Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

Summary

Isoleringen av kreft stamceller (CSCS) direkte fra humane vev er nødvendige for deres biologiske karakterisering. Dette manuskriptet beskriver en metode for isolering av prostata CSCS fra menneskelig vev, samtidig gir tips om feilsøking vanskelige trinn.

Abstract

Kreften stamcelle (CSC) modellen er betydelig revisited i løpet av de siste to tiårene. I løpet av denne tiden CSCS har blitt identifisert og isolert direkte fra humane vev og serielt dyrket i immundefekte mus, vanligvis gjennom antistoffmerking av subpopulasjoner av celler og fraksjonering ved strømningscytometri. Imidlertid har de unike kliniske funksjoner av prostata kreft betraktelig begrenset studiet av prostata CSCS fra friske humane tumorprøver. Vi har nylig rapportert isolering av prostata CSCS direkte fra humant vev på grunn av HLA klasse I (HLAI)-negativ fenotype. Prostatakreftceller er høstet fra kirurgiske prøver og mekanisk dissosiert. En cellesuspensjon blir generert, og som er merket med fluorescently konjugerte HLAI og stromale antistoffer. Subpopulasjoner av HLAI-negative celler er til slutt isolert ved anvendelse av et flowcytometer. Den viktigste begrensning av denne protokollen er det ofte mikroskopiske og multifokal naturprimære kreft i prostatektomi prøver. Likevel, isolerte levende prostata CSCS er egnet for molekylær karakterisering og funksjonelle validering ved transplantasjon i immunsvikt mus.

Introduction

Intratumoral heterogenitet er ansett å være et kjennetegn på kreft ^en. Faktisk har mange mekanismer for intratumoral heterogenitet blitt beskrevet, inklusive genetisk mutasjon og interaksjoner med mikromiljøet. I tillegg kan noen kreftformer inneholde en cellulær hierarki med en subpopulasjon av kreft stamceller (CSCS) som oppviser egenskapene til tumor initiere kapasitet og selvfornyelse i serietransplantasjon assays ^2-5. Utgangspunktet er beskrevet i hematologisk ^6, bryst ^7, og hjernen ⁸ maligniteter, har CSCS også blitt undersøkt i prostatakreft ^9-12, så vel som andre tumortyper ^2-5.

CSCS er generelt ansett som en cellulær brøkdel innenfor en heterogen befolkning ^2-5. Derfor er funksjonell og molekylær karakterisering av CSCS betinget av deres berikelse fra bulk populasjoner. Følgelig, i løpet av de siste to tiårene flere møttehodologies av CSC anrikning har blitt utviklet som typisk involverer separasjon av merket populasjoner ved strømningscytometri. I tillegg er en betydelig faktor i studiet av CSCS at den hierarkiske organiseringen av menneskelig vev kan bli avbrutt av eksperimentelle manipulasjoner slik som seriepassaging i kultur eller i immundefekte mus. Som et resultat, har den direkte isolering av CSCS fra humant vev dukket opp som et viktig metode i CSC-feltet.

Prostatakreft er en ledende årsak til kreft sykelighet og dødelighet i USA og rundt om i verden ^13. Derfor er isolert og biologisk karakterisering av prostata CSCS av betydelig interesse. Prostata CSCS har tidligere blitt beriket fra cellelinjer, pasient avledet xenograftene og lav passasje pasient avledet suspensjonskulturer ^9,10,12,14.

Vi har nylig rapportert isolering av prostata CSCS direkte fra humane kirurgiske samples i kraft av sin HLAI-negative celleoverflaten fenotype ^10. Her har vi detalj fremgangsmåtene implementeres for isolering av disse cellene. Prostatakreft er høstet fra kirurgiske prøver og gjort til cellesuspensjoner. Celler blir deretter farget med antistoffer mot HLAI samt stromale og levedyktighet markører, og CSCS blir isolert ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Isolerte CSCS kan deretter brukes for analyser som krever levedyktige celler.

Protocol

En. Fangst og foredling av menneskelig prostatakreft Vev fra Kirurgiske prøver Forbered to 50 ml polystyren koniske rør inneholdende 15 ml av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Patologi servicepersonell høste primær og metastatisk prostatakreft prøver fra prostatektomi og palliativ kirurgi prøver, med henholdsvis en Institutional Review Board godkjent protokoll. Metastatisk prøver kan fås fra l…

Representative Results

Figur 1. Humant prostata cancer tumor høsting og flowcytometri plott som illustrerer spesifikke populasjoner fra en human prostatakreft. (A) Tumor knuter høstes for å generere en cellesuspensjon. Tumor innholdet i den behandlede prøve er bekreftet ved hjelp av konvensjonelle Hematoxylin og Eosin farging. (B)<…

Discussion

Denne protokollen beskriver isolering av CSCS fra frisk human prostata kreftvevet. Flere viktige hensyn påvirke det vellykkede resultatet av denne protokollen.

Utvinningen av et høyt antall levedyktige prostatakreftceller er avhengig av forsiktig grov vurdering av kirurgiske prøver. I vår erfaring, er en vellykket isolering av tumorigene prostata celler best sikret når makroskopiske tumor knuter er observert og behandlet ^10.

Men nå til dags prim?…

Materials

RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning cell gro	21-031-CM
60 mm-15 mm cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conial tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tune	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	ebioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480