Summary
Dannelse av protein komplekser in vivo kan visualiseres ved bimolecular fluorescens complementation. Interaksjonspartnere er smeltet sammen til komplementære deler av fluoriserende koder og forbigående uttrykt i tobakksblader, som resulterer i et rekonstituert fluorescerende signal på tett nærhet av de to proteiner.
Abstract
Mange proteiner samhandle forbigående med andre proteiner, eller er integrert i multiproteinkomplekser å utføre sin biologiske funksjon. Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en in vivo metode for å overvåke slike interaksjoner i planteceller. I den fremlagte protokoll de undersøkte kandidat proteiner er fusjonert til komplementære halvdeler av fluorescerende proteiner og de respektive konstruksjoner innføres i planteceller via Agrobacterium-formidlet transformasjon. Deretter blir proteinene forbigående uttrykt i tobakksblader, og de gjenopprettede fluorescerende signaler kan detekteres med en konfokal laser scanning mikroskop i intakte celler. Dette tillater ikke bare visualisering av interaksjonen seg selv, men også den subcellulære lokalisering av proteinkomplekser kan bestemmes. For dette formål kan markørgener inneholdende et fluoriserende kode kan coexpressed sammen med BiFC konstruksjoner, og dermed å visualisere cellulære strukturer som for eksempel tHan endoplasmatiske retikulum, mitokondrier, Golgi-apparatet eller plasmamembranen. Det fluorescerende signalet kan overvåkes enten direkte i epidermale celler blad eller i enkle protoplaster, som lett kan isoleres fra de transformerte tobakksblader. BiFC er ideell for å studere protein-protein interaksjoner i sine naturlige omgivelser i den levende celle. Imidlertid må det tas i betraktning at uttrykket må være drevet av sterke promotorer, og at interaksjonspartnere er modifisert på grunn av sammensmelting av de forholdsvis store fluorescens-koder, noe som kan forstyrre interaksjonen mekanisme. Likevel er BiFC en utmerket komplementær tilnærming til andre vanlig anvendte metoder undersøker protein-protein interaksjoner, for eksempel coimmunoprecipitation, in vitro pull-down analyser eller gjær-to-hybrid eksperimenter.
Introduction
Studerer dannelsen av protein komplekser og deres lokalisering i planteceller in vivo er viktig å undersøke mobilnettverk, signal og metabolske prosesser. BiFC tillater visualisering av protein-protein interaksjoner i sitt naturlige miljø direkte i levende plantecelle 1-5.
I BiFC nærmer komplementering av to nonfluorescent N-og C-terminale fragmenter av et fluorescerende protein fører til et rekonstituert fluorescerende protein. Fragmenter av mange forskjellige fluorescerende proteiner har blitt brukt for å påvise protein interaksjoner, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) chromophore som er kjemisk dannet av tre forskjellige rester 6. Fluorescent proteiner kan halveres i en løkke eller ß-tråd for å føre de to nonfluorescent fragmenter som kan bli sammensmeltet til både proteiner av interesse. Målingen kan brukes til å detektere vekselvirkninger i en hvilken som helst subcellulære kupént i en hvilken som helst aerobt voksende organismer eller celler som kan bli genetisk modifisert for å uttrykke fusjonsproteiner. Hvis de to proteinene kommer til tett nærhet i cellen, blir fluorescens rekonstituert og kan overvåkes ved mikroskopi uten tilsetning av eksogene fluoroforer eller fargestoffer 3.
Tobakk (Nicotiana benthamiana) har vist seg å være en praktisk modellorganisme for å visualisere samspillet mellom planteproteiner, siden proteiner kan lett komme til uttrykk ved å utnytte agrobacterium-mediert transformasjon av tobakk blader med de genererte konstruksjoner. Agrobacteria bruke en såkalt Ti-plasmid (tumorinduserende) som koder for enzymer som medierer den transduksjon av genet av interesse inn i planteceller. BiFC er anvendelig også for løselige så vel som for membranproteiner i alle cellene og har vært brukt med hell i de siste årene for å identifisere samspill proteiner in vivo, så vel som for å analysere interaksjon stederinnenfor proteiner 7-9. Ved ekspresjon av de innførte genene, kan vekselvirkningen mellom de fluorescerende proteiner visualiseres direkte i blader, som er egnet for større cellulære strukturer, slik som det endoplasmatiske retikulum (ER), plasma membran eller kloroplaster. Imidlertid, for å overvåke lokaliseringen i mer raffinerte strukturer, f.eks kloroplast konvolutt, er det tilrådelig å visualisere fluorescens i protoplaster isolert fra transformerte tobakksblader. Et sett med BiFC vektorer inneholdende enten en C-terminal eller en N-terminal fluorescerende merke må brukes for BiFC tilnærming i planter 10. Den heretter beskrevet protokollen ble brukt til å studere samspillet av cytosoliske heat shock protein 90 (HSP90) med tetratricopeptide gjenta (TPR) domene som inneholder docking proteiner Toc64 og AtTPR7 bosatt i kloroplast ytre konvolutt og det endoplasmatiske retikulum, henholdsvis 11-13. For dette formål ble HSP90 smeltet til Cterminal del av SCFP (SCFP C). Brikken var N-terminalt smeltet til anstand for å sikre tilgjengelighet for den C-terminale MEEVD bindende motivet av HSP90 å klemme-type TPR domener. Parallelt med dette ble den N-terminale del av Venus (Venus N) sammensmeltet til de cytosoliske domener av TPR domene som inneholder docking proteiner Toc64 og AtTPR7, respektivt. Som en negativ kontroll vi klonet det oppløselige C-terminale del av SCFP C utelukkende som ligger i cytosol og er derfor en passende kontroll.
Fluorescerende tags av de studerte proteinene har for å møte de samme cellulære rommet for å tillate nærhet og dermed tilberedning av fluorescerende signal. For å bestemme lokaliseringen av den rekonstituerte fluorescerende signal på en markør protein kondensert til en annen fluorescerende tag kan kotransformert å demonstrere den subcellulære lokalisering av interaksjonen. En ER markør protein smeltet til mCherrry ble forvandlet samtidig iVed akuttmottaket ligger AtTPR7 14. Den autofluorescence av klorofyll fungert som kloroplast markør i tilfelle Toc64. Ved dette ikke bare den in vivo interaksjon av Toc64 og AtTPR7, henholdsvis med den cytosoliske HSP90 anstand kan overvåkes direkte i tobakksblader, men også den subcellulære lokalisering av interaksjonen kan undersøkes.
BiFC er godt egnet som en komplementær tilnærming til andre metoder som studerer protein-protein interaksjoner. Sammenlignet med coimmunoprecipitation eller in vitro-pull-down eksperimenter, for eksempel, ingen spesifikke antistoffer må være tilgjengelig for proteinene av interesse, og proteiner behøver ikke å være rekombinant uttrykt in vitro, noe som kan være vanskelig, særlig for membranproteiner. Videre også forbigående interaksjoner kan overvåkes ved hjelp BiFC, siden proteiner er fanget av et samspill av de smeltet fluorescerende tagger 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Transformasjon av BiFC Konstruerer i Agrobacteria
- Kloning av BiFC konstruerer
- Forsterke genet av interesse fra en passende mal bruker oligonukleotider som inneholder flankerer attB-sider. Utfør en PCR ved hjelp av en korrekturlesing polymerase. Tilpass lengden av glødetrinn til det utformet primer kombinasjon og lengden av forlengelsen trinn i henhold til fragment størrelse. Kontroller PCR produktet ved agarosegelelektroforese og rense den ved hjelp av en PCR Clean-up Kit.
- Utfør BP reaksjon med innhentet fragment og oppføring vektor ved hjelp av en BP recombinase. Bland 15-150 ng av attB-PCR-produkt med 150 ng av inngangsvektor, tilsett 2 pl av BP rekombinase og fyller opp med TE-buffer til et totalt volum på 8 mL. Inkuber reaksjonen i 1 time ved RT og stopp reaksjonen ved å tilsette 2 pl proteinase K i 10 minutter ved 37 ° C.
