Summary
蛋白质复合物在体内的形成可以通过双分子荧光互补可视化。合作伙伴的互动融合，以荧光标记的互补部件和瞬时表达烟叶，导致后两种蛋白质的接近改组后的荧光信号。
Abstract
许多蛋白质相互作用的瞬时与其他蛋白质或集成到多蛋白复合物以发挥其生物学功能。双分子荧光互补（附设）是一种体内方法来监控在植物细胞中这种相互作用。在所提出的协议所研究的候选蛋白融合至荧光蛋白互补的两半，并在各自的结构是通过农杆菌介导的转化导入植物细胞。随后，将蛋白质瞬时表达在烟草叶和还原的的荧光信号可以在完整的细胞共聚焦激光扫描显微镜来检测。这允许相互作用本身不仅可视化，而且还蛋白复合物的亚细胞定位可以被确定。为此目的，含有荧光标记的标记基因可以一起附设构建体共表达，从而可视化的细胞结构，如叔他面内质网，线粒体，高尔基体或质膜。荧光信号可以直接在表皮叶细胞或单原生质体，可从转化的烟草叶容易地分离出被监控。附设非常适合于活细胞内研究在其自然环境中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。然而，它必须被认为表达必须通过强启动子来驱动，而相互作用伙伴由于融合了相对大的荧光标记，这可能与交互机制干扰的修改。然而，附设是一个很好的补充方法，其它常用的方法研究蛋白质-蛋白质相互作用，如免疫共沉淀， 体外下拉测定法或酵母双杂交实验。
Introduction
研究蛋白质复合物的形成和它们在植物细胞在体内的定位是必不可少的探讨蜂窝网络，信号和代谢过程。附设允许的蛋白质-蛋白质相互作用可视化直接在活体植物细胞1-5在他们的自然环境。
在附设接近的荧光蛋白引到一个重组荧光蛋白2非荧光性的N-和C-末端片段的互补。许多不同的荧光蛋白的片段已被用于检测蛋白质相互作用， 例如绿色荧光蛋白（GFP），其中由三种不同的残基6化学键形成的发色团。荧光蛋白可以在循环或β-链以产生两个非荧光片段可以被融合到感兴趣的两种蛋白质内减半。该测定可用于检测任何亚细胞compartme相互作用nt的任何需氧生长的生物体或细胞，可以进行基因修饰以表达融合蛋白。如果这两种蛋白进入细胞内的接近，荧光被重构，并且可以通过显微镜，而不添加外源荧光团或染料3来监控。
烟草（ 本氏烟 ）已被证明是方便的模型有机体可视化植物蛋白质的相互作用，因为蛋白质可以容易地通过利用烟叶与所产生的构建体农杆菌介导的转化来表达。农杆菌使用一个所谓的Ti质粒（肿瘤诱导）编码介导感兴趣的基因转导到植物细胞中的酶。附设是很好适用于水溶性以及对所有细胞区室中的膜蛋白，并已成功地用于在过去几年，以确定在体内相互作用的蛋白质，以及对分析相互作用位点内蛋白质7-9。待导入的基因表达，荧光蛋白的相互作用，可以直接在叶片可视化，这是适合于较大的蜂窝结构，如内质网（ER），在质膜或叶绿体。然而，为了监视在更精细的结构定位，例如，叶绿体被膜，最好是可视化的荧光在原生质体从转化的烟草叶中分离。一组含有任一C-末端或N-末端的荧光标记有用于在植物10的附设方法附设载体。在下文中描述的协议被用来研究细胞内的热休克蛋白90（HSP90）的相互作用与三十四肽重复含蛋白质对接Toc64和AtTPR7居住在叶绿体外封套和内质网，分别11-13（TPR）结构域。为了这个目的，HSP90融合到的CtSCFP（SCFP C）的erminal一部分。标签上还有N端融合到伴侣，以确保HSP90的C-末端MEEVD结合基序钳型TPR结构域的可访问性。与此同时，金星（金星N）的N-末端部分融合到含有蛋白质对接Toc64和AtTPR7分别TPR结构域的胞内域。作为阴性对照，我们克隆SCFP 的C可溶性C-末端部分完全驻留在细胞质中，因此适当的控制。
所研究的蛋白质的荧光标记要面对同样的细胞区室，让靠近，从而荧光信号的重建。来确定重构的荧光信号稠合到不同荧光标签标记的蛋白质可共转化来演示的相互作用的亚细胞定位的定位。融合到mCherrry一个ER标志物蛋白的同时转化案例位于AtTPR7 14急诊室的。叶绿素的自发荧光担任叶绿体标记的情况下Toc64的。通过这不仅Toc64和AtTPR7，分别与胞质HSP90分子伴侣的体内相互作用，可以直接在烟草叶片监测，但也相互作用的亚细胞定位可以进行调查。
附设很适合作为一种补充的方法来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的其它方法。相比于免疫共沉淀或体外下拉实验，例如，没有特异性抗体必须是可用于感兴趣的蛋白质，以及这些蛋白质没有被重组表达在体外 ，它可以是具有挑战性的，特别是对于膜蛋白。此外，也瞬时相互作用可以利用附设监视，因为蛋白质是由稠合的荧光标签15的相互作用捕获。
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Protocol
1。附设的转型构建农杆菌中
- 附设构建的克隆
- 使用含侧翼attB位站点寡核苷酸相应的模板扩增目的基因。执行使用校对聚合酶的PCR。适应的退火步骤来设计引物组合的长度，并根据片段大小的延伸步骤的长度。检查PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，并通过使用PCR清洁试剂盒纯化它。
- 执行与所获得的片段即BP反应，并用BP重组酶的入门载体。混合15-150纳克的attB位-PCR产物用150纳克的条目的向量，加入2微升的BP重组酶，并用TE缓冲液补满至8微升的总体积。在室温下孵育1小时，进行反应和终止反应，加入2微升蛋白酶K 10分钟，在37℃下
- 改变整个反应到感受态大肠杆菌 DH5α;细胞并筛选所得到的菌落PCR克隆为正确的插入的DNA片段插入载体中。的阳性质粒DNA测序进行验证的情况下的突变。
- 使用LR重组酶使用获得入门克隆进行LR重组与相应的目标向量。搭配50-150纳克入门载体与150毫微克的目标向量，加1微升的LR重组酶，并用TE缓冲液填补高达5微升的总体积。在室温下孵育1小时，进行反应和终止反应，加入1微升蛋白酶K 10分钟，在37℃下
- 改变整个反应成通过菌落PCR对正确插入的DNA片段到载体中获得的菌落感受态大肠杆菌DH5α细胞和屏幕。 DNA测序是没有必要在这一步。
- 分离质粒DNA，用质粒Mini试剂盒，以确保纯度的高度。
- 化学感受态农杆菌（制备菌株AGL1，利福平和羧苄青霉素抗性）
- 从A股文化连胜了农杆菌，并在28℃下生长24小时
- 接种5ml的LB培养基中单个菌落孵育过夜，在28°C。
- 接种50毫升LB培养基与2ml的过夜培养物，并在28℃生长约4小时，至OD 600为1.0。
- 离心将细胞以3,000 xg离心15分钟，在4℃，重悬沉淀于1ml灭菌的冰冷的CaCl 2（10毫米）。这一步后，细胞置于冰上。
- 制备的细胞的等分试样（100微升），在液氮中，并储存在-80℃下立即冷冻
- 化学感受态农杆菌转化
- 在冰上解冻胜任AGL1细胞的一个等分。加1-2微克质粒DNA到细胞中。孵育5分钟，在冰上5分钟，在液氮中和5分钟，在37℃下添加600μl的LB培养基中至细胞和s鳕鱼在650转4小时，在28°C。
- 离心细胞1分钟，在8000×g离心并弃去上清液。重悬沉淀中加入50μl的剩余的LB培养基和板在含有适当抗生素的LB平板上的。密封板，并培育2天在28°C。屏幕菌落的质粒通过菌落PCR的存在。
- 在含有适当抗生素5ml的LB培养基中接种一个正殖民地和孵化在28℃下过夜。混合500微升过夜培养物用500μl的50％无菌甘油冷冻于-80℃。
- 接种在LB培养基中含有直接从甘油库存烟叶瞬时转化合适的抗生素农杆菌。
2。烟叶瞬时转化
- 农杆菌增长
- 准备下列储备液：乙酰丁香酮（150毫米，溶于70％乙醇），存储作为分装于-20°C。 MES / KOH（0.1M），pH值5.7，在4℃（通过0.2微米的过滤器，以防止在较长的储存细菌生长无菌过滤器）店， 氯化镁 （1米）的股票，在室温下储存。
- 接种含有适当抗生素用50μl含在无菌50ml管中感兴趣的质粒中的AGL1甘油储用培养10毫升LB培养基中，孵育在28℃下至少24小时，振摇，在190转，直到OD 600为1.0 -2.0为止。
- 离心机菌在3000×g离心15分钟。重悬沉淀在新鲜的浸润培养基[MgCl 2的（10毫米），MES / KOH（10毫米），pH值5.7，乙酰丁香酮（150μM）]和调整悬浮液的OD 600为1.0。
- 在孵育的开销摇床2小时在黑暗的农杆菌细胞。细胞然后可以用于浸润。
- 烟叶渗透
- 使用三个周龄烟草（ 烟草本塞姆氏 ）植物。选择几种老叶渗透。
- 混合携带感兴趣的构建体（各3ml）中的农杆菌等体积。取5毫升的无针注射器进行渗透。通过按压在叶片上的底部侧的注射器在几个地方仔细渗入细胞悬液到烟草叶子。
- 给植物浇水，让他们在黑暗中两天。
3。原生质体的制备
烟叶原生质体的制备是改编自库普等人 16和稍作修改。
- 缓冲液配制
- 准备的F-PCN介质：宏观盐[KNO 3（1012微克/毫升），氯化钙2•2H 2 O（440微克/毫升），硫酸镁4•7H 2 O（370微克/毫升），KH 2 PO 4（ 170微克/毫升），NH4-琥珀酸酯[（20毫米;准备一个2M的股票溶胶ution（琥珀酸（236微克/毫升）与NH 4 Cl（106微克/毫升）中，调节pH至5.8以溶解）]，微盐[EDTA-铁（III）×钠-盐（40微克/毫升）， KJ（0.75微克/毫升），H 3 BO 3（3微克/毫升），硫酸锰4•H 2 O的（10微克/毫升），硫酸锌4•7H 2 O（2微克/毫升），钠2的MoO 4• 7H 2 O（0.25微克/毫升），硫酸铜4•5H 2 O（0.025微克/毫升），氯化钴2•6H 2 O（0.025微克/毫升）]，MES（390微克/毫升），葡萄糖（约80微克/ ml）的渗透压550毫渗透摩尔浓度，pH值5.8（KOH）。在储存分装于-20°C。
- 准备的F-PIN介质：所有成分为葡萄糖，而不是使用蔗糖（约110微克/毫升），渗透压550毫渗量，pH值5.8（KOH）的F-PCN但。在储存分装于-20°C。
- 准备W5介质：150 mM氯化钠，125毫米氯化钙2，5毫米氯化钾，2毫米的MES，渗透压550-580毫渗量，pH值5.7（KOH）。储存于4°C（通过0.2μm过滤器无菌过滤器，以防止在较长的储存细菌生长）。
- 准备原生质体分离（0.1克纤维素酶，在10毫升的F-PIN0.03克macerozym）新鲜酶液。孵育的溶液在55℃下进行10分钟并冷却至室温。加入100微升10％的BSA至10ml溶液。
- 原生质体的分离
- 将一个叶片渗透到培养皿，加入新鲜酶液。使用新的剃刀刃切叶成大约0.5 平方厘米大小的块。传输叶片与酶溶液放入真空渗透烧瓶和真空渗入约20秒，直到气泡从叶子出现（释放真空非常小心）。
- 振摇90分钟，40转在黑暗中。
- 在90 rpm振摇1分钟释放原生质体。通过纱布（100μM）过滤该溶液到15毫升的离心管（圆底）。 叠加后的原生质体溶液与2ml的F-PCN缓冲，离心，在70×g离心（慢加速和减速），在室温下10分钟。
- 完整的原生质体聚集在酶溶液和F-PCN接口。采取多种孔板的1毫升吸管尖端完整的原生质体转移到一个新的离心管中，并填写了W5的缓冲区。离心2分钟，在100 XG（缓慢加速和减速），以沉淀原生质体。
- 通过使用在约200微升W5缓冲吸管和重悬沉淀，这取决于原生质体的量小心取出上清液。
- 始终使用宽口提示，以防止完好的原生质体破裂。
4。激光扫描显微镜
- 样品制备
- 粘贴密封胶围绕一个载玻片两小片（相距2厘米）。将20微升的带之间的原生质体溶液，并小心地将玻璃盖在上面。密封条确保原生质体没有被盖玻璃被挤压。
- 对总叶样品切成1厘米的片从叶，并将其放置到与朝上叶子的底部侧的显微镜载玻片。加入约30微升H 2 O，放置在顶部玻璃盖和两侧胶带紧紧固定。
- 共聚焦成像和显微设置
- TCS SP5：成像与徕卡，类型共聚焦激光扫描显微镜进行。对于使用放大倍数的物镜（HCX PL APO CS）与63X幅度以甘油为成像介质。设定的数值孔径至1.3。使用徕卡应用套件/高级荧光软件进行评价（见补充资料S1）。
- 在488nm处设置的氩激光到30％，而激光功率的18％的强度来监控重构附设信号在515 nm和从495-550设为1的PMT探测器发射带宽。 为了监测叶绿素自发荧光从650-705集第二PMT探测器发射带宽。
- 来监视的mCherry信号使用氦氖激光器561中，设置激光的强度561〜18％，从587-610三分之一PMT检测器的发射带宽。
- 确保所有的光电倍增管检测器通道的照片是用相同的增益设置（增益应该是800-900之间排除背景信号）。
- 拍照1024 x 1024像素，100赫兹的扫描速度的幅面宽度/高度。
- 为Z型零件组使用的每个协议栈之间0.5μm的最大距离。
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Representative Results
在这个例子中，我们使用了附设法来监测细胞内分子伴侣的HSP90的膜对接蛋白AtTPR7和Toc64的相互作用。 AtTPR7是二段易位子的一部分，并与细胞内分子伴侣，其可能传送分泌前蛋白进行翻译后转运到ER膜相互作用。同样，Toc64在叶绿体外膜由接收HSP90相关的叶绿体前蛋白的作用在翻译后导入。两种蛋白包括细胞内露出TPR结构域，其介导的相互作用与HSP90的C-末端MEEVD动机。
蛋白通过特异性重组酶的方法克隆到合适的目的载体含有融合蛋白的对接金星N，确保该荧光标签附着到胞质结构域和不从而不妨碍蛋白质的靶向和膜插入的TPR结构域。在HSP90，SCFP 的C的情况下图1和图2）。
AtTPR7和HSP90共转化与ER标记（的mCherry），以验证该蛋白复合体的定位。荧光是在完整叶片用激光扫描显微镜监测。作为一个单独的控制SCFP C，这是位于细胞质中（如HSP90），是伴随着AtTPR7和内质网的标记表示。几片叶子被检查的荧光和照片拍摄具有相同的显微镜设置。根据我们的经验一个典型的信号应与在800-900增益设置可见，而阴性对照应该只显示非常轻微的背景荧光，这些设置（ 图3）。将复原信号金星的N-AtTPR7与SCFP C-HSP90在515 nm处一起进行了监测与ER标记重叠。无信号金星N-在TPR7与阴性对照SCFP C可说观察。
在Toc64和HSP90的表达，以及Toc64和SCFP 的C的情况下，原生质从渗透的烟草叶中分离的，因为在整个的显微图片叶的精确定位是难以确定的，尽管荧光已经是可见的（ 图4和5）。在515 nm处的信号被恢复了表达Toc64金星N一起用SCFP C-HSP90在叶绿体的信封，这可能被检测为周围的叶绿体环形结构。由于控制上述被拍到与相同的显微镜设置，并没有表现出荧光在515 nm处。
数字1。附设的克隆过程构建。感兴趣的基因被扩增的寡核苷酸由ATT B位点侧翼，允许BP重组与ATT P站点条目矢量，从而取代了载体内的CCDB基因。随后进入载体重组与使用的LR重组酶合适的目的载体。改造这些构造成烟叶允许融合到分裂的荧光蛋白，并标签为抗体检测蛋白质的表达。 点击这里查看大图。
图2。在表达附设实验的蛋白质示意图演示。金星N是耦合到Toc64或AtTPR7的胞浆部分居住在叶绿体和ER，分别。 HSP90是N-末端融合到SCFP C，使Toc64和AtTPR7的TPR结构域的相互作用与HSP90的C-末端。 SCFP单独的C表达在细胞质作为对照。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。附设有AtTPR7和HSP90可视化烟草叶表皮细胞。金星的N-AtTPR7和SCFP C-HSP90的共转化与ER的mCherry标记（中图）和瞬时表达的烟叶。作为对照金星的N-AtTPR7被共转化与SCFP
图4。附设有Toc64和HSP90可视化烟草叶表皮细胞。Toc64金星N和SCFP C-HSP90的瞬时表达烟叶。作为对照Toc64金星N的共转化与SCFP单独的C（下图）。重组荧光在515nm处（左图）进行监测。在SIG的叠加nal在515 nm和叶绿素自发荧光显示（右图）。叶绿素的自发荧光是在480nm处监测。比例尺：10微米请点击此处查看该图的放大版本。
图5。附设有Toc64和HSP90可视化烟草原生质体。Toc64金星N和SCFP C-HSP90的瞬时表达烟叶。作为对照Toc64金星N的共转化与SCFP单独的C（下图）。重组荧光在分离原生质体515纳米（左图）监控。在515 nm和叶绿素的自发荧光信号的叠加显示（右图）。叶绿素的自发荧光是在480nm处监测。比例尺：10微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
当规划一个附设实验几点应予以考虑。虽然对感兴趣的蛋白质没有结构信息是必需的，拓扑与跨膜蛋白质工作时是已知的。荧光蛋白必须驻留在同一个亚细胞区室或面对的膜，以允许相互作用的同一侧。自然地，分析这需要一个N-末端的定位序列的蛋白质时，只有一个C-末端标签可以考虑的。因为它是可能的标记干扰感兴趣的蛋白质，最好是预先测试的亚细胞定位，例如，通过表达GFP标记的蛋白的正确定位或膜插入。此外，应始终包含一个阴性对照。在这个例子中，我们只生成表达SCFP 下在胞质溶胶中的构建体。然而，预期不相互作用的任何蛋白质可以用作阴性对照。验证正确表达ØF中的构建体，特别是如果没有荧光是可见的，渗透的叶或原生质体蛋白提取物可以经受SDS-PAGE和蛋白的表达可以用针对各自标记的抗体来验证。
荧光信号可以监测无论是在完整叶片或分离原生质体。虽然检测在整个叶片是更快，更精致的结构信号更好的原生质体可视化。此外，大多表皮细胞时，着眼于整个叶子，不包含叶绿体监测。因此，在分析叶绿体蛋白质时，原生质体的分离是明智的。
该技术的主要优点是监测蛋白质 - 蛋白质相互作用中生活的植物细胞的可能性。没有必要打破细胞，并溶解膜蛋白复合物，因为它是在免疫共沉淀实验为例的情况。此外，该应用程序是简单因为所需的唯一材料是载体，农杆菌与标准荧光显微镜（尽管更高质量的图像用共聚焦激光扫描显微镜来实现）。相反， 在体外下拉测定用重组蛋白，其仅允许检测的相互作用，如果两种蛋白质直接相互作用，附设还可以检测蛋白质复合物需要存在于细胞中的其他内源性蛋白质。然而，这也意味着，附设提供没有证明有直接的蛋白质 - 蛋白质相互作用，它总是要通过其它技术来验证的。此外，由于过度用强启动子可能会出现非特异性的相互作用，这要排除通过适当的阴性对照。为此蛋白质没有预测到与感兴趣的蛋白相互作用，但驻留在同一隔室或构造缺乏的蛋白质 - 蛋白质相互作用结构域应该被使用。此外，系列稀释猎物光盘NA与非相互作用的cDNA以及在变形后的一个时间依赖的方式观察的荧光可以帮助验证结果。以确保真正的荧光信号和伪像的附设的信号进行量化，并设置成相对于另一表达荧光蛋白，例如标志物蛋白7,8歧视。附设的方法的另一个缺点是，该蛋白质的相互作用也可以在空间上的相对大的荧光标记的阻碍。
农杆菌介导的转化在其他植物中的应用（例如， 拟南芥 ）是有限的，但是，它可以直接转化质粒DNA或者转换成隔离的拟南芥原生质体或使用粒子枪转化细胞。然而，质粒DNA应该使用Maxi试剂盒进行分离，因为它应该被高度浓缩，并尽可能纯对原生质体转化。我们OBS另一个问题由于高表达的靶蛋白的erved是在胞质溶胶中的非特异性凝集，与线粒体膜蛋白工作时尤其如此。这个问题可以通过洋葱细胞的生物射弹转化来克服。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢于尔根索尔的有益讨论和克里斯嘉莉的手稿的批判性阅读。该项目资助的东风集团和全宗DER chemischen工业公司（补助号SFB 1035项目A04至SS和做二十二分之一百八十七到RS）通过。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp. |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
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