El aislamiento de las células madre del cáncer de muestras de cáncer de próstata humano
Summary
El aislamiento de células madre de cáncer (CSC) directamente a partir de tejidos humanos es necesaria para su caracterización biológica. Este manuscrito describe una metodología para el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata de los tejidos humanos, mientras que también proporciona consejos sobre la solución de problemas difíciles pasos.
Abstract
El modelo de célula madre del cáncer (CSC) se ha revisado considerablemente en las últimas dos décadas. Durante este tiempo CSC se han identificado y aislado directamente a partir de tejidos humanos y en serie propagado en ratones inmunodeficientes, típicamente mediante el etiquetado de anticuerpos de las subpoblaciones de células y fraccionamiento por citometría de flujo. Sin embargo, las características clínicas únicas del cáncer de próstata han limitado considerablemente el estudio de las células madre cancerosas de la próstata a partir de muestras de tumores humanos frescos. Recientemente hemos informado el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata directamente de tejidos humanos en virtud de su clase fenotipo HLA I (HLAI)-negativo. Las células del cáncer de próstata se cosechan a partir de especímenes quirúrgicos y disocian mecánicamente. Una suspensión de células se genera y se marcó con anticuerpos HLAI y del estroma conjugados con fluorescencia. Las subpoblaciones de células HLAI-negativos se aíslan finalmente utilizando un citómetro de flujo. La principal limitación de este protocolo es la naturaleza frecuentemente microscópica y multifocal decáncer primario en pacientes sometidos a prostatectomía. No obstante, aisladas células madre cancerosas de próstata en directo son adecuados para la caracterización molecular y validación funcional de trasplante en ratones inmunodeficientes.
Introduction
La heterogeneidad intratumoral se considera que es un sello del cáncer 1. De hecho, varios mecanismos de heterogeneidad intratumoral se han descrito, incluyendo mutación genética y las interacciones con el microambiente. Además, algunos tipos de cáncer pueden contener una jerarquía celular con una subpoblación de células madre de cáncer (CSC) que exhibe las propiedades de capacidad iniciadoras del tumor y la auto-renovación en ensayos de trasplante de serie 2-5. Inicialmente descrito en hematológica 6, 7 de mama, cerebro y 8 tumores malignos, células madre cancerosas también se han estudiado en el cáncer de próstata 9-12, así como otros tipos de tumores 2-5.
CSC se consideran generalmente una fracción celular dentro de una población heterogénea 2-5. Por lo tanto, la caracterización funcional y molecular de las células madre cancerosas depende de su enriquecimiento de poblaciones a granel. En consecuencia, durante las últimas dos décadas se reunieron varioshodologies de enriquecimiento CSC se han ideado que típicamente implica la separación de las poblaciones marcadas por citometría de flujo. Además, una consideración importante en el estudio de las células madre cancerosas es que la organización jerárquica de los tejidos humanos puede ser alterada por las manipulaciones experimentales tales como pases seriados en cultivos o inmunodeficientes ratones. Como resultado, el aislamiento directo de células madre cancerosas de los tejidos humanos ha surgido como una metodología importante en el campo de CSC.
El cáncer de próstata es una causa principal de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos y en todo el mundo 13 cáncer. Por lo tanto, el aislamiento y la caracterización biológica de células madre cancerosas de la próstata es de interés significativo. CSC próstata previamente se han enriquecido a partir de líneas celulares, los pacientes derivados xenoinjertos, y los pacientes derivados de cultivos en suspensión de bajo pasaje 9,10,12,14.
Recientemente hemos informado el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata directamente de s quirúrgicos humanosejemplos en virtud de su fenotipo de la superficie celular-HLAI negativo 10. A continuación te detallamos los procedimientos aplicados para el aislamiento de estas células. Los tumores de próstata se cosechan a partir de muestras quirúrgicas y se convierten en células en suspensión. Después las células se tiñeron utilizando anticuerpos contra HLAI así como marcadores del estroma y de viabilidad, y células madre cancerosas son aisladas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). CSC aisladas se pueden utilizar para los ensayos que requieren células viables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el aislamiento de células madre cancerosas a partir de tejidos de cáncer de próstata humana fresca. Varias consideraciones importantes influyen en el éxito de este protocolo.
La recuperación de un gran número de células de cáncer de próstata viables depende de una evaluación cuidadosa de las muestras brutas quirúrgicas. En nuestra experiencia, el éxito en el aislamiento de células de la próstata tumorigénicos se asegura mejor cuando se observan y se pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Hariri Familia y la Fundación TJ Martell.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
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