- Transform hele reaksjonen til kompetent E. coli DH5α; Celler og screene de oppnådde kolonier ved koloni PCR for riktig innsetting av DNA-fragment inn i vektoren. DNA-sekvensering av positive plasmider er utført for å verifisere fraværet av mutasjoner.
- Bruk fått innreise klone for LR rekombinasjon med den aktuelle destinasjonen vektor ved hjelp av en LR recombinase. Bland 50-150 ng av inngangsvektor med 150 ng av destinasjonsvektor, tilsett 1 pl LR rekombinase og fyller opp med TE-buffer til et totalt volum på 5 ul. Inkuber reaksjonen i 1 time ved RT og stopp reaksjonen ved å tilsette 1 pl proteinase K i 10 minutter ved 37 ° C.
- Transformering hele reaksjonsblandingen over i kompetente E. coli-celler og DH5α skjerm fremstilt kolonier ved koloni PCR for riktig innsetting av DNA-fragment inn i vektoren. DNA-sekvensering er ikke nødvendig i dette trinnet.
- Isoler plasmid-DNA med et plasmid mini kit for å sikre en høy grad av renhet.
- Utarbeidelse av kjemisk kompetent Agrobacteria (belastning AGL1, Rifampicin og Carbenicillin motstand)
- Streak ut agrobacteria fra et lager kultur og vokse i 24 timer ved 28 ° C.
- Inokulere 5 ml LB-medium med en enkelt koloni og inkuberes over natten ved 28 ° C.
- Inokuler 50 ml LB-medium med 2 ml av en over natten kultur og vokse i ca 4 timer ved 28 ° C til en OD 600 på 1,0.
- Sentrifuger cellene ved 3000 xg i 15 min ved 4 ° C og resuspender pelleten i 1 ml sterilt iskald CaCl 2 (10 mM). Hold cellene på is etter dette trinnet.
- Forbered alikvoter (100 pl) av de celler, fryse umiddelbart i flytende nitrogen og lagres ved -80 ° C.
- Transformasjon av kjemisk kompetent Agrobacteria
- Tine en delmengde av kompetente AGL1 celler på isen. Legg 1-2 ug av plasmid-DNA til cellene. Inkuber i 5 min på is, 5 min i flytende nitrogen og 5 min ved 37 ° C. Legg 600 pl LB-medium til cellene og shake ved 650 rpm i 4 timer ved 28 ° C.
- Sentrifuger cellene for en min ved 8000 xg og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 50 pl av den resterende LB-medium og platen på LB-plater inneholdende de egnede antibiotika. Forsegle platene og inkuberes i 2 dager ved 28 ° C. Skjermen kolonier for tilstedeværelsen av plasmidet ved koloni PCR.
- Inokuler en positiv koloni i 5 ml LB medium inneholdende egnede antibiotika og inkuber ved 28 ° C over natten. Bland 500 ul av en over natten kultur med 500 pl 50% glycerol sterilisert og fryses ved -80 ° C.
- Inokuler de agrobacteria i LB medium inneholdende egnede antibiotika direkte fra glycerol lager for transient transformasjon av tobakksblader.
2. Forbigående Transformasjon av tobakk blader
- Agrobacteria vekst
- Forbered følgende stamløsninger: Acetosyringone (150 mM, oppløses i 70% EtOH), butikken som alikvoter ved -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, oppbevar ved 4 ° C (sterilt filter gjennom en 0,2 mikrometer filter for å hindre bakterievekst ved lengre lagring), MgCl 2 (1 M) lager, butikk på RT.
- Inokuler 10 ml LB medium inneholdende de egnede antibiotika med 50 pl av den AGL1 glycerol lagerkultur inneholdende plasmidet av interesse i et sterilt 50 ml rør og inkuberes ved 28 ° C i minst 24 timers rysting ved 190 rpm inntil en OD 600 mellom 1.0 -2,0 nås.
- Sentrifuger bakterier ved 3000 xg i 15 min. Resuspender pellet i nystekte infiltrasjon medium [MgCl 2 (10 mm), MES / KOH (10 mm) pH 5,7, Acetosyringone (150 mm)] og tilpasse fjæringen til en OD 600 på 1,0.
- Inkuber agrobacteria cellene i en overliggende shaker i 2 timer i mørke. Cellene kan deretter bli brukt for infiltrasjon.
- Infiltrasjon av tobakksblader
- Bruk treuke gammel tobakk (Nicotiana benthamiana) planter. Velg flere eldre blader for infiltrasjon.
- Bland like volumer av de agrobacteria bærer konstruksjoner av interesse (3 ml hver). Ta en 5 ml sprøyte uten nål for infiltrasjon. Infiltrere cellesuspensjonen forsiktig inn i de tobakksblader ved å trykke på sprøyten på undersiden av bladene på flere steder.
- Vanne plantene og la dem i mørket i to dager.
Tre. Protoplast Forberedelse
Protoplast utarbeidelse av tobakksblader ble tilpasset fra Koop et al. 16 og litt endret.
- Buffer forberedelse
- Forbered F-PCN medium: Makro salter [KNO 3 (1012 ug / ml), CaCl 2 • 2 H 2 O (440 ug / ml), MgSO 4 • 7H 2 O (370 ug / ml), KH PO 2 4 ( 170 ug / ml), NH 4-succinat [(20 mM, forberede en 2 M lager solution (suksinat (236 ug / ml) og NH4Cl (106 ug / ml), justeres til pH 5,8 for å oppløse)], mikro salter [EDTA-Fe (III) x Na-salt (40 ug / ml) KJ (0,75 mg / ml), H 3 BO 3 (3 ug / ml), MnSO 4 • H 2 O (10 ug / ml), ZnSO 4 • 7H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 mg / ml), CuSO 4 • 5H 2 O (0,025 mg / ml), COCl 2 • 6H 2 O (0,025 mg / ml)], MES (390 mikrogram / ml), glukose (ca. 80 mikrogram / ml) osmolaritet 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Oppbevares i alikvoter ved -20 ° C.
- Forbered F-PIN medium: Alle ingredienser som F-PCN, men i stedet for glukose bruk sukrose (cirka 110 mg / ml), osmolaritet 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Oppbevares i alikvoter ved -20 ° C.
- Forbered W5 medium: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolaritet 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Oppbevar ved 4 °; C (sterilt filter gjennom en 0,2 mikrometer filter for å hindre bakterievekst ved lengre lagring).
- Forbered frisk enzym løsning for protoplast isolasjon (0,1 g cellulaseløs, 0,03 g macerozym i 10 ml F-PIN). Inkuber løsningen ved 55 ° C i 10 min og avkjøles til RT. Tilsett 100 ul av 10% BSA til 10 ml oppløsning.
- Isolering av protoplaster
- Plasser en infiltrert blad inn i en petriskål og tilsett friske enzymet løsning. Bruk en ny barberblad til å skjære bladet inn ca 0,5 cm to store biter. Overfør blad-stykker med enzymet løsning inn i et vakuum-infiltrasjon kolbe og vakuum infiltrere i ca 20 sek til luftbobler dukke opp fra bladene (utgivelsen vakuum veldig nøye).
- Rist flasken for 90 min ved 40 rpm i mørket.
- Slipp protoplaster ved å riste i 1 min på 90 rpm. Filtrer løsningen gjennom gasbind (100 mM) i en 15 ml sentrifuge rør (rund bunn). Overlegg av protoplast-løsning med 2 ml F-PCN buffer og sentrifuger i 10 min ved 70 xg (langsom akselerasjon og retardasjon) ved RT.
- Intakte protoplaster akkumuleres i grenselandet mellom enzym løsning og F-PCN. Ta en bred åpning 1 ml pipette for å overføre de intakte protoplastene i et friskt sentrifugerør og fylles opp med W5-buffer. Sentrifuger i 2 min ved 100 xg (sakte akselerering og retardering) for å pelletere de protoplaster.
- Fjern supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette og resuspender pelleten i omtrent 200 pl buffer W5, avhengig av mengden av protoplaster.
- Bruk alltid brede munningsspissene å forhindre revner intakte protoplaster.
4. Laser Scanning Mikros
- Prøveopparbeidelse
- Lim to små strimler av tetningsmasse rundt et objektglass (2 cm fra hverandre). Plasser 20 pl av protoplastløsningen mellom strimlene og nøye plassere et dekkglasspå toppen. Fugemasse strimler sørge for at protoplaster ikke er knust av dekselet glass.
- For totale blad prøver kutte en 1 cm stykke fra bladet og legg den på et objektglass med undersiden av bladet vendt oppover. Legg ca 30 mL H 2 O, plassere en cover glass på toppen og fikse det tett med teip på begge sider.
- Confocal bildebehandling og mikroskop innstillinger
- Imaging er utført med en confocal laser scanning mikroskop fra Leica, type: TCS SP5. For forstørrelse bruke et objektiv (HCX PL APO CS) med en styrke på 63X med glyserol som bildebehandling medium. Sett numerisk apertur til 1,3. Bruk Leica Application Suite / Advanced Fluorescens programvare for evaluering (se Supplemental data S1).
- Sett argon laser til 30%, og lasereffekten ved 488 nm med en intensitet på 18% for å overvåke den rekonstituerte BiFC signal ved 515 nm og angi en PMT detektor utslipps båndbredde 495-550. For å overvåke klorofyll autofluorescence satt en andre PMT detektor utslipp båndbredde 650-705.
- Å overvåke mCherry signal bruke HeNe 561 laser, sette intensiteten av laser 561-18% og utslipp båndbredden til en tredje PMT detektor 587-610.
- Sørg for at bilder av alle PMT detektor kanaler er tatt med samme innstillinger av nivåkontrollen (gevinst bør være mellom 800-900 for å utelukke bakgrunnssignaler).
- Ta bilder i et format bredde / høyde på 1024 x 1024 piksler med en skannehastighet på 100 Hz.
- For Z-stackings bruke en maksimal avstand på 0,5 mikrometer mellom hver stabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksemplet har vi brukt BiFC metode for å overvåke samspillet av cytosoliske molekylære anstand HSP90 med membran docking proteiner AtTPR7 og Toc64. AtTPR7 er en del av Sec translocon og samhandler med cytosoliske anstand, som muligens leverer sekretoriske preproteiner for post-translasjonell translokasjon til ER membranen. Likeledes, Toc64 på kloroplast ytre konvolutt opptrer i post-translasjonell import ved å motta HSP90 forbundet chloroplast preproteiner. Begge proteiner omfatte en cytosoliske eksponert TPR domene, som formidler interaksjonen med den C-terminale MEEVD motiv av HSP90.
Proteiner ble klonet ved hjelp av spesifikke recombinases i passende bestemmelses vektorer sikring av TPR domene som inneholder docking proteiner til Venus N, som sikrer at det fluorescerende merke er festet til den cytosoliske domene, og omfatter således ikke til hinder for målretting og membraninnsetting av proteinene. I tilfelle av HSP90, SCFP C (figurene 1 og 2).
AtTPR7 og HSP90 ble kotransformert med en ER markør (mCherry) for å verifisere lokalisering av protein kompleks. Fluorescens ble målt i intakte bladene med en laser scanning mikroskop. Som en kontroll SCFP C alene, som ligger i cytosol (som HSP90), ble uttrykt sammen med AtTPR7 og ER markør. Flere blader ble sjekket for fluorescens og bildene ble tatt med identiske mikroskop innstillinger. I vår erfaring et typisk signal skal være synlig med forsterkning på 800-900, mens den negative kontrollen skal bare vise svært liten bakgrunnsfluoresens med disse innstillingene (Figur 3). En rekonstruert signal for Venus N-AtTPR7 sammen med SCFP C-HSP90 på 515 nm ble overvåket overlapping med ER markør. Ingen signal for Venus N-AtTPR7 og den negative kontrollen SCFP C kunne observeres.
I tilfelle av Toc64 og HSP90 ekspresjon, så vel som Toc64 og SCFP C, ble isolert fra protoplaster infiltrert tobakksblader, da det i mikroskopiske bilder av hele forlater den nøyaktige lokalisering er vanskelig å fastslå, men fluorescens er allerede synlig (figurene 4 og 5). Et signal på 515 nm ble restaurert uttrykke Toc64-Venus N sammen med SCFP C-HSP90 på kloroplast konvolutt, som kan bli oppdaget som ringformede strukturer som omgir kloroplaster. Som ovenfor kontrollen ble fotografert med identiske mikroskop innstillinger og ikke vise en fluorescens ved 515 nm.
FigurEn. Kloning prosedyre for BiFC konstruerer. Genene av interesse ble forsterket med oligonukleotider flankert av att B sider å tillate BP rekombinasjon inn en oppføring vektor med att P sider, og dermed erstatte ccdB genet innenfor vektoren. Deretter trer vektor ble saman med passende destinasjon vektorer ved hjelp av en LR recombinase. Transformasjon av disse konstruerer i tobakksblader gjør at uttrykket av proteiner smeltet til de delte fluorescerende proteiner og til koder for antistoffpåvisning. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av proteiner uttrykt i BiFC eksperimenter. Venus N erkoplet til cytosoliske deler av Toc64 eller AtTPR7 bosatt i kloroplast og ER, henholdsvis. HSP90 er N-terminalt smeltet til SCFP C, slik at samspillet mellom de TPR domener av Toc64 og AtTPR7 med HSP90 C-terminalen. SCFP C alene er uttrykt i cytosol som en kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. BiFC med AtTPR7 og HSP90 visualisert i tobakks epidermal blad celler. Ble Venus N-AtTPR7 og SCFP C-HSP90 kotransformert med ER mCherry markør (midtre panelet) og forbigående uttrykt i tobakksblader. Som en kontroll Venus N-AtTPR7 ble kotransformert med SCFP
Figur 4. BiFC med Toc64 og HSP90 visualisert i tobakks epidermal blad celler. Toc64-Venus N og SCFP C-HSP90 ble forbigående uttrykt i tobakksblader. Som en kontroll Toc64-Venus N ble kotransformert med SCFP C alene (nederste paneler). Rekonstituert fluorescens ble overvåket ved 515 nm (venstre panel). Overlegg av signal på 515 nm og klorofyll autofluorescence vises (høyre panel). Klorofyll autofluorescence overvåkes på 480 nm. Scale barer:. 10 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. BiFC med Toc64 og HSP90 visualisert i tobakksprotoplaster. Toc64-Venus N og SCFP C-HSP90 ble forbigående uttrykt i tobakksblader. Som en kontroll Toc64-Venus N ble kotransformert med SCFP C alene (nederste paneler). Rekonstituert fluorescens ble overvåket ved 515 nm (venstre panel) i isolerte protoplaster. Overlegg av signalet på 515 nm og klorofyll autofluorescence vises (høyre panel). Klorofyll autofluorescence overvåkes på 480 nm. Scale barer:. 10 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved planlegging av en BiFC eksperiment flere punkter bør vurderes. Selv om ingen strukturell informasjon om de proteiner av interesse er nødvendig, har topologien til å være kjent når man arbeider med membran som strekker seg over proteiner. De fluorescerende proteiner har til å ligge i samme subcellulære rom eller vender den samme side av en membran for å tillate interaksjon. Naturligvis, ved analyse av proteiner som krever en N-terminal sekvensstyringen, bare en C-terminal-koden kan bli vurdert. Siden det er mulig at merkelappen vil hindre riktig målretting eller membran innsetting av proteinet av interesse er det tilrådelig å teste subcellulære lokalisering på forhånd, for eksempel ved å uttrykke et GFP-merket protein. Videre bør et negativt kontroll alltid inkluderes. I dette eksempelet ble generert vi en konstruksjon bare uttrykker SCFP C i cytosol. Imidlertid kan en hvilken som helst protein som antas ikke å samhandle bli brukt som en negativ kontroll. For å verifisere riktig uttrykk of de konstruerer, spesielt hvis ingen fluorescens er synlig, kan proteinekstrakter av infiltrert blader eller protoplaster bli utsatt for SDS-PAGE og protein uttrykk kan verifiseres med antistoffer rettet mot de respektive koder.
Fluorescent-signaler kan overvåkes enten i intakte blader eller isolerte protoplaster. Selv oppdagelse i hele blader er raskere, er signaler om mer raffinerte strukturer bedre visualisert i protoplaster. Dessuten er det meste epidermal cellene overvåket når man ser på hele bladet, som ikke inneholder kloroplaster. Derfor, når analysere chloroplast proteiner, er isolering av protoplaster tilrådelig.
Den store fordelen med teknikken er muligheten til å overvåke protein-protein interaksjoner i levende planteceller. Det er ikke noe behov for å bryte cellene og for å oppløseliggjøre membranproteinkomplekser, som det er tilfelle for eksempel i coimmunoprecipitation eksperimenter. Dessuten er anvendelsen enkel, siden de eneste nødvendige materialer er vektorene, agrobacteria og et standard fluorescensmikroskop (selv om høyere kvalitet blir oppnådd med en konfokal laser scanning mikroskop). I motsetning til in vitro-pull-down-forsøk med rekombinante proteiner, som bare tillater påvisning av en interaksjon hvis begge proteiner er kommunisere direkte, kan BiFC også detektere proteinkomplekser som krever ekstra, endogene proteiner tilstede i cellen. Men dette betyr også at BiFC gir ingen beviser for en direkte protein-protein interaksjon, som alltid må være verifisert av andre teknikker. Dessuten, på grunn av overekspresjon av sterke promotorer uspesifikke interaksjoner kan oppstå, som må utelukkes ved hjelp av egnede negative kontroller. For dette formål et protein som ikke er forutsagt til å interagere med proteinet av interesse, men oppholder seg i samme rom, eller konstruerer mangler protein-protein interaksjon domener bør brukes. I tillegg ble en fortynningsrekke av byttedyr cDNA med en noninteracting cDNA samt observasjon av fluorescens på en tidsavhengig måte etter transformasjon kan bidra til å bekrefte resultatene. For å sikre diskriminering av sanne fluorescerende signaler og gjenstander de BiFC signalene skal kvantifiseres, og satt inn i forhold til et annet uttrykt fluorescerende protein, for eksempel et markørprotein 7,8. En annen ulempe med den BiFC metode er, at interaksjonene av de proteiner kan også hindres sterisk ved de forholdsvis store fluorescerende koder.
Anvendelse av Agrobacterium-formidlet transformasjon i andre planter (f.eks Arabidopsis) er begrenset, men det er mulig å transformere den plasmid-DNA direkte enten i Arabidopsis isolerte protoplaster, eller for å transformere celler ved bruk av en partikkelpistol. Imidlertid bør plasmid-DNA isoleres ved hjelp av en MAXI Kit, siden det må være sterkt konsentrert og så ren som mulig for protoplast transformasjon. Et annet problem vi observed grunn av høy uttrykk for målproteiner var uspesifikk aggregering i cytosol, spesielt når du arbeider med mitokondrie membran proteiner. Dette problemet kan løses ved biolistic transformasjon av løk celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Jürgen Soll for nyttige diskusjoner og Chris Carrie for kritisk lesing av manuskriptet. Dette prosjektet ble finansiert av DFG og Fonds der chemischen Industrie (tilskudd tall SFB 1035, prosjekt A04 til SS og Do 187/22 til RS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp. |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
