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Biology

तंबाकू protoplasts और पत्तियों में Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation द्वारा कल्पना प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत

Published: March 9, 2014 doi: 10.3791/51327
Automatic Translation
1, 1
1Department Biologie I, Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität, München

Summary

Vivo में प्रोटीन परिसरों के गठन bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक द्वारा देखे जा सकते हैं. बातचीत भागीदारों फ्लोरोसेंट टैग के पूरक भागों में जुड़े हुए हैं और क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त, दो प्रोटीनों के करीब निकटता पर एक पुनर्गठन फ्लोरोसेंट संकेत के परिणामस्वरूप कर रहे हैं.

Abstract

कई प्रोटीन अन्य प्रोटीन के साथ क्षणिक बातचीत या उनके जैविक समारोह में प्रदर्शन करने के लिए बहु - प्रोटीन परिसरों में एकीकृत कर रहे हैं. Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC) संयंत्र कोशिकाओं में इस तरह की बातचीत की निगरानी के लिए एक Vivo में विधि है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल में जांच उम्मीदवार प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पूरक हिस्सों से इनकार कर रहे हैं और संबंधित निर्माणों Agrobacterium की मध्यस्थता परिवर्तन के माध्यम से संयंत्र कोशिकाओं में पेश कर रहे हैं. बाद में, प्रोटीन क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त कर रहे हैं और बहाल फ्लोरोसेंट संकेतों बरकरार कोशिकाओं में एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग से पता लगाया जा सकता है. इस बातचीत के ही केवल नहीं दृश्य की अनुमति देता है, लेकिन यह भी प्रोटीन परिसरों के subcellular स्थानीयकरण निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रयोजन के लिए, एक फ्लोरोसेंट टैग युक्त मार्कर जीन इस प्रकार इस तरह के टी के रूप में सेलुलर संरचनाओं visualizing, BiFC निर्माणों के साथ coexpressed किया जा सकता हैवह जालिका, mitochondria, Golgi उपकरण या प्लाज्मा झिल्ली endoplasmic. फ्लोरोसेंट संकेत या तो सीधे एपिडर्मल पत्ता कोशिकाओं में या आसानी से बदल तम्बाकू के पत्ते से अलग किया जा सकता है, जो एक protoplasts में नजर रखी जा सकती है. BiFC आदर्श जीवित कोशिका के भीतर अपने प्राकृतिक परिवेश में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. हालांकि, यह अभिव्यक्ति मजबूत प्रमोटरों द्वारा संचालित किया जाना है और बातचीत के भागीदारों के कारण बातचीत तंत्र के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो अपेक्षाकृत बड़ा प्रतिदीप्ति टैग, के विलय को संशोधित कर रहे हैं कि उस पर विचार किया जाना है. फिर भी, BiFC ऐसे coimmunoprecipitation के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत,, इन विट्रो पुल से नीचे assays या खमीर दो संकर प्रयोगों की जांच अन्य सामान्य रूप से लागू किया तरीकों के लिए एक उत्कृष्ट पूरक दृष्टिकोण है.

Introduction

प्रोटीन परिसरों के गठन का अध्ययन करने और इन विवो में संयंत्र कोशिकाओं में उनके स्थानीयकरण सेलुलर नेटवर्क की जांच के लिए आवश्यक है, संकेत और चयापचय की प्रक्रिया. BiFC सीधे रहने वाले संयंत्र सेल 1-5 भीतर उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति देता.

BiFC में एक पुनर्गठन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन नेतृत्व की दो nonfluorescent एन और सी टर्मिनल टुकड़े के पूरक दृष्टिकोण. कई अलग अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के टुकड़े हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) रासायनिक तीन अलग अवशेषों 6 द्वारा बनाई है जिनमें से क्रोमोफोर जैसे, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज की दोनों प्रोटीन से इनकार किया जा सकता है जो दो nonfluorescent टुकड़ों में परिणाम के लिए एक पाश या एसएस किनारा भीतर आधा किया जा सकता. परख किसी भी subcellular compartme में बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैआनुवंशिक रूप से संलयन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है कि किसी भी aerobically बढ़ रही जीव या कोशिकाओं में NT. दो प्रोटीन कोशिका के भीतर करीब निकटता में आते हैं, प्रतिदीप्ति का पुनर्गठन कर रहा है और exogenous fluorophores या रंजक 3 के अलावा बिना माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है.

प्रोटीन आसानी से तंबाकू उत्पन्न निर्माणों के साथ पत्तियों का Agrobacterium की मध्यस्थता परिवर्तन के उपयोग के द्वारा व्यक्त किया जा सकता है क्योंकि तंबाकू (निकोटियाना benthamiana), संयंत्र प्रोटीन की बातचीत कल्पना करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल जीव साबित हो गया है. Agrobacteria संयंत्र कोशिकाओं में ब्याज की जीन के पारगमन कि मध्यस्थता एंजाइमों के लिए कोडिंग एक तथाकथित तिवारी प्लाज्मिड (ट्यूमर उत्प्रेरण) का उपयोग करें. BiFC घुलनशील के लिए और साथ ही सभी सेलुलर डिब्बों के भीतर झिल्ली प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से लागू है और सफलतापूर्वक vivo में प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के साथ ही बातचीत साइटों का विश्लेषण करने के लिए पिछले वर्षों में इस्तेमाल किया गया है7-9 प्रोटीन के भीतर. पेश जीनों की अभिव्यक्ति पर, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की बातचीत ऐसे जालिका (ईआर), प्लाज्मा झिल्ली या क्लोरोप्लास्ट के रूप में बड़ा सेलुलर संरचनाओं, के लिए उपयुक्त है, जो पत्तियों में सीधे देखे जा सकते हैं. हालांकि, अधिक परिष्कृत संरचनाओं में स्थानीयकरण नजर रखने के लिए, उदाहरण के लिए, क्लोरोप्लास्ट लिफाफा, यह बदल तम्बाकू के पत्ते से अलग protoplasts में प्रतिदीप्ति कल्पना करने की सलाह दी जाती है. एक सी टर्मिनल या एक एन टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग पौधों 10 में BiFC दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जाना है जिसमें या तो BiFC वैक्टर का सेट. इसके बाद वर्णित प्रोटोकॉल tetratricopeptide दोहराने डॉकिंग प्रोटीन Toc64 और AtTPR7 क्लोरोप्लास्ट बाहरी लिफाफा और क्रमशः जालिका, 11-13 में रहने से युक्त (TPR) डोमेन के साथ साइटोसोलिक गर्मी झटका प्रोटीन 90 (HSP90) की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए HSP90 सीटी इनकार किया गया थाSCFP (SCFP सी) के erminal हिस्सा. टैग एन टर्मिनली TPR डोमेन प्रकार दबाना HSP90 के सी टर्मिनल MEEVD बाध्यकारी आकृति की पहुंच सुनिश्चित करने के लिए निगरानी इनकार किया गया था. समानांतर में, वीनस (शुक्र एन) के एन टर्मिनल हिस्सा डॉकिंग प्रोटीन क्रमशः Toc64 और AtTPR7, जिसमें TPR डोमेन की साइटोसोलिक डोमेन इनकार किया गया था. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में हम cytosol में रहता है और इसलिए एक उचित नियंत्रण है जो केवल SCFP सी के घुलनशील सी टर्मिनल हिस्सा क्लोन.

अध्ययन प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैग करीब निकटता और इस तरह फ्लोरोसेंट संकेत के पुनर्गठन की अनुमति के लिए एक ही सेलुलर डिब्बे का सामना करना पड़ेगा. एक अलग फ्लोरोसेंट टैग के लिए जुड़े हुए एक मार्कर प्रोटीन बातचीत की subcellular स्थानीयकरण प्रदर्शित करने के लिए cotransformed जा सकता पुनर्गठन फ्लोरोसेंट संकेत का स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए. MCherrry से जुड़े हुए एक ईआर मार्कर प्रोटीन में एक साथ बदल गया थाAtTPR7 14 स्थित ईआर के मामले. क्लोरोफिल के autofluorescence Toc64 के मामले में क्लोरोप्लास्ट मार्कर के रूप में सेवा की. ऐसा करके न केवल साइटोसोलिक HSP90 निगरानी के साथ क्रमशः Toc64 और AtTPR7, के vivo बातचीत तम्बाकू के पत्ते में सीधे नजर रखी जा सकती है, लेकिन यह भी बातचीत की subcellular स्थानीयकरण की जांच की जा सकती है.

BiFC अच्छी तरह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन अन्य तरीकों के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में उपयुक्त है. Coimmunoprecipitation करने या इन विट्रो पुल से नीचे प्रयोगों में तुलना में, उदाहरण के लिए, कोई विशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटीन के हित के लिए उपलब्ध रहना होगा, और प्रोटीन विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो recombinantly विट्रो में व्यक्त किया जा की जरूरत नहीं है. प्रोटीन जुड़े हुए फ्लोरोसेंट टैग 15 की बातचीत के द्वारा कब्जा कर रहे हैं, क्योंकि इसके अलावा, यह भी क्षणिक बातचीत, BiFC उपयोग पर नजर रखी जा सकती है.

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Protocol

1. BiFC के परिवर्तन Agrobacteria में constructs

  1. BiFC निर्माणों की क्लोनिंग
    1. Flanking attB साइटों युक्त oligonucleotides का उपयोग कर एक उपयुक्त टेम्पलेट से ब्याज की जीन बढ़ाना. एक प्रूफरीडिंग पोलीमर्स का उपयोग कर एक पीसीआर प्रदर्शन करना. बनाया गया प्राइमर संयोजन के लिए annealing कदम की लंबाई और टुकड़ा आकार के अनुसार बढ़ाव कदम की लंबाई को अपनाना. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद की जाँच करें और एक पीसीआर क्लीन अप किट का उपयोग करके इसे शुद्ध.
    2. प्राप्त टुकड़ा के साथ बीपी प्रतिक्रिया और एक बी.पी. recombinase का उपयोग प्रविष्टि वेक्टर प्रदर्शन करना. प्रवेश वेक्टर के 150 एनजी के साथ attB पीसीआर उत्पाद के 15-150 एनजी मिक्स, बी पी recombinase के 2 μl जोड़ने के लिए और 8 μl की कुल मात्रा को ते बफर के साथ भरें. आरटी पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2 μl proteinase कश्मीर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो
    3. सक्षम ई. में पूरी प्रतिक्रिया रूपांतरण कोलाई DH5α; कोशिकाओं और वेक्टर में डीएनए टुकड़ा की सही प्रविष्टि के लिए कॉलोनी पीसीआर द्वारा प्राप्त कालोनियों स्क्रीन. सकारात्मक plasmids के डीएनए अनुक्रमण म्यूटेशन की अनुपस्थिति को सत्यापित करने के लिए किया जाता है.
    4. एक एलआर recombinase का उपयोग उचित गंतव्य वेक्टर साथ एलआर पुनर्संयोजन के लिए प्राप्त की प्रविष्टि क्लोन का प्रयोग करें. गंतव्य वेक्टर के 150 एनजी के साथ प्रवेश वेक्टर के 50-150 एनजी मिक्स, 1 μl एलआर recombinase जोड़ने और 5 μl की कुल मात्रा को ते बफर के साथ भरें. आरटी पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1 μl proteinase कश्मीर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो
    5. वेक्टर में डीएनए टुकड़ा की सही प्रविष्टि के लिए कॉलोनी पीसीआर द्वारा कालोनियों प्राप्त सक्षम ई. कोलाई DH5α कोशिकाओं और स्क्रीन में पूरी प्रतिक्रिया रूपांतरण. डीएनए अनुक्रमण इस कदम पर आवश्यक नहीं है.
    6. पवित्रता का एक उच्च स्तर को सुनिश्चित करने के लिए एक प्लाज्मिड मिनी किट के साथ प्लास्मिड डीएनए को अलग.
  2. रासायनिक सक्षम Agrobacteria (की तैयारीतनाव AGL1, रिफाम्पिसिन और कार्बेनिसिलिन प्रतिरोध)
    1. स्ट्रीक बाहर एक शेयर संस्कृति से agrobacteria और 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए बढ़ने
    2. एक ही कॉलोनी के साथ 5 मिलीलीटर लेग मध्यम टीका लगाना और 28 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
    3. टीका लगाना 50 2 रातोंरात संस्कृति की मिलीलीटर और एक आयुध डिपो 1.0 की 600 करने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 4 घंटे के लिए बढ़ने के साथ मिलीलीटर लेग मध्यम.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और ठंडा 2 CaCl (10 मिमी) निष्फल 1 मिलीलीटर में गोली resuspend. इस कदम के बाद बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में तुरंत फ्रीज, कोशिकाओं की aliquots (100 μl) तैयार करें
  3. रासायनिक सक्षम Agrobacteria का परिवर्तन
    1. बर्फ पर सक्षम AGL1 कोशिकाओं के एक विभाज्य पिघलना. कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए के 1-2 ग्राम जोड़ें. बर्फ पर 5 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और 5 मिनट में 5 मिनट के लिए सेते कोशिकाओं और एस के लिए 600 μl लेग मध्यम जोड़ें28 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 650 rpm पर हेक
    2. 8000 XG पर 1 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग प्लेटों पर शेष लेग मध्यम और थाली के 50 μl में गोली Resuspend. प्लेटों को सील करने और 28 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए सेते कॉलोनी पीसीआर द्वारा प्लाज्मिड की उपस्थिति के लिए स्क्रीन कालोनियों.
    3. उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त 5 मिलीलीटर लेग माध्यम में एक सकारात्मक कॉलोनी टीका लगाना और रात में 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 500 μl 50% निष्फल ग्लिसरॉल के साथ रातोंरात संस्कृति की 500 μl मिक्स और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज
    4. तम्बाकू के पत्ते की क्षणिक परिवर्तन के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक से सीधे उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग माध्यम में agrobacteria टीका लगाना.

2. तम्बाकू के पत्ते की क्षणिक परिवर्तन

  1. Agrobacteria विकास
    1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार: Acetosyringone (150 मिमी, 70 में भंग-20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप% EtOH), स्टोर एमईएस / KOH (0.1 एम) पीएच 5.7, 4 डिग्री सेल्सियस (अब भंडारण के दौरान बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के लिए एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर) पर दुकान, 2 MgCl (एम 1) शेयर, आरटी पर दुकान.
    2. एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में ब्याज की प्लाज्मिड युक्त AGL1 ग्लिसरॉल स्टॉक संस्कृति के 50 μl के साथ उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त 10 मिलीलीटर लेग मध्यम टीका लगाना और कम से कम 24 घंटा 1.0 के बीच एक आयुध डिपो 600 तक 190 rpm पर मिलाते के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते -2.0 पर पहुंच गया है.
    3. अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया 15 मिनट के लिए 3000 XG पर. ताजा बना घुसपैठ माध्यम में गोली [2 MgCl (10 मिमी), एम ई / KOH (10 मिमी) पीएच 5.7, Acetosyringone (150 माइक्रोन)] Resuspend और एक आयुध डिपो 1.0 की 600 निलंबन को समायोजित.
    4. अंधेरे में 2 घंटे के लिए एक ओवरहेड प्रकार के बरतन में agrobacteria कोशिकाओं को सेते हैं. कोशिकाओं तो घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. तम्बाकू के पत्ते की घुसपैठ
    1. तीन का प्रयोग करेंसप्ताह पुरानी तम्बाकू (निकोटियाना benthamiana) पौधों. घुसपैठ के लिए कई पुरानी पत्तियों चुनें.
    2. ब्याज की निर्माणों (3 मिलीलीटर प्रत्येक) ले जाने agrobacteria के बराबर मात्रा में मिलाएं. घुसपैठ के लिए एक सुई के बिना एक 5 मिलीलीटर सिरिंज ले लो. कई स्थानों में पत्तियों के नीचे के हिस्से में सिरिंज दबाकर तम्बाकू के पत्तों में ध्यान से सेल निलंबन घुसपैठ.
    3. पौधों को पानी और दो दिनों के लिए अंधेरे में उन्हें छोड़ दें.

3. मूलतत्त्व तैयारी

तम्बाकू के पत्ते की मूलतत्त्व तैयारी Koop एट अल. 16 से अनुकूलित और थोड़ा संशोधित किया गया था.

  1. बफर तैयारी
    1. एफ PCN मध्यम तैयार: स्थूल लवण [3 (1012 माइक्रोग्राम / एमएल) KNO, 2 CaCl • 2H 2 हे (440 माइक्रोग्राम / एमएल), 4 MgSO • 7 2 हे (370 माइक्रोग्राम / एमएल), के.एच. 2 पीओ 4 ( 170 माइक्रोग्राम / एमएल), एनएच 4-succinate [(20 मिमी, एक 2 एम स्टॉक प तैयारution] (succinate (236 माइक्रोग्राम / एमएल) और एनएच 4 सीएल (106 माइक्रोग्राम / एमएल), भंग करने के लिए पीएच 5.8 करने के लिए समायोजित), माइक्रो लवण [EDTA-Fe (तृतीय), ना नमक (40 माइक्रोग्राम / एमएल) x जे (0.75 माइक्रोग्राम / एमएल), एच 3 बो 3 (3 माइक्रोग्राम / एमएल), MnSO 4 • एच 2 ओ (10 माइक्रोग्राम / एमएल), ZnSO 4 • 7 2 हे (2 ग्राम / एमएल), ना 2 4 Moo • 7 2 हे (0.25 माइक्रोग्राम / एमएल), CuSO 4 • 5H 2 हे (0.025 ग्राम / एमएल), CoCl 2 • 6 2 हे (0.025 ग्राम / एमएल)], एमईएस (390 माइक्रोग्राम / एमएल), ग्लूकोज (लगभग 80 ग्राम / एमएल) परासारिता 550 mOsm, पीएच 5.8 (KOH). -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर
    2. एफ पिन मध्यम तैयार: एफ PCN के रूप में लेकिन बजाय ग्लूकोज का उपयोग सुक्रोज (लगभग 110 माइक्रोग्राम / एमएल), परासारिता 550 mOsm, पीएच 5.8 (KOH) के सभी अवयवों. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर
    3. W5 मध्यम तैयार: 150 मिमी NaCl, 125 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी एमईएस, परासारिता 550-580 mOsm, पीएच 5.7 (KOH). 4 डिग्री पर स्टोर; सी (अब भंडारण के दौरान बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के लिए एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर).
    4. मूलतत्त्व अलगाव (0.1 ग्राम cellulase, 10 मिलीलीटर एफ पिन में 0.03 जी macerozym) के लिए ताजा एंजाइम समाधान तैयार करें. 10 मिनट और आरटी शांत करने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं. 10 मिलीलीटर के समाधान के लिए 10% BSA के 100 μl जोड़ें.
  2. Protoplasts के अलगाव
    1. एक पेट्री डिश में एक घुसपैठ की पत्ती रखें और ताजा एंजाइम समाधान जोड़ने. लगभग 0.5 सेमी 2 आकार के टुकड़ों में पत्ता काटने के लिए एक नया razorblade का प्रयोग करें. एक वैक्यूम घुसपैठ कुप्पी में एंजाइम समाधान के साथ पत्ती टुकड़े स्थानांतरण और हवाई बुलबुले (बहुत ध्यान से रिहाई निर्वात) पत्तियों से उभरने तक वैक्यूम लगभग 20 सेकंड के लिए घुसपैठ.
    2. अंधेरे में 40 rpm पर 90 मिनट के लिए फ्लास्क हिलाएँ.
    3. 90 rpm पर 1 मिनट के लिए झटकों से protoplasts रिलीज. एक 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब (दौर नीचे) में धुंध (100 माइक्रोन) के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. 70 XG आरटी पर (धीमी त्वरण और मंदी) पर 10 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर एफ PCN बफर और अपकेंद्रित्र साथ मूलतत्त्व समाधान ढ़कें.
    4. बरकरार protoplasts एंजाइम समाधान और एफ PCN के इंटरफेस में जमा. एक ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब में बरकरार protoplasts हस्तांतरण और W5 बफर साथ भरने के लिए एक विस्तृत छिद्र 1 मिलीलीटर विंदुक टिप ले लो. Protoplasts गोली 100 XG (धीमी त्वरण और मंदी) में 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    5. Protoplasts की मात्रा पर निर्भर करता है, लगभग 200 μl W5 बफर में एक विंदुक और resuspend गोली का उपयोग करके ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    6. हमेशा बरकरार protoplasts के rupturing रोकने के लिए विस्तृत छिद्र सुझावों का उपयोग करें.

4. लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी

  1. नमूना तैयार
    1. एक खुर्दबीन स्लाइड के आसपास सीलेंट के दो छोटे स्ट्रिप्स (2 सेमी के अलावा) चिपकाएं. स्ट्रिप्स के बीच मूलतत्त्व समाधान के 20 μl प्लेस और ध्यान से एक कांच कवर जगहशीर्ष पर. सीलेंट स्ट्रिप्स protoplasts कवर कांच से कुचल नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
    2. कुल पत्ती के नमूने पत्ती से एक 1 सेमी टुकड़ा काट और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पत्ती के नीचे की ओर से एक खुर्दबीन स्लाइड पर यह जगह के लिए. लगभग 30 μl एच 2 ओ जोड़ें शीर्ष पर एक कांच कवर जगह है और दोनों पक्षों पर चिपकने वाला टेप के साथ मजबूती से यह तय कर लो.
  2. Confocal इमेजिंग और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स
    1. टीसीएस SP5: इमेजिंग Leica, प्रकार से एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के साथ किया जाता है. प्रशंसा के लिए इमेजिंग माध्यम के रूप में ग्लिसरॉल साथ 63X की एक परिमाण के साथ एक उद्देश्य लेंस (HCX पी एल एपीओ सीएस) का उपयोग करें. संख्यात्मक एपर्चर 1.3 पर सेट करें. मूल्यांकन के लिए Leica अनुप्रयोग सूट / उन्नत प्रतिदीप्ति सॉफ्टवेयर (पूरक डाटा S1 देखें) का प्रयोग करें.
    2. 515 एनएम पर पुनर्गठित BiFC संकेत पर नजर रखने और 495-550 एक पीएमटी डिटेक्टर उत्सर्जन बैंडविड्थ स्थापित करने के लिए 18% की तीव्रता को 488 एनएम पर 30% तक आर्गन लेजर और लेजर सत्ता स्थापित. क्लोरोफिल autofluorescence नजर रखने के लिए 650-705 एक दूसरे पीएमटी डिटेक्टर उत्सर्जन बैंडविड्थ निर्धारित किया है.
    3. MCherry संकेत HeNe 561 लेजर का उपयोग की निगरानी, ​​लेजर की तीव्रता 561-18% और 587-610 एक तिहाई पीएमटी डिटेक्टर का उत्सर्जन बैंडविड्थ निर्धारित किया है.
    4. सभी पीएमटी डिटेक्टर चैनलों की तस्वीरों में एक ही लाभ सेटिंग्स (लाभ पृष्ठभूमि संकेतों को छोड़ने के लिए 800-900 के बीच होना चाहिए) के साथ लिया जाता है कि सुनिश्चित करें.
    5. 100 हर्ट्ज के स्कैन की गति के साथ 1024 x 1024 पिक्सल के एक प्रारूप चौड़ाई / ऊंचाई में तस्वीरें ले लो.
    6. जेड stackings प्रत्येक ढेर के बीच 0.5 माइक्रोन की अधिकतम दूरी का उपयोग करें.

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Representative Results

इस उदाहरण में हम झिल्ली डॉकिंग प्रोटीन AtTPR7 और Toc64 साथ साइटोसोलिक आणविक निगरानी HSP90 की बातचीत की निगरानी के लिए BiFC विधि का इस्तेमाल किया. AtTPR7 सेक translocon का हिस्सा है और संभवतः ईआर झिल्ली को बाद translational स्थानान्तरण के लिए स्रावी preproteins देने जो साइटोसोलिक संरक्षिकाओं, साथ सूचना का आदान प्रदान. इसी तरह, क्लोरोप्लास्ट बाहरी लिफाफा पर Toc64 HSP90 जुड़े क्लोरोप्लास्ट preproteins प्राप्त करके बाद translational आयात में कार्य करता है. दोनों प्रोटीन HSP90 के सी टर्मिनल MEEVD आकृति के साथ बातचीत की मध्यस्थता करता है, जो एक साइटोसोलिक उजागर TPR डोमेन, शामिल.

प्रोटीन फ्लोरोसेंट टैग साइटोसोलिक डोमेन से जुड़ा हुआ है और इस तरह के प्रोटीन को निशाना और झिल्ली प्रविष्टि में बाधा नहीं है यह सुनिश्चित करना कि वीनस एन डॉकिंग प्रोटीन युक्त TPR डोमेन fusing उपयुक्त गंतव्य वैक्टर में विशिष्ट recombinases के माध्यम से क्लोन किया गया. HSP90, SCFP सी के मामले में (आंकड़े 1 और 2).

AtTPR7 और HSP90 प्रोटीन परिसर के स्थानीयकरण सत्यापित करने के लिए एक ईआर मार्कर (mCherry) के साथ cotransformed गया. प्रतिदीप्ति एक लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन के साथ बरकरार पत्तियों में नजर रखी थी. (HSP90) की तरह cytosol में स्थित है जो अकेले एक नियंत्रण SCFP सी, के रूप में, AtTPR7 और ईआर मार्कर के साथ व्यक्त किया गया था. कई पत्ते प्रतिदीप्ति के लिए जाँच की थी और तस्वीरों के समान माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ ले जाया गया. नकारात्मक नियंत्रण केवल इन सेटिंग्स के साथ बहुत ही मामूली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (चित्रा 3) दिखाना चाहिए जबकि हमारे अनुभव में एक ठेठ संकेत, 800-900 पर लाभ सेटिंग्स के साथ दिखाई जानी चाहिए. एक साथ 515 एनएम पर SCFP सी HSP90 साथ वीनस एन AtTPR7 के लिए एक पुनर्गठन संकेत ईआर मार्कर के साथ अतिव्यापी नजर रखी थी. वीनस एन से कम के लिए कोई संकेतTPR7 और नकारात्मक नियंत्रण SCFP सी मनाया जा सकता है.

पूरे सूक्ष्म चित्रों में सटीक स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति पहले से ही (आंकड़े 4 दिख रहा है हालांकि, तय कर पाना मुश्किल है और पत्ते के बाद Toc64 और HSP90 अभिव्यक्ति है, साथ ही Toc64 और SCFP सी के मामले में, protoplasts, घुसपैठ की तम्बाकू के पत्ते से अलग थे 5). 515 एनएम पर एक संकेत क्लोरोप्लास्ट आसपास अंगूठी के आकार का संरचनाओं के रूप में पता लगाया जा सकता है जो क्लोरोप्लास्ट लिफाफा, पर एक साथ SCFP सी HSP90 साथ Toc64-वीनस एन व्यक्त बहाल कर दी गई. नियंत्रण से ऊपर के रूप में समान माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ फोटो खिंचवाने गया था और 515 एनएम पर एक प्रतिदीप्ति नहीं दिखा था.

चित्रा 1
आंकड़ा1. BiFC की क्लोनिंग प्रक्रिया निर्माण करती है. ब्याज की जीन इस प्रकार वेक्टर भीतर ccdB जीन की जगह, ATT पी साइटों के साथ एक प्रवेश वेक्टर में बीपी पुनर्संयोजन अनुमति देने के लिए ATT बी साइटों से घिरे oligonucleotides के साथ परिलक्षित किया गया. इसके बाद प्रवेश वेक्टर एक एलआर recombinase का उपयोग उचित गंतव्य वैक्टर साथ recombined था. तम्बाकू के पत्ते में इन निर्माणों के परिवर्तन विभाजन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए और एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए टैग के लिए जुड़े हुए प्रोटीन की अभिव्यक्ति. की अनुमति देता है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. BiFC प्रयोगों में व्यक्त प्रोटीन की योजनाबद्ध प्रस्तुति. वीनस एन हैक्रमशः, क्लोरोप्लास्ट और ईआर में रहने Toc64 या AtTPR7 की साइटोसोलिक भागों के लिए युग्मित. HSP90 एन टर्मिनली HSP90 सी टर्मिनस साथ Toc64 और AtTPR7 की TPR डोमेन की बातचीत, सक्रिय करने SCFP सी से जुड़े हुए है. अकेले SCFP सी एक नियंत्रण के रूप में cytosol में व्यक्त किया जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. AtTPR7 और तंबाकू एपिडर्मल पत्ता कोशिकाओं में कल्पना की HSP90 साथ BiFC. वीनस एन AtTPR7 और SCFP सी HSP90 ईआर mCherry मार्कर (मध्यम पैनल) के साथ cotransformed और क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त किया गया. एक नियंत्रण वीनस एन AtTPR7 SCFP साथ cotransformed था के रूप में इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. Toc64 और HSP90 साथ BiFC तंबाकू एपिडर्मल पत्ता कोशिकाओं में कल्पना की. Toc64-वीनस और एन SCFP सी HSP90 क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त किया गया. किसी नियंत्रण के रूप Toc64-वीनस एन अकेले SCFP सी (नीचे पैनल) के साथ cotransformed गया था. पुनर्गठन प्रतिदीप्ति 515 एनएम (बाएं पैनल) पर नजर रखी थी. हस्ताक्षर के ओवरले515 एनएम और क्लोरोफिल autofluorescence पर एनएएल (सही पैनल) में दिखाया गया है. क्लोरोफिल autofluorescence 480 एनएम पर नजर रखी है. स्केल सलाखों:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. तम्बाकू protoplasts में कल्पना की Toc64 और HSP90 साथ BiFC. Toc64-वीनस और एन SCFP सी HSP90 क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त किया गया. किसी नियंत्रण के रूप Toc64-वीनस एन अकेले SCFP सी (नीचे पैनल) के साथ cotransformed गया था. पुनर्गठन प्रतिदीप्ति पृथक मूलतत्त्वों में 515 एनएम (बाएं पैनल) पर नजर रखी थी. 515 एनएम और क्लोरोफिल autofluorescence पर संकेत के ओवरले (दिखाया गया हैसही पैनल). क्लोरोफिल autofluorescence 480 एनएम पर नजर रखी है. स्केल सलाखों:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

एक BiFC प्रयोग की योजना बना करने पर कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए. ब्याज की प्रोटीन के बारे में कोई जानकारी संरचनात्मक आवश्यक है, टोपोलॉजी झिल्ली फैले प्रोटीन के साथ कार्य करते समय ज्ञात किया जाना है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक ही subcellular डिब्बे में रहते हैं या बातचीत की अनुमति के लिए एक झिल्ली का एक ही पक्ष का सामना करना पड़ेगा. एक एन टर्मिनल लक्ष्यीकरण अनुक्रम की आवश्यकता होती है जो प्रोटीन का विश्लेषण करते समय स्वाभाविक रूप से, केवल एक सी टर्मिनल टैग माना जा सकता है. यह टैग यह एक GFP टैग प्रोटीन व्यक्त की, उदाहरण के लिए, पहले से subcellular स्थानीयकरण का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है ब्याज की प्रोटीन की उचित लक्ष्यीकरण या झिल्ली प्रविष्टि के साथ हस्तक्षेप संभव है कि चूंकि. इसके अलावा, एक नकारात्मक नियंत्रण हमेशा शामिल किया जाना चाहिए. इस उदाहरण में हम केवल cytosol में SCFP सी व्यक्त एक निर्माण उत्पन्न. हालांकि, बातचीत करने की उम्मीद नहीं है कि किसी भी प्रोटीन एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उचित अभिव्यक्ति ओ सत्यापित करने के लिएच कोई प्रतिदीप्ति दिख रहा है, खासकर यदि घुसपैठ की पत्तियों या protoplasts के प्रोटीन के अर्क एसडीएस पृष्ठ और प्रोटीन अभिव्यक्ति के अधीन किया जा सकता है निर्माणों, संबंधित टैग के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ सत्यापित किया जा सकता है.

फ्लोरोसेंट संकेतों बरकरार पत्ते या पृथक मूलतत्त्वों में या तो नजर रखी जा सकती है. पूरे पत्ते में पता लगाने के लिए तेजी से है, और अधिक परिष्कृत संरचनाओं का संकेत बेहतर protoplasts में कल्पना कर रहे हैं. क्लोरोप्लास्ट शामिल नहीं है जो पूरी पत्ती, पर देख रहे हैं इसके अलावा, जब ज्यादातर एपिडर्मल कोशिकाओं निगरानी कर रहे हैं. क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन का विश्लेषण इसलिए, जब protoplasts के अलगाव की सलाह दी जाती है.

तकनीक का प्रमुख लाभ में रहने वाले संयंत्र कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की निगरानी करने की संभावना है. यह coimmunoprecipitation प्रयोगों में उदाहरण के लिए मामला है के रूप में कोशिकाओं को तोड़ने के लिए और झिल्ली प्रोटीन परिसरों solubilize करने की कोई जरूरत नहीं है. इसके अलावा, आवेदन सरल हैकेवल आवश्यक सामग्री वैक्टर, agrobacteria और एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (उच्च गुणवत्ता के चित्र एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के साथ प्राप्त कर रहे हैं) होते हैं. केवल एक बातचीत का पता लगाने की अनुमति जो पुनः संयोजक प्रोटीन, साथ में इन विट्रो पुल से नीचे assays के विपरीत दोनों प्रोटीन सीधे बातचीत कर रहे हैं, BiFC भी कोशिका में मौजूद अतिरिक्त, अंतर्जात प्रोटीन की आवश्यकता होती है जो प्रोटीन परिसरों का पता लगा सकते. बहरहाल, यह भी BiFC कोई हमेशा अन्य तकनीकों द्वारा सत्यापित किया जाना है जो एक प्रत्यक्ष प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की साबित प्रदान करता है कि इसका मतलब है. इसके अलावा, उचित नकारात्मक नियंत्रण से खारिज किया है जिसमें unspecific बातचीत हो सकती मजबूत प्रमोटरों द्वारा overexpression की वजह से. अंत करने के लिए एक प्रोटीन ब्याज की प्रोटीन के साथ बातचीत करने की भविष्यवाणी नहीं है, लेकिन एक ही डिब्बे में रहने वाले, या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत डोमेन इस्तेमाल किया जाना चाहिए कमी निर्माण करती है. इसके अलावा, शिकार सीडी की एक कमजोर पड़ने श्रृंखलापरिवर्तन के बाद एक समय निर्भर तरीके में एक noninteracting सीडीएनए के साथ ही प्रतिदीप्ति के अवलोकन के साथ NA परिणामों को मान्य करने के लिए कर सकते हैं. सच फ्लोरोसेंट संकेतों और BiFC संकेतों उदाहरण के लिए एक और व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एक मार्कर प्रोटीन 7,8 के संबंध में मात्रा निर्धारित और निर्धारित किया जाना चाहिए कलाकृतियों के भेदभाव को सुनिश्चित करना. BiFC विधि का एक और दोष प्रोटीन की बातचीत भी अपेक्षाकृत बड़े फ्लोरोसेंट टैग द्वारा sterically बाधा जा सकता है कि, है.

अन्य संयंत्रों में Agrobacterium की मध्यस्थता परिवर्तन का आवेदन (उदाहरण के लिए, Arabidopsis) हालांकि, यह अलग एराबिडोप्सिस protoplasts में या एक कण बंदूक का उपयोग कोशिकाओं को बदलने के लिए या तो सीधे प्लास्मिड डीएनए को बदलने के लिए संभव है, सीमित है. हालांकि, प्लास्मिड डीएनए यह अत्यधिक ध्यान केंद्रित और मूलतत्त्व परिवर्तन के लिए संभव के रूप में शुद्ध होना चाहिए, एक मैक्सी किट का उपयोग कर अलग किया जाना चाहिए. हम obs एक और समस्याकारण लक्ष्य प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति के लिए erved cytosol में unspecific एकत्रीकरण mitochondrial झिल्ली प्रोटीन के साथ काम कर रहा है, खासकर जब था. इस समस्या प्याज कोशिकाओं के biolistic परिवर्तन करके दूर किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए उपयोगी विचार विमर्श और क्रिस कैरी के जुरगेन Söll धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना DFG और Fonds der chemischen इंडस्ट्री (अनुदान संख्या SFB 1035, एस एस के लिए परियोजना A04 रुपये से 187/22 मत) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone Sigma-Aldrich D134406 Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10 Serva 16419 from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10  Serva 28302 from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609-250
pDEST-GWVYNE Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning

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References

  1. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  2. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
  3. Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
  4. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  5. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
  6. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  7. Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
  8. McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
  9. Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
  10. Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
  11. Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
  12. Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
  13. Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
  14. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
  15. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  16. Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).

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प्लांट बायोलॉजी अंक 85 Tetratricopeptide दोहराने डोमेन निगरानी ​​क्लोरोप्लास्ट जालिका HSP90 TOC जटिल सेक translocon BiFC
तंबाकू protoplasts और पत्तियों में Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation द्वारा कल्पना प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत
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Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves. J. Vis. Exp. (85), e51327, doi:10.3791/51327 (2014).

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