Summary
Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.
Abstract
Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Proteom Änderungen möglicherweise zu verschiedenen physiologischen oder pathologischen Bedingungen im Zusammenhang aufzudecken. Grundsätzlich ist dieses Verfahren auf die Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in einem ersten Schritt, und zum anderen nach ihrem Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf. In diesem Bericht ein optimiertes Protokoll für die Probenvorbereitung kleine Menge von menschlichen post-mortem Hirngewebe und Maus beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht es, sowohl die Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese zweidimensionalen (2D-DIGE) und Mini-2DE-Immunoblotting durchzuführen. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht es, nicht nur neue Proteine und / oder Proteinmodifikationen finden in ihrem Ausdruck durch seine Kompatibilität mit Massenspektrometrie-Erkennung, sondern auch einen neuen Einblick in die Marker-Validierung. So, Mini-2DE zu Western-Blot-Genehmigungen verbunden zu identifizieren und zu validieren Post-Translationale Modifikationen, Proteine Katabolismus und bietet einen qualitativen Vergleich zwischen den verschiedenen Bedingungen und / oder Behandlungen. Hier stellen wir eine Methode, um Komponenten von Proteinaggregaten in AD und Lewy-Körper-Demenz, wie der Amyloid-beta-Peptid und dem Alpha-Synuclein gefunden studieren. Unser Verfahren kann somit für die Analyse des Proteoms angepasst und unlösliche Proteine extrahiert aus menschlichem Hirngewebe und Mäuse-Modellen zu. Parallel dazu kann es nützliche Informationen für die Untersuchung von molekularen und zellulären Signalwege bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie potenzielle neue Biomarker und therapeutische Targets beteiligt sind.
Introduction
Psychische und neurologische Störungen repräsentieren 13% der globalen Krankheitslast, müssen neue Herausforderungen wie die pathophysiologischen Mechanismen, Risikofaktoren und Biomarker erforscht prodromal 1 werden. Im Einklang mit diesem Ziel, Proteomik-Studien des menschlichen Gehirns unverzichtbar geworden, um molekulare Signalwege in Prozesse wie Gedächtnis, Verhalten, Emotionen und neuronale Plastizität zum Beispiel, nicht nur für die physiologische, sondern auch für pathologische Zustände beteiligt aufzudecken. Daher ist die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere die transgenen Mäuse, bringt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Entstehung von menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen 2 nachzuahmen.
Proteomics Ansätze sind, um diese neue Perspektiven im Bereich der Neurowissenschaften zu erreichen heutzutage. Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein potenter und wahrscheinlich einfache Methode, um das Proteom von einer Vielzahl von Proben vergleichen können. Darüber hinaus ist es auch eineleistungsfähige Methode, um ein Protein aus einem komplexen Gemisch, um zu identifizieren und zu isolieren, weiter zu analysieren, durch Massenspektrometrie. Diese Technik besteht im wesentlichen in zwei aufeinanderfolgenden Stufen: 1) Proteintrennung nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) von Isoelektrofokussierung (IEF). Genauer gesagt, wird ein elektrisches Potential über die Immobilin Acrylamid Streifen unter einem pH-Gradienten aufgetragen und dann Proteine wandern und sich auf einen bestimmten pI in Abhängigkeit von ihrer globalen Nettoladung. 2) isoelektrisch fokussiert Proteine denaturiert und negativ durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS geladen), wodurch Proteine in ihrer ersten Struktur werden je nach ihrem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von SDS-PAGE 3 getrennt. Diese zwei unterschiedlichen Eigenschaften ermöglichen es uns, einen double-Wert, weiter in der Studie des Proteoms gehen zu bewältigen. Auf der einen Seite dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, eine quantitative Analyse mit minimalen Farbstoffe 2D-DIGE-Verfahren durchzuführen, und auf der anderen Seite ein qualitaive Analyse von Mini-2DE zu Western-Blot gekoppelt.
