Isoleringen af kræft stamceller (CSCS) direkte fra humane væv er nødvendige for deres biologiske karakterisering. Dette håndskrift beskriver en metode til isolering af prostata CSCs fra humane væv, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.
Den kræft stamceller (CSC) model er blevet betydeligt revisited løbet af de sidste to årtier. I løbet af denne tid er blevet identificeret CSCs og direkte isoleret fra humane væv og serielt opformeret i immunsvækkede mus, typisk gennem antistof mærkning af subpopulationer af celler og fraktionering ved flowcytometri. Imidlertid har de unikke kliniske træk ved prostatakræft betydeligt begrænset undersøgelse af prostata CSCs fra friske humane tumorprøver. Vi har for nylig rapporteret isolering af prostata CSCs direkte fra humane væv i kraft af deres HLA klasse I (HLAI)-negative fænotype. Prostata cancer celler høstes fra kirurgiske prøver og mekanisk dissocieret. En celle suspension genereres og mærket med fluorescens konjugerede HLAI og stromale antistoffer. Subpopulationer af HLAI-negative celler er endelig isoleres under anvendelse af et flowcytometer. Den grundlæggende begrænsning af denne protokol er den ofte mikroskopiske og multifokal karakterprimær kræft i prostatektomi prøver. Ikke desto mindre, isolerede levende prostata CSCs er velegnede til molekylær karakterisering og funktionel validering af transplantation i immunsvækkede mus.
Intratumoral heterogenitet anses for at være kendetegnende for kræft 1. Faktisk har flere mekanismer intratumoral heterogenitet er blevet beskrevet, herunder genetisk mutation og interaktioner med mikromiljø. Desuden kan nogle kræftformer indeholde et cellulært hierarki med en delpopulation af cancer stamceller (CSCS), der udviser egenskaberne for tumor-initierende kapacitet og selv-fornyelse i serietransplantation assays 2-5. I første omgang er beskrevet i hæmatologiske 6, bryst 7 og hjerne 8 maligne lidelser, er CSCs også blevet undersøgt i prostatakræft 9-12 samt andre tumortyper 2-5.
CSCs er generelt betragtes som en cellulær fraktion i en heterogen population 2-5. Derfor er det funktionelle og molekylær karakterisering af CSCs er betinget af deres berigelse fra bulk befolkninger. Følgelig løbet af de sidste to årtier adskillige opfyldthodologies CSC berigelse er blevet udtænkt som typisk indebærer adskillelse af mærkede befolkninger ved flowcytometri. Derudover er en væsentlig overvejelse i studiet af CSCs er, at den hierarkiske organisering af humane væv kan forstyrres af eksperimentelle manipulationer såsom seriepassage i kultur eller immunsvækkede mus. Som følge heraf er den direkte isolering af CSCs fra humane væv opstået som en vigtig metode i CSC feltet.
Prostatakræft er en førende årsag til kræft sygelighed og dødelighed i USA og rundt om i verden 13.. Derfor er isolationen og biologisk karakterisering af prostata CSCs er af væsentlig interesse. Prostata CSCs er tidligere blevet beriget fra cellelinjer, patient afledte xenotransplantater og lavpassage patient afledt suspensionskulturer 9,10,12,14.
Vi har for nylig rapporteret isolering af prostata CSCs direkte fra humane kirurgiske ssempler i kraft af deres HLAI-negative celle overflade fænotype 10. Her har vi detaljeret de procedurer, til isolering af disse celler. Prostatatumorer høstes fra kirurgiske prøver og gjort til cellesuspensioner. Cellerne farves derefter ved hjælp af antistoffer mod HLAI samt stromale og levedygtighed markører, og CSCs isoleres ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Isolerede CSCs kan derefter anvendes til assays, der kræver levende celler.
Denne protokol beskriver isoleringen af CSCs fra friske humane prostata cancer væv. Flere vigtige overvejelser påvirke det vellykkede resultat af denne protokol.
Genopretningen af høje antal af levedygtige prostatacancerceller er afhængig af omhyggelig brutto vurdering af kirurgiske prøver. Det er vores erfaring, er den vellykkede isolering af tumorigene prostata celler bedst sikret, når makroskopiske tumorknuder observeres og behandles 10.
<p class="jove_con…The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Hariri Family Foundation og TJ Martell Foundation.
RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
DAPI | Invitrogen | d3571 | |
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |