industriområder, så erstatte CCDB genet i vektoren. Derefter træder vektor blev rekombineret med passende destination vektorer ved hjælp af en LR rekombinase. Transformation af disse konstruktioner i tobaksblade tillader ekspression af proteiner fusioneret til de opdelte fluorescerende proteiner og tags for antistofdetektering. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Skematisk præsentation af de proteiner, der udtrykkes i BiFC eksperimenter. Venus N erkoblet til cytosoliske dele af Toc64 eller AtTPR7 bosiddende i chloroplasten og ER, hhv. HSP90 er N-terminalt fusioneret til SCFP C, giver mulighed for interaktion af TPR domæner Toc64 og AtTPR7 med HSP90 C-terminalen. SCFP C alene udtrykkes i cytosolen som kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. BiFC med AtTPR7 og HSP90 visualiseret i tobaks epidermal bladceller. Venus N-AtTPR7 og SCFP C-HSP90 blev cotransformeret med ER mCherry markør (midterste panel) og transient udtrykt i tobaksblade. Som en kontrol Venus N-AtTPR7 blev cotransformeret med SCFP Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. BiFC med Toc64 og HSP90 visualiseret i tobaks epidermal bladceller. Toc64-Venus N og SCFP C-HSP90 blev transient udtrykt i tobaksblade. Som en kontrol Toc64-Venus N blev cotransformeret med SCFP C alene (nederste paneler). Opløst fluorescens blev overvåget ved 515 nm (venstre panel). Overlay af vænal ved 515 nm og klorofyl autofluorescens vises (højre panel). Klorofyl autofluorescens overvåges ved 480 nm. Skalapanelerne:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. BiFC med Toc64 og HSP90 visualiseret i tobaksprotoplaster. Toc64-Venus N og SCFP C-HSP90 blev transient udtrykt i tobaksblade. Som en kontrol Toc64-Venus N blev cotransformeret med SCFP C alene (nederste paneler). Opløst fluorescens blev overvåget ved 515 nm (venstre panel) i isolerede protoplaster. Overlejring af signalet ved 515 nm, og klorofyl autofluorescens vises (højre panel). Klorofyl autofluorescens overvåges ved 480 nm. Skalapanelerne:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved planlægningen af ​​et BiFC eksperiment flere punkter bør overvejes. Selv om ingen strukturel information om de proteiner af interesse er påkrævet, topologi skal være kendt, når der arbejdes med membranspændende proteiner. De fluorescerende proteiner er nødt til at opholde sig i samme subcellulære rum eller står over for samme side af en membran for at tillade interaktion. Naturligvis, når analysere proteiner, der kræver en N-terminal targeting sekvens kun en C-terminal tag kan overvejes. Da det er muligt at mærke interfererer med korrekt målretning eller membran indsættelse af proteinet af interesse, er det tilrådeligt at teste subcellulære lokalisering på forhånd, for eksempel ved at udtrykke GFP-mærkede protein. Desuden bør en negativ kontrol altid inkluderet. I dette eksempel genererede vi en konstruktion kun udtrykker SCFP C i cytosolen. Dog kan ethvert protein, som ikke forventes at interagere anvendes som en negativ kontrol. For at verificere korrekt udtryk of konstruktionerne, især hvis fluorescens er synlig, kan proteinekstrakter af infiltrerede blade eller protoplaster underkastes SDS-PAGE og protein-ekspression kan verificeres med antistoffer rettet mod de respektive koder.

Fluorescerende signaler kan overvåges enten i intakte blade eller isolerede protoplaster. Selvom opdagelse i hele blade er hurtigere, er signaler af mere raffinerede strukturer bedre visualiseret i protoplaster. Endvidere er for det meste epidermale celler overvåges, når man ser på hele blade, som ikke indeholder chloroplaster. Derfor, når man analyserer chloroplastproteiner, isolering af protoplaster er tilrådeligt.

Den største fordel ved teknikken er mulighed for at overvåge protein-protein-interaktioner i levende planteceller. Der er ingen grund til at bryde cellerne og at opløse membran protein-komplekser, som det er tilfældet i f.eks coimmunoprecipitation eksperimenter. Desuden ansøgningen er enkeleftersom de eneste nødvendige materialer er de vektorer, agrobakterier og en standard fluorescens mikroskop (selvom højere kvalitet billeder opnås med en konfokal laser scanning mikroskop). I modsætning til in vitro pull-down assays med rekombinante proteiner, som kun tillader detektering af en interaktion, hvis begge proteiner direkte interagerer kan BiFC også detektere protein-komplekser, der kræver yderligere endogene proteiner til stede i cellen. Men det betyder også, at BiFC giver ikke bevise en direkte protein-protein interaktion, som altid skal kontrolleres af andre teknikker. Som følge af overekspression af stærke promotorer uspecifikke interaktioner kan opstå, som skal udelukkes ved relevante negative kontroller. Til dette formål et protein, der ikke forventes at interagere med proteinet af interesse, men er bosat i samme rum, eller konstruerer mangler bør anvendes protein-protein interaktion domæner. Desuden er en fortyndingsserie af byttet cDNA med en vekselvirkende cDNA samt observation af fluorescens i en tidsafhængig måde efter transformation kan bidrage til at validere resultaterne. For at sikre diskrimination sande fluorescerende signaler og artefakter de BiFC signalerne skal kvantificeres og sat i forhold til en anden udtrykte fluorescerende protein, for eksempel en markør protein 7,8. En anden ulempe ved BiFC metode er, at interaktioner af proteinerne kan også hindres sterisk af de relativt store fluorescerende tags.

Anvendelse af Agrobacterium-medieret transformation i andre planter (f.eks Arabidopsis) er imidlertid begrænset, er det muligt at omdanne den plasmid-DNA direkte, enten i isolerede Arabidopsis protoplaster eller transformere celler under anvendelse af en partikelkanon. Imidlertid bør plasmid-DNA isoleres ved hjælp af en MAXI Kit, da det bør være meget koncentreret, og så rent som muligt for protoplasttransformation. Et andet problem vi observed grundet høj ekspression af målproteinerne var uspecifikke sammenlægning i cytosolen, især når der arbejdes med mitokondrie membranproteiner. Dette problem kan overvindes ved biolistisk omdannelse af løg celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Jürgen Soll for nyttige diskussioner og Chris Carrie til kritisk læsning af manuskriptet. Dette projekt blev finansieret af DFG og Fonds der chemischen Industrie (tilskud numre SFB 1035 projekt A04 til SS og gøre 187/22 til RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone Sigma-Aldrich D134406 Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10 Serva 16419 from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10  Serva 28302 from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609-250
pDEST-GWVYNE Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  2. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
  3. Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
  4. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  5. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
  6. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  7. Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
  8. McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
  9. Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
  10. Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
  11. Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
  12. Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
  13. Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
  14. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
  15. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  16. Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).

Tags

Plantebiologi Tetratricopeptide gentage domæne chaperone kloroplaster endoplasmatiske reticulum HSP90 Toc kompleks Sec translocon BiFC
Protein-protein interaktioner visualiseret ved bimolekylær Fluorescens komplementering i tobaksprotoplaster og blade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schweiger, R., Schwenkert, S.… More

Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves. J. Vis. Exp. (85), e51327, doi:10.3791/51327 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter