Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Published: March 9, 2014 doi: 10.3791/51327
Automatic Translation
1, 1
1Department Biologie I, Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität, München

Summary

Bildning av protein-komplex in vivo kan visualiseras genom bimolekylära fluorescens komplementering. Interaktionspartner är fuserade till komplementära delar av fluorescerande taggar och uttrycktes transient i tobaksblad, vilket resulterar i en rekonstituerad fluorescerande signal vid närhet av de två proteinerna.

Abstract

Många proteiner interagera transient med andra proteiner eller integreras i multiproteinkomplex för att utföra sin biologiska funktion. Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) är en in vivo-metod för att övervaka sådana interaktioner i växtceller. I den presenterade protokollet de undersökta kandidat proteiner smält till kompletterande halvor av fluorescerande proteiner och respektive konstruktioner introduceras i växtceller via Agrobacterium-medierad omvandling. Därefter är de proteiner som uttrycktes transient i tobaksblad och de återställda fluorescerande signalerna kan detekteras med ett konfokalt lasersvepmikroskop i intakta celler. Detta gör inte bara visualisering av interaktionen, utan även den subcellulära lokaliseringen av de protein-komplex kan bestämmas. För detta ändamål kan markörgener som innehåller en fluorescerande taggen samuttrycks tillsammans med BiFC konstruktioner sålunda visualisera cellulära strukturer såsom than endoplasmatiska retiklet, mitokondrier Golgi-apparaten eller plasmamembranet. Den fluorescerande signal kan övervakas, antingen direkt i epidermala bladceller eller i enkelprotoplaster, vilka lätt kan isoleras från de transformerade tobaksblad. BiFC är idealisk för att studera protein-proteininteraktioner i deras naturliga miljö i den levande cellen. Dock måste det anses att uttrycket måste drivas av starka promotorer och att interaktionspartners modifieras på grund av fusion av de relativt stora fluorescens-taggar, som kan påverka interaktionen mekanismen. Icke desto mindre är BiFC ett utmärkt komplement till andra vanligen tillämpade metoder undersöker protein-proteininteraktioner, såsom coimmunoprecipitation, in vitro-pull-down assays eller jäst-två-hybrid-experiment.

Introduction

Att studera bildningen av proteinkomplex och deras lokalisering i växtceller in vivo är nödvändig för att undersöka cellulära nät, signal-och metaboliska processer. BiFC tillåter visualisering av protein-proteininteraktioner i sin naturliga miljö direkt i levande växtcell 1-5.

I BiFC närmar komplementering av två icke-fluorescerande N-och C-terminala fragment av ett fluorescerande protein leder till en rekonstituerad fluorescerande protein. Fragment av många olika fluorescerande proteiner har använts för att detektera protein-interaktioner, t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP) kromoforen som är kemiskt bildad av tre distinkta rester 6. Fluorescerande proteiner kan halveras inom en slinga eller SS-strängen för att resultera i de två icke-fluorescerande fragment, vilka kan vara kondenserade till båda proteinerna av intresse. Analysen kan användas för att upptäcka interaktioner i någon subcellulär fack fyrant på något aerobiskt växande organism eller celler som kan modifieras genetiskt för att uttrycka fusionsproteinerna. Om de två proteinerna komma i omedelbar närhet inom cellen, är fluorescens rekonstitueras och kan övervakas genom mikroskopi utan tillsats av exogena fluoroforer eller färgämnen 3.

Tobak (Nicotiana benthamiana) har visat sig vara en lämplig modellorganism för att visualisera samspelet av växtproteiner, eftersom proteiner lätt kan uttryckas genom att använda Agrobacterium-medierad omvandling av tobaksbladen med de genererade konstruktioner. Agrobakterier använda en s.k. Ti-plasmid (tumörinducerande) som kodar för enzymer som förmedlar transduktion av den intressanta genen i växtceller. BiFC är väl tillämplig för lösligt såväl som för membranproteiner inom samtliga cellulära avdelningar och har framgångsrikt använts under de senaste åren för att identifiera interagerande proteiner in vivo såväl som för att analysera interaktionsställeninom proteinerna 7-9. Vid uttryck av de introducerade generna, kan interaktionen mellan de fluorescerande proteinerna visualiseras direkt i bladen, som är lämplig för större cellulära strukturer, såsom det endoplasmatiska retiklet (ER), plasmamembranet eller kloroplaster. Men för att övervaka lokalisering i mer förfinade strukturer, till exempel, kloroplasten höljet, är det lämpligt att visualisera fluorescensen i protoplaster isolerade från transformerade tobaksblad. En uppsättning BiFC vektorer innehållande antingen en C-terminal eller N-terminal fluorescerande tagg måste användas för BiFC tillvägagångssätt i växter 10. Den nedan beskrivna protokollet användes för att studera växelverkan mellan cytosoliskt värmechockprotein 90 (HSP90) med tetratricopeptide repeat (RTB) domän som innehåller dockning proteiner Toc64 och AtTPR7 bor i kloroplasten yttre kuvertet och det endoplasmatiska nätverket, respektive 11-13. För detta ändamål var HSP90 fuserad till CtPlint del av SCFP (SCFP C). Taggen var N-terminalt sammansmält med kaperon för att säkerställa tillgängligheten av den C-terminala MEEVD bindande motivet av HSP90 till klämtyp TPR domäner. Parallellt var den N-terminala delen av Venus (Venus N) sammansmält med de cytosoliska domänerna av TPR domän innehållande dockning proteiner Toc64 och AtTPR7, respektive. Som en negativ kontroll vi klonat den lösliga C-terminala delen av SCFP C enbart som bor i cytosolen och är därför en lämplig kontroll.

De fluorescerande taggarna i de studerade proteinerna måste möta samma cellulära utrymmet för att tillåta närhet och därmed beredning av fluorescerande signal. För att bestämma lokaliseringen av den rekonstituerade fluorescerande signal ett markörprotein sammansmält med en annan fluorescens tagg kan samtransformeras för att demonstrera den subcellulära lokaliseringen av interaktionen. En ER markörprotein fuserat till mCherrry förvandlades samtidigt ifallet av ER belägen AtTPR7 14. Den autofluorescens av klorofyll gjorde som kloroplast markör vid Toc64. Genom att detta inte bara interaktionen av Toc64 och AtTPR7, respektive, med den cytosoliska HSP90 chaperone in vivo kan övervakas direkt i tobaksbladen, utan också av den subcellulära lokaliseringen av samverkan kan undersökas.

BiFC är väl lämpad som ett komplement till andra metoder som studerar protein-proteininteraktioner. Jämfört med coimmunoprecipitation eller i rullgardins vitro experiment, till exempel, finns det inga specifika antikroppar måste finnas tillgängliga för proteinerna av intresse, och proteinerna måste inte uttryckas rekombinant in vitro, vilket kan vara en utmaning, särskilt för membranproteiner. Dessutom även transienta interaktioner kan övervakas med hjälp BiFC, eftersom proteinerna fångas genom interaktionen av de fuserade fluorescerande taggar 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transformation av BiFC Konstrukt i Agrobacteria

  1. Kloning av BiFC konstruktioner
    1. Amplifiera genen av intresse från en lämplig mall med användning av oligonukleotider som innehåller flankerande attB-ställen. Utför en PCR med hjälp av en korrekturläsning polymeras. Adapt längden av härdningssteget med konstruktions primerkombination och längden av förlängningssteg enligt den fragmentstorlek. Kontrollera den PCR-produkt genom agarosgelelektrofores och rena den genom att använda ett PCR Clean-up Kit.
    2. Utför BP reaktion med det erhållna fragmentet och posten vektorn med hjälp av en BP rekombinas. Blanda 15-150 ng av attB-PCR-produkten med 150 ng av posten vektorn, tillsätt 2 l av BP rekombinas och fyll upp med TE-buffert till en total volym på 8 pl. Inkubera reaktionsblandningen under 1 timme vid rumstemperatur och stoppa reaktionen genom tillsats av 2 | il proteinas K under 10 min vid 37 ° C.
    3. Förvandla hela reaktionen i kompetent E. coli DH5a, Celler och screena de erhållna kolonierna genom koloni-PCR för korrekt insättning av DNA-fragment i vektorn. DNA-sekvensering av de positiva plasmiderna utförs för att verifiera frånvaron av mutationer.
    4. Använd den erhållna entryklonen för LR rekombination med lämplig destination vektorn med hjälp av en LR rekombinas. Blanda 50-150 ng av posten vektorn med 150 ng av destinations vektorn, tillsätt 1 l LR rekombinas och fyll upp med TE-buffert till en total volym av 5 fil. Inkubera reaktionsblandningen under 1 timme vid rumstemperatur och stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 | il proteinas K under 10 min vid 37 ° C.
    5. Omvandla hela reaktionen in i kompetenta E. coli DH5a-celler och skärmen erhållna kolonier genom koloni-PCR för korrekt insättning av DNA-fragment in i vektorn. DNA-sekvensering är inte nödvändigt i detta steg.
    6. Isolera plasmid-DNA med en plasmid mini-kit för att säkerställa en hög grad av renhet.
  2. Beredning av kemiskt kompetent Agrobacteria (stam AGL 1, Rifampicin och Carbenicillin motstånd)
    1. Streak ut Agrobacteria från en stamkultur och växa i 24 timmar vid 28 ° C.
    2. Inokulera 5 ml LB-medium med en enda koloni och inkuberas över natten vid 28 ° C.
    3. Inokulera 50 ml LB-medium med 2 ml av övernattskultur och växa under ca 4 h vid 28 ° C till en OD 600 av 1,0.
    4. Centrifugera cellerna vid 3000 x g under 15 min vid 4 ° C och återsuspendera pelleten i 1 ml sterilt iskall CaCl2 (10 mM). Håll celler på is efter detta steg.
    5. Förbered alikvoter (100 | il) av de celler, fryst omedelbart i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.
  3. Omvandling av kemiskt kompetent Agrobacteria
    1. Tina en alikvot av kompetenta AGL 1 celler på is. Lägg 1-2 ^ g av plasmid-DNA till cellerna. Inkubera i 5 minuter på is, 5 min i flytande kväve och 5 min vid 37 ° C. Addera 600 ^ il LB-medium till cellerna och erkummel vid 650 rpm i 4 timmar vid 28 ° C.
    2. Centrifugera cellerna under 1 min vid 8000 x g och kasta supernatanten. Återsuspendera pelleten i 50 | il av den återstående LB-medium och plattan på LB-plattor innehållande lämpliga antibiotika. Förslut plattorna och inkubera under 2 dagar vid 28 ° C. Skärm kolonier med avseende på närvaron av plasmiden genom koloni-PCR.
    3. Inokulera en positiv koloni i 5 ml LB-medium innehållande lämpliga antibiotika och inkubera vid 28 ° C över natten. Blanda 500 | il av den över natten odlade kulturen med 500 | il 50% steriliseras glycerol och frys vid -80 ° C.
    4. Inokulera Agrobacteria i LB-medium som innehåller lämpliga antibiotika direkt från glycerol lager för övergående transformation av tobaksblad.

2. Transient Transformation av tobaksblad

  1. Agrobacteria tillväxt
    1. Förbered följande stamlösningar: acetosyringone (150 mM, lös upp i 70% EtOH), lagra som alikvoter vid -20 ° C. MES / KOH (0,1 M), pH 5,7, förvara vid 4 ° C (sterilt filter genom ett 0,2 um filter för att förhindra bakterietillväxt under längre lagring), MgCl2 (1 M) lager, lagra vid RT.
    2. Inokulera 10 ml LB-medium innehållande lämpliga antibiotika med 50 ul av AGL 1 glycerolförrådskultur innehållande plasmiden av intresse i ett sterilt 50 ml rör och inkubera vid 28 ° C under åtminstone 24 h skakning vid 190 rpm tills en OD 600 mellan 1,0 -2,0 nås.
    3. Centrifugera bakterier vid 3000 xg under 15 minuter. Suspendera pelleten i nybakade infiltration medium [MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, acetosyringone (150 ^ M)] och justera suspensionen till en OD 600 på 1,0.
    4. Inkubera Agrobacteria-celler i en överliggande skakare under 2 h i mörker. Cellerna kan därefter användas för infiltration.
  2. Infiltration av tobaksblad
    1. Använd trevecka gammal tobak (Nicotiana benthamiana) växter. Välj flera äldre blad för infiltration.
    2. Blanda lika stora volymer av Agrobacteria bärande konstruktionerna av intresse (3 ml vardera). Ta en 5 ml spruta utan nål för infiltration. Infiltrera cellsuspensionen försiktigt in i tobaksblad genom att trycka på sprutans på undersidan av bladen på flera ställen.
    3. Vattna blommorna och lämna dem i mörker i två dagar.

3. Protoplast Framställning

Protoplast beredning av tobaksblad anpassades från Koop et al. 16 och något modifierad.

  1. Buffert beredning
    1. Förbered F-PCN-medium: Makro salter [KNO3 (1012 pg / ml), CaCl2 • 2 H2O (440 pg / ml), MgSO 4 • 7 H2O (370 pg / ml), KH 2 PO 4 ( 170 pg / ml), NH 4-succinat [(20 mM; framställa en 2 M förråds solution (succinat (236 | ig / ml) och NH4CI (106 pg / ml), justera till pH 5,8 för att upplösa)], Micro-salter [EDTA-Fe (III) x Na-salt (40 pg / ml), KJ (0,75 | ig / ml), H 3 BO 3 (3 pg / ml), MnSO 4 • H2O (10 ^ g / ml), ZnSO 4 • 7 H2O (2 pg / ml), Na 2 MoO 4 • 7 H2O (0,25 pg / ml), CUSO4 • 5H 2 O (0,025 | ig / ml), COCl 2 • 6 H2O (0,025 pg / ml)], MES (390 | ig / ml), glukos (ca 80 | ig / ml) osmolaritet 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Lagra i alikvoter vid -20 ° C.
    2. Förbered F-PIN-medium: Alla ingredienser som F-PCN men i stället för glukos användning sackaros (ungefär 110 | ig / ml), osmolaritet 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Lagra i alikvoter vid -20 ° C.
    3. Förbered W5 medium: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolaritet 550 till 580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Lagra vid 4 °, K (steril filtrering genom ett 0,2 pm filter för att förhindra bakterietillväxt under längre lagring).
    4. Bered färsk enzymlösning för protoplastisolering (0,1 g cellulas, 0,03 g macerozym i 10 ml F-PIN). Inkubera lösningen vid 55 ° C under 10 minuter och kyl till rumstemperatur. Addera 100 pl av 10% BSA till 10 ml lösning.
  2. Isolering av protoplaster
    1. Placera en infiltrerade blad i en petriskål och tillsätt färsk enzymlösningen. Använd ett nytt rakblad för att skära bladet till ca 0,5 cm 2 stora bitar. Överför bladstavar med enzymlösningen i en vakuuminfiltrations kolv och vakuum infiltrera i cirka 20 sekunder tills luftbubblor ur bladen (frigör vakuum mycket noga).
    2. Skaka under 90 minuter vid 40 rpm i mörker.
    3. Släpp-protoplaster genom skakning under 1 min vid 90 rpm. Filtrera lösningen genom gasväv (100 | iM) till ett 15 ml centrifugrör (rund botten). Overlay protoplastlösning med 2 ml F-PCN-buffert och centrifugera i 10 min vid 70 xg (långsam acceleration och retardation) vid rumstemperatur.
    4. Intakta protoplasts ansamlas vid gränsytan mellan enzymlösningen och F-PCN. Ta en bred öppning 1 ml pipett för att överföra de intakta protoplaster i ett nytt centrifugrör och fyll upp med W5 buffert. Centrifugera i 2 min vid 100 xg (långsam acceleration och retardation) för pelletering av protoplaster.
    5. Avlägsna supernatanten försiktigt genom att använda en pipett och återsuspendera pelleten i cirka 200 ^ il W5-buffert, beroende på mängden av protoplaster.
    6. Använd alltid bred öppning tips för att förhindra bristning av intakta protoplaster.

4. Laserskanning Mikroskopi

  1. Provberedning
    1. Klistra två små remsor av tätningsmassa runt ett objektglas (2 cm från varandra). Placera 20 | il protoplastlösning mellan remsorna och noggrant placera ett täckglasovanpå. De tätningslister ser till att protoplastema inte klämd av täckglaset.
    2. För den totala bladprover skär en 1 cm bit från löv och placera den på ett objektglas med undersidan av bladet uppåt. Lägg ca 30 l H2O, placera ett täckglas ovanpå och fixa det tätt med tejp på båda sidor.
  2. Konfokala imaging och mikroskop inställningar
    1. Imaging utförs med en konfokala laserskanning mikroskop från Leica, typ: TCS SP5. För förstoring använda ett objektiv (HCX PL APO CS) med en magnitud på 63X med glycerol som bildalstringsmedium. Ställ den numeriska bländaröppningen till 1,3. Använd Leica Application Suite / Advanced Fluorescens programvara för utvärdering (se Kompletterande data S1).
    2. Ställ Argon laser till 30% och lasereffekten vid 488 nm till en stödnivå på 18% för att övervaka den beredda BiFC signalen vid 515 nm och ställa en PMT detektor utsläpp bandbredd 495-550. För att övervaka klorofyll autofluorescens ställa en andra PMT detektor utsläpp bandbredd 650-705.
    3. Om du vill övervaka mCherry signal använder HeNe 561 laser, ställa in intensiteten av laser 561-18% och utsläppen bandbredden för en tredje PMT detektor 587-610.
    4. Se till att bilder på alla PMT detektorkanaler är tagna med samma inställningar gain (förstärkning bör vara mellan 800-900 att utesluta bakgrundssignaler).
    5. Ta bilder i ett format bredd / höjd på 1024 x 1024 pixlar med en skanningshastighet på 100 Hz.
    6. För Z-stackings använder ett maximalt avstånd av 0,5 nm mellan varje stapel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta exempel använde vi BiFC metod för att följa interaktionen av den cytosoliska molekylär chaperon HSP90 med membrandockningsproteiner AtTPR7 och Toc64. AtTPR7 är en del av Sec translocon och interagerar med cytosoliska chaperoner, som eventuellt levererar sekretoriska preproteins för posttranslationell translokation till ER-membranet. Likaså Toc64 på kloroplasten ytterkuvertet agerar i post-translationell import genom att ta emot HSP90 tillhörande kloroplast preproteins. Båda proteiner innefattar ett cytosoliskt exponerad TPR domän, som medierar interaktion med den C-terminala MEEVD motivet av HSP90.

Proteiner klonades genom särskilda rekombinaser i lämpliga destinations vektorer fusing RTB domän innehållande dockning proteiner till Venus N, så att den fluorescerande taggen är fäst till den cytosoliska domänen och spelar sålunda inte hindra målinriktning och membraninföringen av proteinerna. I fallet med HSP90, SCFP C (fig 1 och 2).

AtTPR7 och HSP90 samtransformerades med en ER markör (mCherry) för att kontrollera lokaliseringen av proteinkomplex. Fluorescensen övervakades i intakta blad med ett laserscanningsmikroskop. Som en kontroll SCFP C enbart, som är belägen i cytosolen (som HSP90), uttrycktes tillsammans med AtTPR7 och ER markör. Flera blad kontrollerades för fluorescens och bilder togs med identiska inställningar mikroskop. I vår erfarenhet en typisk signal bör synas med förstärkningsinställningar vid 800-900, medan den negativa kontrollen bör bara visar mycket liten bakgrundsfluorescens med dessa inställningar (Figur 3). En rekonstruerad signal för Venus N-AtTPR7 tillsammans med SCFP C-HSP90 vid 515 nm övervakades överlappning med ER markör. Ingen signal för Venus N-AtTPR7 och den negativa kontrollen SCFP C kunde observeras.

I fallet med Toc64 och HSP90 uttryck, liksom Toc64 och SCFP C erhölls protoplaster isolerades från infiltrerade tobaksblad, eftersom mikroskopiska bilder av hela lämnar den exakta lokaliseringen är svår att bestämma, även om fluorescens är redan synlig (fig. 4 och 5). En signal vid 515 nm återställdes uttrycker Toc64-Venus N tillsammans med SCFP C-HSP90 på ​​kloroplast kuvertet, vilket kunde detekteras som ringformiga strukturer som omger kloroplasterna. Som ovan kontrollen fotograferades med identiska inställningar mikroskop och visade inte en fluorescens vid 515 nm.

Figur 1
Figur1. Kloningsförfarandet av BiFC konstruktioner. Generna av intresse amplifierades med oligonukleotider flankerade av attB-ställen för att tillåta BP rekombination i en ingångsvektor med attP-ställen, vilket ersätter den ccdB-genen i vektorn. Därefter posten vektorn rekombinerades med lämpliga destinations vektorer med hjälp av en LR rekombinas. Omvandling av dessa konstruktioner i tobaksblad tillåter uttryck av proteiner smält till de delade fluorescerande proteiner och taggar för påvisande av antikroppar. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Schematisk presentation av de proteiner som uttrycks i BiFC experiment. Venus N ärkopplad till de cytosoliska delar Toc64 eller AtTPR7 bor i kloroplasten och ER, respektive. HSP90 är N-terminalt smält till SCFP C, vilket möjliggör växelverkan mellan TPR domänerna av Toc64 och AtTPR7 med HSP90 C-terminalen. SCFP C enbart uttrycks i cytosolen som en kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. BiFC med AtTPR7 och HSP90 visualiseras i tobaks epidermal bladceller. Venus N-AtTPR7 och SCFP C-HSP90 samtransformerades med ER mCherry markör (mitten panel) och övergående uttryck i tobaksblad. Som kontroll Venus N-AtTPR7 ades samtransformerades med SCFP Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. BiFC med Toc64 och HSP90 visualiseras i tobaks epidermal bladceller. Toc64-Venus N och SCFP C-HSP90 transient uttryckt i tobaksblad. Som en kontroll Toc64-Venus N ades samtransformerades med SCFP C ensam (bottenpaneler). Färdigberedd fluorescens övervakades vid 515 nm (till vänster). Överlagring av SIGnal vid 515 nm och klorofyll autofluorescens visas (högra panelen). Klorofyll autofluorescens övervakas vid 480 nm. Skala barer:. 10 mikrometer Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. BiFC med Toc64 och HSP90 visualiseras i tobaksprotoplaster. Toc64-Venus N och SCFP C-HSP90 transient uttryckt i tobaksblad. Som en kontroll Toc64-Venus N ades samtransformerades med SCFP C ensam (bottenpaneler). Färdigberedd fluorescens övervakades vid 515 nm (till vänster) i isolerade protoplaster. Överlagring av signalen vid 515 nm och den klorofyll autofluorescens visas (höger panel). Klorofyll autofluorescens övervakas vid 480 nm. Skala barer:. 10 mikrometer Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vid planeringen av en BiFC experiment flera punkter bör beaktas. Även om ingen strukturell information om de proteiner av intresse krävs, har topologin att vara känd när man arbetar med membranöverbryggande proteiner. De fluorescerande proteinerna måste bo i samma subcellulära fack eller står inför samma sida av ett membran för att möjliggöra samverkan. Naturligtvis, när analysera proteiner som kräver en N-terminal målsökningssekvensen, endast en C-terminal tag kan övervägas. Eftersom det är möjligt att taggen stör korrekt målinriktning eller membran insättning av proteinet av intresse är det tillrådligt att testa subcellulär lokalisering i förväg, till exempel, genom att uttrycka en GFP-märkt protein. Dessutom bör en negativ kontroll alltid ingå. I detta exempel genererade vi en konstruktion som endast uttrycker SCFP C i cytosolen. Emellertid kan vilket som helst protein, som inte förväntas interagera användas som en negativ kontroll. För att verifiera korrekt uttryck of konstruktionerna, speciellt om ingen fluorescens är synlig, kan proteinextrakt av infiltrerade blad eller protoplaster utsättas för SDS-PAGE och proteinexpression kan verifieras med antikroppar riktade mot de respektive etiketter.

Fluorescerande signaler kan övervakas antingen i intakta blad eller isolerade protoplaster. Trots att upptäcka i hela blad är snabbare, är signaler om mer förfinade strukturer bättre visualiseras i protoplaster. Dessutom är oftast epidermalceller övervakas när man tittar på hela blad, som inte innehåller kloroplaster. Därför, när man analyserar kloroplast proteiner, är isolering av protoplaster tillrådligt.

Den stora fördelen med tekniken är möjligheten att övervaka protein-proteininteraktioner i levande växtceller. Det finns inget behov för att bryta celler och för att solubilisera membranproteinkomplex, som är fallet till exempel i coimmunoprecipitation experiment. Dessutom är enkel tillämpningeftersom de enda nödvändiga material är de vektorer, agrobakterier och en standardfluorescensmikroskop (även om högre bildkvalitet uppnås med ett konfokalt lasersvepmikroskop). Till skillnad från in vitro-pull-down-analyser med rekombinanta proteiner, som endast tillåter detektering av en interaktion, om båda proteinerna interagerar direkt, kan BiFC också detektera proteinkomplex som kräver ytterligare och endogena proteiner som är närvarande i cellen. Men det betyder också att BiFC ger inte bevisa ett direkt protein-proteininteraktion, som alltid måste verifieras av andra tekniker. Dessutom, på grund av överuttryck av starka promotorer ospecifika interaktioner kan inträffa, som måste uteslutas genom lämpliga negativa kontroller. För detta ändamål ett protein som inte är förutspådda att interagera med proteinet av intresse, men som är bosatt i samma fack, eller konstruktioner som saknar de protein-proteininteraktionsdomäner skall användas. Dessutom har en utspädningsserie av bytet cDNA med en icke-interaktiv cDNA samt observation av fluorescens i ett tidsberoende sätt efter transformation kan bidra till att validera resultaten. För att säkerställa att diskriminering av sanna fluorescerande signaler och artefakter de BiFC signaler skall kvantifieras och fastställda in i förhållande till ett annat uttryckt fluorescerande protein, exempelvis ett markörprotein 7,8. En annan nackdel med den BiFC metoden är, att växelverkan av proteinerna också kan hindras steriskt genom de relativt stora fluorescerande etiketter.

Tillämpning av Agrobacterium-förmedlad transformation i andra växter (exempelvis Arabidopsis) är begränsad, är det emellertid möjligt att transformera plasmiden DNA direkt antingen i isolerade Arabidopsis protoplaster eller att transformera celler med hjälp av en partikelkanon. Emellertid bör plasmid-DNA isoleras med användning av en Maxi Kit, eftersom det borde vara starkt koncentrerade och så ren som möjligt för protoplasttransformation. Ett annat problem som vi observed grund av hög expression av målproteinerna var ospecifik aggregation i cytosolen, speciellt när man arbetar med mitokondriella membranproteiner. Detta problem kan övervinnas genom biolistisk transformation av lök celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi vill tacka Jürgen Soll för bra diskussioner och Chris Carrie för kritisk läsning av manuskriptet. Projektet har finansierats av DFG och Fonds der chemischen Industrie (bidrag nummer SFB 1035, projekt A04 till SS och gör 187/22 till RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone Sigma-Aldrich D134406 Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10 Serva 16419 from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10  Serva 28302 from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609-250
pDEST-GWVYNE Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  2. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
  3. Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
  4. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  5. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
  6. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  7. Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
  8. McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
  9. Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
  10. Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
  11. Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
  12. Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
  13. Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
  14. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
  15. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  16. Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).

Tags

Växtbiologi Tetratricopeptide upprepa domän förkläde kloroplaster endoplasmatiska retiklet HSP90 Toc komplex Sec translocon BiFC
Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schweiger, R., Schwenkert, S.… More

Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves. J. Vis. Exp. (85), e51327, doi:10.3791/51327 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter