Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

Summary

O isolamento de células-tronco cancerosas (CSCs) diretamente a partir de tecidos humanos é requisito para a sua caracterização biológica. Este manuscrito descreve uma metodologia para o isolamento de CSCs próstata de tecidos humanos, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Abstract

O modelo de células-tronco do câncer (CSC) tem sido revisitado consideravelmente ao longo das últimas duas décadas. Durante este tempo os CSCs foram identificados e isolado directamente a partir de tecidos humanos e em série propagados em ratinhos imunodeficientes, normalmente por meio de marcação de anticorpos de subpopulações de células e de fraccionamento, por citometria de fluxo. No entanto, as características únicas clínicos de cancro da próstata tem limitado consideravelmente o estudo das CSCs da próstata a partir de amostras de tumores humanos frescos. Recentemente, referiram o isolamento de CSCs próstata directamente a partir de tecidos humanos, em virtude da sua classe I HLA fenótipo (HLAI)-negativo. Células de câncer de próstata são colhidas a partir de espécimes cirúrgicos e dissociados mecanicamente. A suspensão de células é gerada e marcada com anticorpos HLAI e estromais conjugados fluorescentes. As subpopulações de células HLAI-negativos são finalmente isolados utilizando um citómetro de fluxo. A principal limitação deste protocolo é a natureza muitas vezes microscópica e multifocal decâncer primário em espécimes de prostatectomia. No entanto, isolados CSCs próstata ao vivo são adequados para a caracterização molecular e validação funcional por transplante em ratos imunodeficientes.

Introduction

Heterogeneidade intratumoral é considerado uma indicação do cancro ^1. De facto, vários mecanismos de heterogeneidade intratumoral foram descritas, incluindo a mutação genética e interacções com o microambiente. Além disso, alguns tipos de cancro podem conter uma hierarquia celular com uma sub-população de células estaminais de cancro (CSCs) que exibe as propriedades de capacidade de iniciação do tumor e de auto-renovação em ensaios de transplante em série ^2-5. Inicialmente descrito em hematológica ^{6, 7} de mama, cérebro e ⁸ malignidades, CSCs também têm sido estudadas em cancro da próstata ^9-12, bem como outros tipos de tumor ^{de 2-5.}

CSCs são geralmente considerados uma fracção celular dentro de uma população heterogénea ^{de 2-5.} Portanto, a caracterização funcional e molecular de CSCs depende seu enriquecimento de populações em massa. Assim, durante as últimas duas décadas vários conheceuhodologies de CSC enriquecimento foram concebidas que normalmente envolvem a separação de populações marcados por citometria de fluxo. Além disso, uma consideração importante no estudo da CSCs é que a organização hierárquica de tecidos humanos pode ser interrompido por meio de manipulações experimentais, tais como passagens em série em cultura ou imunodeficientes ratinhos. Como resultado, o isolamento directo de CSCs de tecidos humanos tem emergido como uma importante metodologia no campo CSC.

O câncer de próstata é uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos Estados Unidos e ao redor do mundo ^{13 de} câncer. Assim, o isolamento e caracterização biológica da CSCs próstata é de interesse significativo. CSCs próstata tenham sido previamente enriquecido a partir de linhagens de células derivadas de pacientes, xenotransplantes e baixa passagem pacientes provenientes de culturas em suspensão ^9,10,12,14.

Recentemente, relatou o isolamento de CSCs próstata diretamente de s cirúrgicos humanosplos em virtude de sua HLAI negativo da superfície celular fenótipo ^10. Aqui detalhamos os procedimentos implementados para o isolamento dessas células. Tumores da próstata são colhidas a partir de amostras cirúrgicas e feito em suspensões de células. As células são depois coradas utilizando anticorpos contra HLAI assim como marcadores estromais e de viabilidade, e CSCs são isoladas por separação de células activadas por fluorescência (FACS). Isolado CSCs podem então ser utilizadas para ensaios que exigem células viáveis.

Protocol

1. Colheita e Processamento de tecido de câncer de próstata humano de espécimes cirúrgicos Preparar dois tubos cónicos de 50 ml de poliestireno que contêm 15 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Pessoal de serviço de Patologia colher amostras primários e metastáticos de câncer de próstata de prostatectomia e cirurgia paliativa espécimes, respectivamente, no âmbito de um Conselho de Revisã…

Representative Results

Figura 1. Próstata humana colheita tumor de câncer e citometria de fluxo enredo ilustrando populações específicas de um câncer de próstata humano. (A) nódulos tumorais são colhidas para gerar uma suspensão celular. Teor de tumor da amostra processada é confirmada usando hematoxilina e eosina convencional. <st…

Discussion

Este protocolo descreve o isolamento das CSCs de fresco tecidos de cancro da próstata humano. Várias considerações importantes influenciam o sucesso deste protocolo.

A recuperação de um elevado número de células cancerosas da próstata viáveis ​​depende de avaliação cuidadosa bruta de amostras cirúrgicas. Em nossa experiência, o isolamento de células prostáticas tumorais é melhor assegurada quando nódulos tumorais macroscópicas são observados e tratados ^10. …

Materials

RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning cell gro	21-031-CM
60 mm-15 mm cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conial tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tune	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	ebioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480