Summary
En almindelig proteinekstraktion protokol hjælp urea / thiourinstof / SDS buffer for mennesker og mus hjernevæv tillader Identifikation af proteiner ved 2D-DIGE og deres efterfølgende karakterisering af mini 2DE immunoblotting. Denne metode gør det muligt at opnå mere reproducerbare og pålidelige resultater fra humane biopsier og eksperimentelle modeller.
Abstract
To-dimensional gelelektroforese (2DE) er et kraftfuldt værktøj til at afdække proteommønstrene modifikationer potentielt relateret til forskellige fysiologiske eller patologiske tilstande. Dybest set er denne teknik er baseret på adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt i et første trin, og for det andet efter deres molekylvægte ved SDS polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). I denne rapport en optimeret prøveforberedelse protokol for lille mængde af menneskelig post mortem og mus hjernevæv er beskrevet. Denne metode gør det muligt at udføre både todimensional fluorescens forskel gelelektroforese (2D-DIGE) og mini 2DE immunoblotting. Kombinationen af disse metoder gør det muligt ikke kun at finde nye proteiner og / eller protein modifikationer i deres udtryk, takket være dens forenelighed med massespektrometri detektion, men også en ny indsigt i markører validering. Således mini-2DE koblet til Western blotting tilladelser til at identificere og validere indlæg-Translationelle modifikationer, proteiner katabolisme og giver en kvalitativ sammenligning mellem forskellige forhold og / eller behandlinger. Heri giver vi en metode til at studere dele af protein aggregater fundet i AD og Lewy body demens, såsom amyloid-beta-peptid og alfa-synuclein. Vores metode kan således tilpasses til analyse af proteomet og uopløselige proteiner ekstrakt fra humane hjernevæv og musemodeller også. Parallelt hermed kan det give nyttige oplysninger for studiet af molekylære og cellulære pathways involveret i neurodegenerative sygdomme samt potentielle nye biomarkører og terapeutiske mål.
Introduction
Mentale og neurologiske lidelser udgør 13% af den globale sygdomsbyrde skal nye udfordringer som patofysiologiske mekanismer, risikofaktorer og prodromal biomarkører blive udforsket 1. I overensstemmelse med denne målsætning proteomics undersøgelser af den menneskelige hjerne, blevet uundværlige til at afdække molekylære veje involveret i processer som hukommelse, adfærd, følelser og neuronal plasticitet for eksempel, ikke kun for fysiologisk, men også for patologiske tilstande. Derfor er brugen af dyremodeller og mere specifikt den transgene mus, bringer en bred vifte af muligheder for at efterligne ætiologien af humane neurodegenerative sygdomme 2.
Proteomics metoder er i dag til rådighed for at nå disse nye perspektiver i neurovidenskab felt. To-dimensionel gelelektroforese (2DE) er en potent og sandsynligvis simpel metode, som gør det muligt at sammenligne proteom af en bred vifte af prøver. Desuden er det også enkraftfuld metode til at isolere et protein fra en kompleks blanding med henblik på at identificere og foretage yderligere analyser ved massespektrometri. Denne teknik består i det væsentlige i to på hinanden følgende trin: 1)-protein separation i henhold til deres isoelektriske punkt (pI) ved isoelektrofokusering (IEF). Mere præcist er en elektrisk spænding anvendes på tværs immobilin acrylamid strips blandt en pH-gradient og derefter proteiner vil migrere og fokusere på en bestemt pI i funktion af deres globale net ladning. 2) Isoelectrically fokuserede proteiner denatureres og negativt ladede ved tilsætning af natriumdodecylsulfat (SDS), derved proteiner i deres første struktur adskilles afhængig af deres tilsyneladende molekylvægt (MW) ved SDS-PAGE 3. Disse to distinkte egenskaber tillade os at tackle en dobbelt værdi at gå videre i studiet af proteom. På den ene side har denne fremgangsmåde giver mulighed for at foretage en kvantitativ analyse ved hjælp af minimal farvestoffer 2D-DIGE metode, og på den anden side en Qualitative analyse af mini-2DE koblet til western blotting.
Kvantitativ analyse af 2D-DIGE skænker protein udtryk ændrer hele prøven proteomet. Kort fortalt prøver mærket med tre cyaniner (Cy2, Cy3 og Cy5) udsender ved tre forskellige bølgelængder (blå, grøn og rød). Disse fluor minimale farvestoffer indeholdende N-hydroxy-succinimidylester gruppe reagerer med ε-aminogruppen af lysiner rester af proteiner resulterer i covalente amidbindinger 4. Lysinaminosyrer mærkes kun mellem 1-3% og dermed forhindre flere etiketter tillæg pr protein og større netto charge modifikationer 5, 6. Cy3 og Cy5 bruges ofte til at mærke to uafhængige stikprøver, mens Cy2 tags en blanding af lige andel af prøverne til sammenligningen. De to væsentligste fordele er, at alle mærkede prøver blandes og IEF og SDS-PAGE udføres i en gel på én gang for hvert trin, så man undgår den inter variation blandt eksperimenter grund gels sammenligning. Endvidere frembyder en høj tærskel opdagelse på omkring 1 femtomole af protein 7. Geler scannet og 2D software sammenligner 2D gel fluorescens billeder, hvor Cy2 tjener som en intern standard, der giver mulighed for identifikation af statistiske forskelle mellem de spots for deres bageste identifikation ved massespektrometri. 2D analyse software ved hjælp af intern standard opnår en hurtig detektering af mindre end 10% af forskelle mellem prøver med mere end 95% af statistisk tillid 8..
Kvalitativ analyse af mini-2DE er et afgørende skridt for protein karakterisering. Princippet er det samme som tidligere beskrevet for pI-og MW-separation, men i dette tilfælde proteiner overføres fra en lille polyacrylamidgel til en membran og immunoblotting udføres bagefter. Mens den ene dimension gelelektroforese giver ændringer i proteinekspression for en eller flere proteinepitoper i funktion af antistoffet den INFORMATIOn af mini-2DE forlener med to ekstra parametre. For det første ændrer protein isovariants som funktion af pI, hvilket indikerer, at post-translationelle modifikationer kan finde sted. For det andet kan massespektrometri identifikation være tegn på plausible zymogener og kataboliske produkter af proteiner. Derfor ændringer observeret af 2D-DIGE er sandsynligvis tegn på mekanismerne bag ændringer i den globale proteom profil. Opstillinger af immunoblots blandt flere prøver for det samme protein epitop / s af mini-2DE kan afspejle surhedsgraden ændringer kaste lys ind i post-translationelle variationer lidt observerede eller endda ikke ved monodimensional immunblotting 9, 10. Desuden er denne analyse informerer om de potentielle spaltningssteder på grund af kendskabet til PI og MW af de metaboliske rester 11,12.
Kombinationen af disse to teknikker giver en supplerende proteomics analyse. På den ene side 2D-DIGE giver en type forskelle giver mulighed for en præcis isolation af polypeptider, hvis udtryk er anderledes. Disse forskelle består hovedsagelig i udseende eller forsvinden af en plet eller forøgelse / reduktion af intensiteten af en given én efter software-analyse af de fluorescerende geler. Er imidlertid usandsynligt, at forklare arten af ændringen observeret disse observationer af sig selv. Af disse grunde, når polypeptidet er isoleret og identificeret ved massespektrometri, anvendelse af mini-2DE muligt præcist at bekræfte 1) identiteten af proteinet isoleres og 2) arten af forskellen: ændring i isovariant / isoform niveau udtryk, post-translationelle modifikationer og spaltningsprodukter processer f.eks. Det er imidlertid nødvendigt at udvikle en begyndende lysisbuffer foreneligt med 2D-DIGE og med mini-2DE med henblik på at begrænse de potentielle dispersioner som følge af anvendelse af ekstraktionsmidler, protokoller, der er meget forskellige.
I denne artikel, vi bevet en tilpasset protokol til forberedelse, udvinding og ydeevne 2D-DIGE og mini-2DE teknikker til hjernens proteiner, der kommer fra mennesker og mus væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Homogenisering og Total protein Udsugning fra mennesker og mus Brain Tissue
- Hjernevæv homogenisering. Homogenisere hjernevæv 10% (w / v) i 8 M urinstof, 2 M thiourinstof og 1% vægt / vol SDS puffer (UTS) ved hjælp af en Potter glas (for humane prøver) eller Teflon-homogenisator (for mus prøver). Soniker ved 60 Hz 30 pulser med en ultralyd generator anvender 0,5 sek for total væv disintegration 13, 14.
- Bestem proteinkoncentration med Bradford assay, ved hjælp af BSA som standard. Dette UTS buffer udvinding er helt kompatibel med en dimension SDS-PAGE, så længe lysater er ikke over-opvarmet for at undgå carbamylering 15.
- Tilsæt 1% (w / v) Amberlite og inkuberes under forsigtig blanding i løbet af 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter filtrere på 0,22 um sprøjtefiltre og endelig tilføje SDS til urea / thiourinstof løsning. Dette trin reducerer den mængde af urinsyre og isocyansyre, som er i equilibrium med urinstof i opløsning, og lette dens nedbrydning.
- Chloroform / methanol proteinudfældning. Udfældes mellem 100-150 ug protein for 11 cm IPG Strips og 1-1,5 mg til 18 cm dem (uafhængigt på pH-område er valgt til at udføre IEF).
- Udfør alle trinene på is eller ved 4 ° C. Cool chloroform og methanol ved 4 ° C i 30 min før start af copræcipitationsproceduren.
- Tilsæt tre volumener methanol og et rumfang af chloroform til et volumen UTS lysat. Ryst manuelt blandingen og tilsæt tre bind af koldt vand. Vortex i løbet af 1 min og pelletere proteiner ved centrifugering ved 12.000 x g i 30 min ved 4 ° C.
- Supernatanten under anvendelse af en Pasteur-pipette, og der tilsættes tre volumener kold MeOH. Vortex igen og centrifugeres ved 12.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Endelig kassere supernatanten og tørre pelleten under N2.
- Fremstilling af proteiner til 2D analyse.Resuspender protein tørrede pellet i 2D-buffer (8 M urinstof, 2 M thiourinstof suppleret med 4% CHAPS). Vask løsning med Amberlite som angivet ovenfor, og forsøge at holde andelen af 500 ug protein pr 200 pi 2D buffer for 2D-DIGE. Bemærk: 2D buffer kan opbevares ved -80 ° C eller opbevares ved 4 ° C i en uge (for at forhindre urinstof nedbrydning).
- Sonikeres og opbevare prøverne ved -80 ° C, indtil at udføre følgende trin. Bemærkelsesværdigt, kan denne protokol anvendes efter myresyre solubilization af protein aggregater 10. Kort fortalt fordampe myresyre under N2, og pellet resuspenderes som beskrevet.
2. 2D-DIGE
- Prøverne tester kvalitet. Dosis prøver igen med Bradford-metoden. Fortynd 15 ug af proteiner i LDS prøvebuffer, varme ved 37 ° C 15 og læsse på 4-12% polyacrylamidgeler.
- Coomassie-farvning. Farv polyacrylamidgel med 0,1% (w / v) CoomassieBlå G-250, 50% EtOH og 10% (v / v) eddikesyre i mindst 1 time. Lad baggrund affarves natten over i 7% eddikesyre og 10% (v / v) ethanol opløsning.
- Pre-elektroforese mærkning af prøver. Forud for udførelse cyaninfarvestof mærkning kontrollere pH i prøven, hvilket bør være grundlæggende eller endda neutral, da N-hydroxysuccinimid substitution er mere effektiv ved basisk pH og givet at være optimal ved pH 8,6.
- Mærk minimalt de to prøver af studiet med Cy3 eller Cy5 fluorescerende farvestoffer med en ratio på 50 pg protein/400 pmol farvestof og holde i 1 time ved 4 ° C i mørket for at lette NHS-esteren reaktive gruppe af cyaniner med uprotoneret amin grupper af lysiner.
- Reducer prøve variationer gør en cross-mærkning med Cy3 og Cy5 farvestoffer, undgå en privilegeret kobling af én prøve til en bestemt cyanine. Bemærk, at cyanin-farvestof minimal mærkning kan tilpasses til lille mængde af proteiner med at holde andelen af 1 ug protein per 8 pmol cyanin-farvestof. Hvis ja, kan mini-2DE systemet, anvendes i stedet for den store 2D gel system. Dette vil gøre det muligt 2D-DIGE analyse for en lille mængde af hjernevæv.
- Mærk en pulje af begge prøver med den samme mængde protein (50 ug i alt) med Cy2 fluorescerende farvestof og anvendt som intern standard. Brug de samme betingelser som tidligere angivet.
- Komplet til et samlet volumen 350 pi med 2D-puffer indeholdende 1,1% Destreak reagens, 1,2% IPG buffer og spor af bromphenolblåt den samlede 150 ug af mærkede proteiner (50 ug Cy2, 50 ug af Cy3 og 50 ug Cy2). Udfør dette trin i fire eksemplarer med fire uafhængige strimler. Desuden forbereder to yderligere ikke-mærkede bånd (en for hver prøve) med 350-450 ug protein for de præparative geler.
- Lad de seks indlæste strimler dækket med mineralsk olie natten over for passiv rehydrering.
- Isoelektrofokusering. Udføre IEF 206; C. For en pH 3-11NL, 18 cm strimler protokollen er: maksimale strøm er 50 uA / stribe i løbet af 8 trin: 1) 150 V trin i 1 time, 2) 200 V skridt for 5 timer, 3) 500 V gradient for 2 hr, 4) 1000 V gradient i 2 timer, 5) 2.000 V gradient i 2 timer, 6) 4.000 V gradient i 2 timer, 7) 8.000 V gradient i 2 timer og 8) for i alt 24.000 V · t trin . Efter IEF afsende overskud af mineralolie ved kromatografi papir, og opbevar strimlerne ved -20 ° C, indtil den anden dimension.
- IPG Strips ligevægt. Ækvilibrer strimler i 6 M urinstof, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mM Tris-HCI pH 8,6 buffer med 1% af DTT i 15 minutter, og efter 4,7% af iodacetamid i den samme buffer, men uden DTT.
- Anden dimension eller SDS-PAGE elektroforese. Gør seks 12% SDS-PAGE-geler (1,5 M Tris-HCI pH 8,6, 12% acrylamid / bisacrylamid, 0,1% (w / v) SDS, 0,072% (w / v) APS og 0,1% (v / v) TEMED ) på samme tid ved hjælp af en stor 2D system med fire lav fluorescens glasplader for strips med fluorescens prøver og to andre glasplader med 1,5 mm tykkelse for præparative geler for at udskære protein pletter.
- Indlæse seks IPG strips på toppen af gelerne og over lagdelt med 0,5% (w / v) agarose. Running buffer bestående af 25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% (w / v) SDS. Udføre migration på 2,5 W / gel natten over med et kølesystem sat til 4 ° C 16,17.
- Fluorescens billeder erhvervelse og analyse. Brug en Typhoon 9400 scanner for at få fluorescens geler billeder (12 billeder til et eksperiment). Scan Cy2 Cy3 og Cy5 billeder til hver gel på 488/520 nm, 532/580 nm og 630/670 nm excitation / emission bølgelængder, hhv. Brug databehandling software til at analysere billederne. Data er repræsentative for ændringerne i stedet volumen er forbundet med distributionen af signalet på tværs af de fire geler mellem de to undersøgte prøver.
- Coomassie-farvning for store geler. Fix præparative geler 50% (v / v) EtOH og 3% (v / v) orthophosphorsyre opløsning i mindst 24 timer. Så efter vaskes to gange med ultrarent vand i 20 min. Udfør farvning i 34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) ammoniumsulfat og 2% orthophosphorsyre i 1 time før tilsætning af 0,1% (w / v) Coomassie Blue-G-250. Hold geler farvning mindst 48 timer og affarvet i ultrarent vand.
- Spots til MS identifikation. Når fluorescensbilleder analyseres, software giver en liste af pletter, hvis udtryk er statistisk anderledes. Manuelt udskære disse pletter fra de forberedende geler. Denne procedure kræver øvelse og håndelag for at undgå keratin forurening. Derefter prøver kan opbevares i vand ved -20 ° C indtil afsendelse til MS. Spot identifikation er fuldt kompatibel med Tandem massespektrometri (MS / MS) og relevansen af protein identiteter bedømmes efter sandsynligheden baserede Mowse score beregnet med en p-værdi på 0,05 (p <0,05) 18. </ Ol>
3.. Kvalitativ Mini-2DE Assay
- Resuspender højst 100 ug protein prøve i 2D-buffer, indtil en endelig volumen på 200 pi til 11 cm IPG strip. I tilfælde af overekspression system eller oprenset protein, kan grundbeløbet sænkes til 20 ug.
- Tilføj 1,1% (v / v) Destreak reagens, 0,55% (v / v) IPG puffer og spor af bromphenolblåt til et endeligt volumen på 200 ul. Så vortex, lave en hurtig spin og indlæse i en IPG strip for passiv rehydrering (at bringe strimlen til sin oprindelige tykkelse) natten over dækket med mineralsk olie. Bemærk: andelen af IPG buffer er den samme for alle intervallet pH ønskede (pH 3-11, 4-7, 7-11, osv.), men dens sammensætning varierer som funktion af pH-området vælges.
- Isoelectrofocalisation. Udføre IEF ved 20 ° C. Varigheden af programmet afhænger af pH-interval vælges. Bemærkelsesværdige, parametre såsom elektroendosmose kan forstyrre IEF profil og i disse sager,optimering i electrofocalisation tid er nødvendig 19. Bemærk: Det er ikke nødvendigvis en længere IEF, der giver bedre resultater, men afkorte af IEF kan også forbedre opløsningen. Efter IEF kan IPG strips opbevares ved -20 ° C i flere måneder.
- IPG strimler ligevægt. Ækvilibrer strimlerne i en buffer indeholdende 25 mM Tris-HCI pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glycerol, 5% SDS, 0,05% bromphenolblåt. Lav tre ligevægtsindstilling bader i 15 min med at ændre buffer løsning mellem hvert bad.
- SDS-PAGE. Lag IPG strimler på en præfabrikeret gel (IPG en godt, 11 cm IPG strimler) med en procentdel af polyacrylamid vælges afhængigt MW af proteinet af interesse. Derefter duppes gel på en nitrocellulose / PVDF membran ved 100 mV i løbet af 33 min.
- Der inkuberes natten over med den nødvendige antistof og visualisere ved peroxidase aktivitet. Udfør justeringer af immunoblots hjælp uafhængige polypeptider afsløret af det sekundære antistof. Nå en semi-quantittiv analyse af densitometri af mængden og intensiteten for sporene / pletter med ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteomics på hjernevæv forbliver udfordrende, da nogen ideel buffer eksisterer for at genvinde 100% af proteiner, især membran-associeret eller cytoskeleton proteiner. Det første sæt eksperimenter blev fokuseret på søgning efter en egnet lyseringspuffer forenelig med de to tilgange og som gør det muligt at gendanne et stort panel af protein. Således blev tre lysis buffere analyseres for at bestemme den mest hensigtsmæssige. For det første blev det brugt fælles biokemisk og molekylærbiologisk buffer Tris-HCI 20 ved 10 mM med 1% (w / v) SDS (figur 1A). Endvidere Tris-HCI har en robust applikationen som en elektroforese buffer for polyacrylamid og agarosegeler. De to øvrige lysis buffere var UTS (Figur 1B) og 2DE én. Tris-SDS giver en dårlig opløsning og antallet af pletter blev væsentligt sænket (fig. 1B) sammenlignet med den observeret med UTS, hvor en stor plet adskillelse, ingen forvrængning og en far bedre udvinding af proteiner blev observeret (figur 1B). Dette punkt er understøttet af det faktum, at UTS ekstraktionsudbytterne næsten ingen resterende pellet, mens Tris-HCI skylder en tyk ene efter bænk centrifugering. Mønstret viste i figur 1B klart giver bevis for højere proteinindhold opløselighed i UTS om andre buffere, såsom Tris-HCl. Notheworthy at selv 2DE buffer blev også testet, var dens brug udelukkes, idet trods pellet blev hverken observeret, lipider blev ikke opløst, og de forblev i det øverste lag difficulting manipulation. Efter aftale med disse data, anbefales det at anvende UTS buffer for flere grunde 1) dens neutrale kaotrop der denaturerer proteiner ved at forstyrre nonconvalent og ioniske bindinger mellem aminosyrerester og undgå aktiviteten af proteaser som nedbryder cellulære proteiner 21 2) tilsætning thiourinstof til urinstofopløsningen forbedrer drastisk opløseligheden af hydrofobe membranproteinerog proteiner tilbøjelige til aggregat 22, 23 og 3) adjunction af den anioniske detergent SDS bryder lipider binder proteiner via hydrofobe interaktioner, samt øger protease og phosphatase-aktiviteten hæmning 24,25. Endvidere blev det besluttet at tilføje en udfældning skridt til at fjerne impureties der kan forstyrre IEF. På denne måde udfældning metode bestemmes opløseligheden af proteinerne 26 og methanol er allerede blevet beskrevet som den mest egnede opløsningsmiddel for at fjerne lipider, som er rigeligt i hjernevæv, bragte os til at vælge den chloroform / methanol nedbør 27. Udnyttelsen af de zwitterioniske detergent CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propan-sulfonat) og resuspendering proteinerne pelletering i 2D buffer skyldes dens egnethed til at lette protein indgang i trin 28 første dimension.
Profilen for de menneskelige og mus hjerne PRoteome af 2D-DIGE er vist i figur 2A og 2B. I figur 2A sammen fluorescerende billeder fra menneskelig kontrol og kan iagttages AD cortex prøver i figur 2B idem for mus prøver fra hippocampus af en model for AD-lignende Tau patologi 29. Cy2, Cy3 og Cy5 henholdsvis illustreret for de humane prøver i figur 2C-2E. Begge flettede mønstre (figur 2A og 2B) udgør en høj stedet opløsning afspejler en høj kvalitet IEF og anden dimension separation efter aftale med observeret i figur 1B. Denne definition spot kvalitet sammen med den kendsgerning, at cross-linking er udført for at fjerne en eventuel præference af proteinerne til en bestemt cyanin, gøre disse fluorescens billeder (figur 2C-2E) meget let at tilpasse hele software-analyse. Desuden præparative geler farvet med blå Coomassie beviser en beriget kort protein med rigelige spots over hele pH-området udnyttes, tillader en at udskære pletterne efter software analyse og for deres bageste identifikation af MS / MS.
Den kvalitative mini 2DE analyse ved immunoblotting for et protein giver høj værdi oplysninger til identifikation og ændringer, ikke kun for post-translationelle dem, men også for oligomerer og trunkeringerne (3A og 3B). Feasibility at udføre denne teknik i mini 2DE giver hurtige og præcise data om protein af interesse. Med hensyn til væv fra en patient, der lider af Lewy body demens (LBD), karakterisering af alfa-synuclein gør det muligt at visualisere en veldefineret 4-7 pH-profil, hvor det native protein er en pi på 4,67 og en MW på 18 kDa, ikke desto mindre med mini-2DE det yderligere kan ses tilstedeværelsen af dimerer (figur 3A, stjerne), på samme pI end de indfødte former, men også eksistensen af ubiquitinated formularer, der er mere grundlæggende og med en højere MW når mere ubiquitineres de er (figur 3A, pile). Et andet protein tæt forbundet med AD er amyloid-p-peptid, der genereres af den komplekse katabolisme af amyloid-precursorproteinet (APP). I 3B den sammenlignes handlingen i en Sporadisk AD tilfældet med en familiær én. I tilfælde af den velkendte AD det kan observeres, hvordan amyloid-beta 1-42 er reduceret i forhold til den sporadisk AD, og desuden er de isovariants amyloid-beta x-42 (4 kDa) er også nedreguleret hele kampen , i mellemtiden oligomererne findes på 8 kDa afspejler at dette faktum ikke skyldes en lavere mængde af proteinet, da pletter intensitet er mere relevant i velkendte AD (figur 3B).
Figur 1: 2DE profile efter 10 mM Tris 1% SDS w / v buffer ekstraktion (A), og mønsteret opnået efter UTS udnyttelse (B). I panelet B kan det ses, hvordan antallet af pletter, intensitet og opløsning er langt højere end den, panel (A). Brugen af UTS giver mulighed for en næsten total protein udvinding, at det afspejles i 2DE Coomassiefarvning. Klik her for at se større billede.
Figur 2: 2D-Dige-profiler til human (A) og mus (B) er illustreret Billeder (A) og (B) repræsenterer de flettede billeder til de tre cyaniner i en 3-11 pH-område på 18 cm strimmel.. På billederne (C), (D) og (<strong> E) cyaniner udsættes uafhængigt (Cy2 i blå, Cy3 i grønt og Cy5 i rødt). Klik her for at se større billede.
Figur 3: I det øverste panel kan det observeres mini-2DE profil af proteinet alfa synuclein i en LBD patient De indfødte pI (4.4) og MW (18 kDa) ændring i funktion af dimerisering (stjerne) hvor MW. er det dobbelte, og ubiquitination der flytter pI, indtil en mere grundlæggende en (pile) (A). Den ned Billedet afslører profilen af en amyloid-beta-peptid antistof i en sporadisk og genetisk tilfælde af AD. 2DE mønster viser, hvordan oligomerisering og nedbrydning foregå på en anden måde i henhold til ætiologien af disease. Denne immunoblot tydeligt påpeger forskellene i APP katabolisme mellem de to tilstande. På den ene side er der en stigning i kataboliske produkter på i sporadisk AD vedrørende familiær en (pile), medens oligomererne synes at være mindre markant (B). Disse eksperimenter er blevet udført i 11 cm strimler i en 4-7 pH hul i en 12% bis-tris gel og i en 16,5% Tris-Tricine én henholdsvis (A, B). Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opdage patologiske udtryk ændringer af proteiner, søge efter biomarkører og modulering af potentielle veje for farmakologiske mål er blandt målene for de neuroproteomics nærmer 30. Midt i de nye redskaber, den 2DE felt tilføjer en lovende expectative. Alligevel bør konsensus nås med henblik på at minimere variabilitet og øge reproducerbarhed i eksperimenterne. I tråd med denne idé en standardiseret protokol for at udføre 2D-DIGE (figur 2) og den efterfølgende 2DE immunoblotting (Figur 3) for menneskers og mus hjernevæv fuldt kompatibel med mono-dimensional immunoblotting er heri beskrevet i detaljeret.
En af de største dilemmaer i proteomics er solubiliseringsbuffer valg. For at øge reproducerbarheden mellem de forskellige fremgangsmåder blev UTS valgt, da det er helt forenelig med IEF. Endvidere UTS ekstraktionsbuffer giver ingen pellet eller en rigtig lille én efter centrifugering ved 12.000 xg (ikke at forveksle med SDS udfældning ved 4 ° C). Dette er et afgørende punkt under hensyntagen til at mange neurodegenerative lidelser tilstedeværende proteiner sammenlægning, herunder AD. Det faktum, at der ikke er pellet simplificerer ydeevne og data fortolkning, da ingen uafhængige undersøgelser bør gøres for opløselige og ikke-opløselige fraktion.
Uanset 2D-Dige eller mini-2D tilgange kommer til at blive udført, er der nogle begrænsninger, der skal angives. For det første de kemiske egenskaber af UTS buffer, denne løsning må ikke overophedet, eller der opstår carbamylering på primære aminer og kan derfor interferere med både cyaninfarvestof kobling og 2D profil, forværring pletter opløsning ved at ændre IEF 15. For det andet, de tilgængelige pH-områder, i dag det bredeste pH interval er blandt 3 til 11, denne faktor er sluttet til sandsynligheden for, at ikke alle proteiner indtræden på IPG strimlen kan Nuernbergain de stablede proteiner bands i begge sider af geler efter farvning. Denne begrænsning kan forklare hvorfor ikke hele proteom kan studeres af 2D. En anden vigtig begrænsning er kontrovers brug af nedbøren. På den ene side er det meget anbefalelsesværdigt at gøre udfældningstrinnet med chloroform / methanol, der gør det muligt effektivt at reducere lipidindholdet 27, salte, nukleinsyrer og ladede rengøringsmidler, der kan interferere med IEF parametre, og påvirker opløsningen og / eller reproducerbarhed 2D. Desuden er der på den anden side kan det ikke udelukkes, at nogle proteiner stærkt knyttet til membranen kan gå tabt. Ikke desto mindre, i tilfælde af at andre ekstraktionsmidler buffere anvendes i stedet for UTS, enten med eller uden tilsætning af proteaser eller phosphataser inhibitorer, anvendelse af udfældningstrinnet anbefales at faldgruber i IEF. Endelig er det bemærkelsesværdigt, at 2D-Dige billeder analyse præsenterer den ulempe, overlappede fluorescenspletter kan føre til et tab af information, da software analyse anser ikke dette som en betydelig variation.
Det nye ved denne kombinerede metode ligger i deres reproducerbarhed, alsidighed og proteiner karakterisering. Kun en ekstraktionspuffer gør det muligt at udføre to komplementære teknikker. 2D-DIGE giver kvantitative oplysninger om proteiner udtryk ændringer og efterfølgende identifikation af MS / MS. Det er imidlertid muligt, at isoformer, isovariants, zymogener, post-translationelle modifikationer og kataboliske produkter, der ikke kunne identificeres, da det overlappede fluorescens med andre proteiner. For at overvinde denne begrænsning foreslås parallelt brugen af mini-2DE. I virkeligheden, til vores viden en af de vigtigste faldgrube, der kan begås er at tage mono-dimensionelle immunblotning som en fuldstændig validering af resultaterne 2D-Dige, eller endda til at overveje, at enhver proteomics ændring er ikke nødvendigt at validere. Furthermore, tekniske fordele ved mini 2DE er 1) muligheden for at bruge små SDS-PAGE-systemer, 2) den relativt lave materiale nødvendig, 3) de brede intervaller af pH til rådighed, 4) immunoblot sensibilitet og 5) den nemme estimering af ændringer. Fussiest aspekter af mini 2DE teknik er kvantificering trods mini-2DE ikke kan betragtes som en kvantitativ tilgang, efter pletter eller plots justering er det muligt at etablere et forhold mellem det sure og grundlæggende del eller omvendt, møblering på denne måde en pålidelig estimering af de observerede ændringer 9.
Adskillige data i litteraturen nøjagtig brug mini-2DE at opnå protein karakterisering, såsom overudtrykt proteiner med og uden posttranslationel modifikation 31, oligomeriserende og nedbrydningsveje beskrevet for demens med Lewy-legemer 32,33 og i figur 3A til en AD patient. Et andet eksempel på de oplysninger, som m ini 2DE er afkortningen af beta amyloid arter udføres i ikke-demente og ad tilfælde som et potentielt mål for vaccination tilgang 34. Tilstedeværelsen af oligomerer og dens differentielt nedbrydning er også vist i figur 3B afhængigt af en sporadisk eller velkendt AD patient. Herudover åbner mini 2DE tilgang en bred og praktisk vindue af muligheder, da forskellige behandlinger kan udføres. For eksempel inden for AD, kan phosphataseinhibitorer tilføjes og afdække deres indflydelse i Tau fosforylering. Også den farmakologiske stoffer effekt på proteolysesteder veje, idet PI og MW identifikation af de afkortede former kan give spaltningsstedet ifølge antistoffets epitop 34. Interessant nok har de seneste data belyst ved hjælp af mini-2DE sammenslutningen af livsstil og medicinsk behandling med kognitive svækkelser i musemodeller, samt biokemisk profil af en ny Tau mutation 35-37.
ntent "> Udvikling af en metode til måling af 2D-DIGE af hjernevæv få fra mennesker eller mus oprindelse samt validering med bag mini-2DE, kan kaste lys ind afdække nye farmakologiske mål og biomarkører for studiet af neurologiske sygdomme. Det faktum, at disse sygdomme har deres oprindelse i hjernen, tvinge til at studere dette organ som en ideel informationskilde. dog humane prøver er begrænset, så brugen af dyremodeller bliver nødvendig for at nå dette mål. Heri betydningen af at bruge metoder i parallelt for begge typer af prøver og validere resultaterne. Det er ønskeligt, at pålidelige kandidater i den nærmeste fremtid vil blive fundet og testet i kropslige væsker, såsom plasma og cerebrospinalvæske for at etablere en tidlig diagnose, vurdering af sygdomsprogression og i sidste ende evalueringen af de plausible behandlinger til rådighed.Der skal tages hensyn til kritiske skridt i protokollen for sin suitable ansøgning. I tilfælde af 2D-DIGE prøver test kvalitet er et afgørende punkt. Denne test tillader at vide proteiner profil og validere den reelle mængde af proteiner opsamler den eksisterende i 2D buffer efter nedbør. Farvede profiler give os oplysninger om kvaliteten og ensartetheden mellem prøverne. Kun prøver med lignende mønstre skal anvendes for 2D-Dige undersøgelser ellers 2D-DIGE kan føre til dårlig farvning og dårlig opløsning af protein profil. Forskelle i disse prøver mønstre er mere almindeligt i den menneskelige end i mus hjernevæv, da menneskelige hjerne prøver til forskning beskæftige sig med mange ubekvemme 38,39. Desuden har identifikationen af protein nedbrydning på grund af post mortem interval allerede blevet rapporteret af 2D-DIGE 40,41. Kontrol af pH før cyaninfarvestof mærkning, skal dette trin forringe al posterior procedure. Cyaninfarvestof mærkning og SDS-PAGE-elektroforese bør ske i mørke sommeget som muligt for ikke at påvirke fluorescensmærkning. Endelig skal polyacrylamidgeler være så ensartet som muligt blandt dem, for at fjerne inter-variabilitet i elektroforetisk migration og lette overlapper mønstrene og bageste analyse 42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har nogen interessekonflikt til at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Inserm, University of Lille 2, MEDIALZ, LABEX (excellence laboratorium, program investere i fremtiden) og DISTALZ (udvikling af nyskabende strategier for en tværfaglig tilgang til Alzheimers sygdom). FJ.FG er i øjeblikket en modtager stipendium af ANR (fransk National Research Agency / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), men dette arbejde var også under støtte fra en bevilling fra JCCM (Spanien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