Quantitative Analyse von 2D-DIGE verleiht Protein-Expression ändert sich über die Probe Proteom. Kurz gesagt werden Proben mit drei Cyanine (Cy2, Cy3 und Cy5) Emission bei drei verschiedenen Wellenlängen (blau, grün und rot) markiert. Diese Fluor minimal Farbstoffe N-Hydroxy Succinimidylester-Gruppe enthaltenden reagieren mit der ε-Aminogruppe der Lysinreste von Proteinen, was zu kovalenter Amid-Bindungen 4. Lysinreste werden nur zwischen 1-3% und damit verhindert, dass mehrere Etiketten zusätzlich pro Protein und die wichtigsten Änderungen der Nettoladung 5, 6 gekennzeichnet. Cy3 und Cy5 werden oft verwendet, um zwei unabhängige Stichproben zu kennzeichnen, während Cy2 Tags eine Mischung aus gleichen Teilen der Proben zu vergleichen. Die beiden wichtigsten Vorteile sind, dass alle markierten Proben werden gemischt und IEF und SDS-PAGE sind in ein Gel auf einmal für jeden Schritt durchgeführt, die Vermeidung der inter Variabilität unter Experimente durch Vergleich geliert. Darüber hinaus stellt es eine hohe Detektionsschwelle von rund 1 Femtomol von Protein 7. Gele werden gescannt und 2D-Software vergleicht die 2D-Gel-Fluoreszenzbilder, wo Cy2 dient als interner Standard, die eine Identifizierung der statistischen Unterschiede zwischen den Stellen für ihren hinteren Identifizierung durch Massenspektrometrie. Das 2D-Analyse-Software mit dem internen Standard erreicht eine schnelle Erkennung von weniger als 10% der Unterschiede zwischen den Proben mit mehr als 95% der statistischen Vertrauens 8.
Qualitative Analyse von Mini-2DE ist ein entscheidender Schritt für die Proteincharakterisierung. Das Prinzip ist das gleiche, wie zuvor für PI-und MW-Trennung beschrieben, aber in diesem Fall Proteine werden von einer kleinen Polyacrylamid-Gel auf eine Membran übertragen und Immunoblot wird danach durchgeführt. Während einer Dimension Gelelektrophorese stellt Veränderungen in der Proteinexpression für ein oder mehrere Protein-Epitope in Funktion des Antikörpers, der INFORMATIOn von Mini-2DE verleiht mit zwei zusätzlichen Parametern. Erstens ändern die Protein isovariants in Abhängigkeit von der pI, die anzeigt, dass post-translationale Modifikationen stattfinden könnten. Zweitens kann die Massenspektrometrie Identifizierung bezeichnend für plausibel Zymogene und Abbauprodukte von Proteinen sein. Daher sind durch 2D-DIGE beobachtet Modifikationen wahrscheinlich ein Indikator für die zugrunde liegenden Mechanismen Veränderungen in der globalen Proteom-Profil. Alignments von Immunoblots unter mehreren Proben für das gleiche Protein-Epitop / s Mini-2DE kann Säure Veränderungen beleuchten in post-translationale Variationen etwas beobachtet oder gar nicht von eindimensionalen Immunoblotting 9, 10 reflektieren. Darüber hinaus informiert diese Analyse über die möglichen Spaltstellen aufgrund der Kenntnis des pI und MW der Stoffwechselrückstände 11,12.
Die Kombination dieser beiden Techniken eine komplementäre Proteomik-Analyse. Auf der einen Seite 2D-DIGE bietet einen typ.e von Unterschieden ermöglicht eine präzise Trennung von Polypeptiden, deren Expression ist anders. Diese Unterschiede bestehen im wesentlichen in das Auftreten oder Verschwinden eines Flecks oder Zunahme / Abnahme der Intensität einer durch eine Software-Analyse der Fluoreszenz Gele. Jedoch sind diese Beobachtungen selbst kaum die Natur der beobachteten Änderung erklären. Aus diesen Gründen einmal das Polypeptid isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert, die Verwendung von Mini-2DE ermöglicht, genau zu bestätigen 1) die Identität des Proteins isoliert und 2) die Art der Unterschied: Änderung in der isovariant / Isoform Niveau Expression, posttranslationale Modifikationen und Spaltprozesse zum Beispiel. Jedoch ist es notwendig, einen Ausgangs Lysepuffer sowohl 2D-DIGE und mit Mini-2DE kompatibel sein, um die möglichen Dispersionen durch die Verwendung von Extraktionsprotokollen, die sehr unähnlich zu begrenzen entwickeln.
