Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker
Summary
De isolatie van kankerstamcellen (KSC) rechtstreeks van menselijke weefsels is voorwaarde voor hun biologische karakterisering. Dit manuscript beschrijft een methode voor de isolatie van prostaat CSC van menselijk weefsel, terwijl ook het verstrekken van tips over het oplossen van moeilijke stappen.
Abstract
De kanker stamcellen (CSC) model is aanzienlijk herzien in de afgelopen twee decennia. Gedurende deze tijd CSC geïdentificeerd en rechtstreeks geïsoleerd uit humane weefsels en serieel gepropageerd in immunodeficiënte muizen, meestal via antilichaamidentificatie subpopulaties van cellen en fractionering door flowcytometrie. Echter, de unieke klinische kenmerken van prostaatkanker aanzienlijk de studie van de prostaat CSC uit verse stalen van menselijke tumoren beperkt. We hebben onlangs gemeld de isolatie van prostate CSC rechtstreeks uit humane weefsels door hun HLA klasse I (HLAI)-negatief fenotype. Prostaatkankercellen worden geoogst van chirurgische specimens en mechanisch gescheiden. Een celsuspensie gegenereerd en gelabeld met fluorescent geconjugeerd HLAI en stromale antilichamen. Subpopulaties van HLAI-negatieve cellen eindelijk geïsoleerd met behulp van een flowcytometer. De belangrijkste beperking van dit protocol is het vaak microscopische en multifocale aard vanprimaire kanker in prostatectomie exemplaren. Toch geïsoleerde levende prostaat CSC zijn geschikt voor de moleculaire karakterisatie en functionele validatie door transplantatie in immunodeficiënte muizen.
Introduction
Intratumorale heterogeniteit wordt beschouwd als een merker voor kanker 1 zijn. Inderdaad hebben verscheidene mechanismen van intratumorale heterogeniteit beschreven, waaronder genetische mutatie en interacties met de micro. Bovendien kunnen sommige kankers cellulair hiërarchie bevatten met een subpopulatie van kanker stamcellen (CSC) de eigenschappen van tumor-initiërende capaciteit en zelfvernieuwing seriële transplantatie assays 2-5 vertoont. Aanvankelijk beschreven in hematologische 6, 7 borst en hersenen 8 maligniteiten zijn CSC ook onderzocht bij prostaatkanker 9-12 en andere tumortypes 2-5.
CSC wordt algemeen beschouwd als een cellulaire fractie bij een heterogene populatie 2-5. Daarom is de functionele en moleculaire karakterisering van CSC is afhankelijk van hun verrijking van bulk populaties. Dienovereenkomstig, tijdens de laatste twee decennia verschillende voldaanhodologies CSC verrijking zijn ontwikkeld die gewoonlijk uit de scheiding van gemerkte populaties door flowcytometrie. Daarnaast is een belangrijke overweging in de studie van CSC is dat de hiërarchische organisatie van weefsels kan worden verstoord door experimentele manipulaties zoals seriële passages in kweek of immunodeficiënte muizen. Hierdoor heeft de directe isolatie van CSC uit humane weefsels ontwikkeld tot een belangrijke methode in het veld CSC.
Prostaatkanker is een belangrijke oorzaak van kanker morbiditeit en sterfte in de Verenigde Staten en over de hele wereld 13. Daarom is de isolatie en biologische karakterisering van de prostaat CSC is van significant belang. Prostaat CSC zijn eerder verrijkt uit cellijnen, patiënt afgeleid xenotransplantaten, en de patiënt afgeleid lage passage suspensiekweken 9,10,12,14.
We hebben onlangs meldde de isolatie van prostaat CSC direct uit menselijke chirurgische samples op grond van hun HLAI-negatieve celoppervlak fenotype 10. Hier hebben we detail de voor het isoleren van deze cellen procedures. Prostaattumoren worden geoogst van chirurgische specimens en maakte in cel suspensies. De cellen worden vervolgens gekleurd met antilichamen tegen HLAI en stromale en levensvatbaarheid markers en CSC worden geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Geïsoleerde CSC kan vervolgens worden gebruikt voor assays die levensvatbare cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de isolatie van CSC uit verse menselijke prostaatkankercellen weefsels. Een aantal belangrijke overwegingen invloed op de succesvolle afloop van dit protocol.
Het herstel van de hoge aantallen levensvatbare prostaatkankercellen is afhankelijk van een zorgvuldige bruto evaluatie van chirurgische monsters. In onze ervaring, is de succesvolle isolatie van tumorigenic prostaatcellen best gegarandeerd wanneer macroscopische tumoren worden waargenomen en verwerkt 10.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Stichting Hariri Familie en de TJ Martell Foundation.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