In dem vorliegenden Artikel werden wir debeschrieben eine angepasste Protokoll für die Vorbereitung, Extraktion und die Leistung der 2D-DIGE und Mini-2DE Techniken zur Gehirnproteine aus humanen und Maus-Gewebe.
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Protocol
1. Homogenisierung und Gesamtproteinextraktion aus Mensch und Maus Gehirngewebe
- Hirngewebe Homogenisierung. Homogenisieren des Gehirngewebes 10% (w / v) in 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 1% w / v SDS-Puffer (UTS) mit einem Potter-Glas (für menschliche Proben) oder Teflon-Homogenisator (für Mäuse Proben). Ultraschallbad bei 60 Hz 30 Impulse mit einer Ultraschallgenerator, indem 0,5 sec für die Gesamt Gewebe Zerfall 13, 14.
- Bestimmen Proteinkonzentration mit Bradford-Test, mit BSA als Standard. Diese Extraktionspuffer UTS ist völlig kompatibel mit einer Dimension SDS-PAGE solange Lysaten nicht überhitzt zu Carbamylierung 15 zu vermeiden.
- 1% (w / v) und Amberlite inkubieren unter leichtem Mischen während 10 min bei Raumtemperatur. Danach auf 0,22 um Spritzenfilter filtern und schließlich auf die Harnstoff / Thioharnstoff-Lösung fügen Sie den SDS. Dieser Schritt die Menge von Harnsäure und Isocyansäure, die in equilibr sind reduziertium mit Harnstoff in Lösung und deren Abbau erleichtern.
- Chloroform / Methanol-Proteinfällung. Man fällt zwischen 100-150 ug Protein für 11 cm IPG-Streifen und 1 bis 1,5 mg für 18 cm Einsen (unabhängig vom pH-Bereich gewählt, um die IEF durchzuführen).
- Alle Schritte auf Eis oder bei 4 ° C. Kühlen Chloroform und Methanol bei 4 ° C für 30 min vor dem Beginn der Fällungsverfahren.
- Hinzufügen von drei Volumina Methanol und einem Volumen Chloroform zu einem Volumen UTS Lysat. Schütteln Sie die Mischung manuell und fügen Sie drei Volumina kaltem Wasser. Wirbel während 1 min pelle die Proteine durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 30 min bei 4 ° C.
- Verwerfen des Überstandes mit einer Pasteurpipette und fügen Sie drei Volumina kaltem MeOH. Wirbel immer Zentrifuge bei 12.000 × g während 30 min bei 4 ° C. Schließlich Stand verwerfen und das Pellet trocknen unter N 2.
- Herstellung von Proteinen für die 2D-Analyse.Resuspendieren des Protein-getrocknete Pellet in 2D-Puffer (8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff mit 4% CHAPS ergänzt). Waschen der Lösung mit Amberlite wie oben angegeben, und versuchen, den Anteil von 500 &mgr; g Protein pro 200 ul Puffer für 2D-2D-DIGE halten. Hinweis: 2D-Puffer bei -80 º C gelagert oder bei 4 ° C während einer Woche gehalten (Harnstoffabbau zu verhindern) werden.
- Ultraschallbad und speichern die Proben bei -80 ° C bis die Durchführung der folgenden Schritt. Bemerkenswert, kann dieses Protokoll verwendet werden, nachdem Ameisensäure Solubilisierung von Protein-Aggregate 10. Kurz gesagt, verdampfen Ameisensäure unter N 2 und das Pellet wie beschrieben.
2. 2D-DIGE
- Proben testen Qualität. Dose Proben erneut mit Ford-Methode. Verdünnen Sie 15 ug von Proteinen in LDS-Probenpuffer, Wärme bei 37 ° C 15 und laden auf 4-12% Polyacrylamid-Gelen.
- Coomassie-Färbung. Fleck-Polyacrylamid-Gel mit 0,1% (w / v) CoomassieBlue G-250, 50% EtOH und 10% (v / v) Essigsäure-Lösung für mindestens 1 Stunde. Hintergrund ließ über Nacht in 7% Essigsäure und 10% (v / v) Ethanollösung entfärben.
- Pre-elektrophoretische Kennzeichnung der Proben. Vor der Durchführung Cyaninfarbstoff Kennzeichnung, ob der pH-Wert der Probe, die Basis-oder auch neutral sein sollte, da die N-Hydroxysuccinimid-Substitution ist effizienter bei basischem pH-Wert und bei optimaler pH 8,6 sein.
- Beschriften Sie die minimal zwei Proben Studie mit Cy3 oder Cy5 Fluoreszenzfarbstoffe mit einem Verhältnis von 50 ug protein/400 pmol Farbstoff und halten für 1 h bei 4 ° C in der Dunkelheit, die NHS-Ester reaktiven Gruppe der Cyanine mit der unprotonierten Amin erleichtern Gruppen der Lysine.
- Reduzieren Probe Variationen, einen Quer Markierung mit Cy3 und Cy5 Farbstoffen, die Vermeidung einer Vorzugs Kupplung einer Probe zu einem bestimmten Cyanin. Beachten Sie, dass die Cyanin-Farbstoff minimale Markierung kann für kleine Menge an Proteinen, unter Beibehaltung der Menge von 1 ug pro angepasst werdenotein je 8 pmol Cyanin-Farbstoff. Wenn ja, kann das Mini-2DE-System anstelle des großen 2D-Gel-System verwendet werden. Damit wird die 2D-DIGE Analyse einer kleinen Menge von Hirngewebe.
- Kennzeichnen einen Pool von beiden Proben mit der gleichen Menge von Protein (50 ug insgesamt) mit Cy2 Fluoreszenzfarbstoff und als interner Standard verwendet. Verwenden Sie die gleichen Bedingungen wie zuvor angegeben.
- Vollständiges zu einem Gesamtvolumen 350 ul mit 2D-Puffer, enthaltend 1,1% Destreak Reagenz, 1,2% IPG-Puffer und Spuren von Bromphenolblau die Gesamt 150 ug markierte Proteine (50 ug Cy2, Cy3 50 ug und 50 ug Cy2). Führen Sie diesen Schritt in vierfacher Ausfertigung mit vier unabhängigen Streifen. Außerdem bereiten zwei zusätzliche nicht-markierten Streifen (eine für jede Probe) mit 350-450 &mgr; g Protein für den präparativen Gelen.
- Lassen Sie die sechs geladenen Streifen mit Mineralöl über Nacht für passive Rehydrierung bedeckt.
- Isoelektrofokussierung. Führen Sie die IEF bei 206; C Bei einem pH-Wert von 3-11NL, 18 cm Streifen des Protokolls ist: maximale Stromeinstellung ist 50 uA / Band während 8 Etappen: 1) 150 V Schritt 1 h, 2) 200 V Schritt 5 Stunden, 3) 500 V Gradient für 2 Stunden, 4), 1000 V Gradienten für 2 Stunden, 5), 2000 V Gradienten für 2 Stunden, 6) 4.000 V Gradienten für 2 Stunden, 7) 8.000 V Gradienten für 2 Stunden und 8) für insgesamt 24.000 V · h Schritt . Nach IEF, Versand den Überschuss der Mineralöl-Chromatographie mit Papier und die Streifen bei -20 ° C bis in die zweite Dimension.
- IPG-Streifen Ausgleich. Äquilibrieren Streifen in 6 M Harnstoff, 2% SDS, 30% Glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6-Puffer mit 1% DTT für 15 min und nach mit 4,7% Jodacetamid in dem gleichen Puffer ohne DTT.
- Zweite Dimension oder SDS-PAGE-Elektrophorese. Stellen die sechs 12% SDS-PAGE-Gelen (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% Acrylamid / Bisacrylamid, 0,1% (w / v) SDS, 0,072% (w / v) APS und 0,1% (v / v) TEMED ) in der gleichen Zeit mit einem großen 2D-System mit vier Low-Fluoreszenz-Glasplatten für die strips mit Fluoreszenzproben und zwei weitere Glasplatten mit 1,5 mm Dicke für präparative Gele, um die Protein-Spots herauszuschneiden.
- Laden die sechs IPG-Streifen auf der Oberseite der Gele und überschichtet mit 0,5% (w / v) Agarose. Laufpuffer aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% (w / v) SDS besteht. Führen Sie die Migration bei 2,5 W / Gel über Nacht mit einem Kühlsystem auf 4 ° C 16,17 gesetzt.
- Fluoreszenzbilder Erfassung und Analyse. Verwenden Sie einen Typhoon 9400-Scanner, um die Fluoreszenz Gele Bilder (12 Bilder zu einem Experiment) zu erhalten. Scan Cy2, Cy3 und Cy5 Bilder für jedes Gel bei 488/520 nm 532/580 nm und 630/670 nm Anregung / Emissionswellenlängen auf. Verwenden Informatik-Software, um die Bilder zu analysieren. Daten sind repräsentativ für die Veränderungen der Spot Volumen der Verteilung des Signals über die vier Gele zwischen den beiden untersuchten Proben verbunden.
- Coomassie-Färbung für große Gele. Befestigen Sie die präparative Gele in 50% (v / v) EtOH und 3% (V / V) Orthophosphorsäure-Lösung für mindestens 24 Stunden. Dann, nach zweimal waschen mit ultrareinem Wasser für 20 min. Führen Färbung in 34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) Ammoniumsulfat und 2% Orthophosphorsäure 1 h vor der Zugabe von 0,1% (w / v) Coomassie-Blue G-250. Halten Sie die Gele in der Färbung für mindestens 48 h und in ultrareinem Wasser entfärbt.
- Spots für MS-Identifikation. Sobald Fluoreszenzbildern analysiert, stellt die Software eine Liste von Punkten, deren Expression statistisch unterschiedlich. Manuelles auszuschneiden diese Flecken aus den präparativen Gelen. Dieses Verfahren erfordert Übung und etwas Fingerfertigkeit, um Keratin Kontamination zu vermeiden. Proben können dann in Wasser bei -20 ° C bis zum Senden MS gehalten werden. Spot-Identifikation ist vollkommen kompatibel mit Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) und Relevanz der Protein-Identitäten nach der Wahrscheinlichkeit basiert Mowse-Score mit einem p-Wert von 0,05 (p <0,05) 18 berechnet beurteilt. </ Ol>
3. Qualitative Mini-2DE Assay
- Resuspendieren maximal 100 ug Proteinprobe in 2D-Puffer bis zu einem Endvolumen von 200 &mgr; l einer 11 cm IPG-Streifen. Im Falle der Überexpression System oder gereinigtes Protein, kann die Ausgangsmenge an 20 ug gesenkt werden.
- Hinzufügen von 1,1% (v / v) Destreak Reagenz, 0,55% (v / v) IPG-Puffer und Spuren von Bromphenolblau bis zu einem Endvolumen von 200 ul. Dann Wirbel, stellen einen schnellen Spin und laden zu einem IPG-Streifen für passive Rehydrierung über Nacht mit Mineralöl bedeckt (um den Streifen in seine ursprüngliche Dicke mitbringen). Anmerkung: Der Anteil der IPG-Puffer ist für alle gleich dem Intervall des gewünschten pH (pH 3-11, 4-7, 7-11, usw.), aber seine Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von dem pH-Bereich gewählt.
- Isoelectrofocalisation. Führen IEF bei 20 ° C Die Programmdauer ist abhängig vom pH-Bereich gewählt. Bemerkenswert, Parameter wie Elektroendosmose kann die IEF-Profil stören und in diesen FällenOptimierung in electrofocalisation Zeit erforderlich ist 19. Hinweis: es ist nicht unbedingt eine längere IEF, die bessere Ergebnisse liefert, aber die Verkürzung der Zeit von IEF kann auch die Auflösung zu verbessern. Nach IEF kann IPG-Streifen bei -20 ° C über Monate gelagert werden.
- IPG-Streifen Ausgleich. Äquilibrieren der Streifen in einem Puffer, der 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% Glycerin, 5% SDS, 0,05% Bromphenolblau. Machen Sie drei Gleichgewichts badet für 15 min mit der Änderung der Pufferlösung zwischen jedem Bad.
- SDS-PAGE. Die IPG-Streifen Schicht auf ein Fertig Gel (IPG ein gut 11 cm IPG-Streifen) mit einem Anteil von Polyacrylamid in Abhängigkeit von der MW des Proteins von Interesse gewählt. Dann tupfen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose / PVDF-Membran bei 100 mV bei 33 min.
- Inkubation über Nacht mit der erforderlichen Antikörper und Visualisierung von Peroxidase-Aktivität. Führen Sie die Ausrichtungen der Immunoblots mit nicht verwandten Polypeptiden, die durch den sekundären Antikörper enthüllt. Erreiche eine halb quantittive Analyse durch Densitometrie des Volumens und der Intensität der Spuren / Spots mit ImageJ Software.
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Representative Results
Proteomics auf Hirngewebe bleibt eine Herausforderung, da keine ideale Puffer vorhanden, um 100% von Proteinen, insbesondere Membran-assoziierten Proteine oder Zellskelett erholen. Der erste Satz von Experimenten wurde die Suche nach einem geeigneten Lyse-Puffer mit beiden Ansätze und der mit einem großen Panel von Protein erholen können kompatible konzentriert. Somit wurden drei Lysepuffer untersucht, um die am besten geeignete zu bestimmen. Erstens ist die gemeinsame biochemische und molekularbiologische Puffer Tris-HCl 20 mM bei 10 mit 1% (w / v) SDS (Fig. 1A) verwendet wurde. Ferner weist Tris-HCl eine robuste Anwendung als Elektrophoresepuffer für Polyacrylamid und Agarose-Gelen. Die anderen beiden waren Lysepuffer UTS (1B) und der 2DE ein. Tris-SDS ergeben eine schlechte Auflösung und die Anzahl der Spots wurden deutlich im Vergleich zu der mit UTS, wo eine hohe Punktabstand, keine Verzerrung und eine fa beobachtet Profil gesenkt (Abbildung 1B)r bessere Gewinnung von Proteinen beobachtet (1B). Dieser Punkt wird durch die Tatsache, dass UTS Extraktionsausbeuten fast keine Rest Pellet, während Tris-HCl verdankt eine dicke einer nach Zentrifugation Bank unterstützt. Das Muster zeigte in 1B deutlich zeugt von der höheren Protein-Löslichkeit in UTS über andere Puffer wie Tris-HCl. Notheworthy dass auch 2DE Puffer wurde auch getestet, seine Verwendung wurde da trotz Pellet regiert wurde weder beobachtet, Lipide wurden nicht gelöst, und sie in der oberen Schicht difficulting die Manipulation geblieben. In Übereinstimmung mit diesen Daten, wird empfohlen, die Verwendung von UTS-Puffer aus mehreren Gründen 1) seine neutrale Chaotrops, die Proteine denaturiert durch Unterbrechung nonconvalent und ionische Bindungen zwischen den Aminosäuren und vermeiden die Aktivität der Proteasen, die zelluläre Proteine 21 2) Zusätzlich verschlechtern Thioharnstoff zu der Harnstofflösung erhöht drastisch die Löslichkeit von hydrophoben Membranproteinenund Proteine anfällig Aggregat 22, 23 und 3) die Hinzunahme des anionischen Detergens SDS bricht Lipide binden Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungen, sowie Erhöhungen Protease-und Phosphatase-Aktivität Hemmung 24,25. Darüber hinaus wurde beschlossen, einen Schritt zur Fällung impureties, die das IEF stören, zu beseitigen hinzufügen. Auf diese Weise bestimmt, wie Fällungsmethode die Löslichkeit der Proteine 26 und Methanol wurde bereits als der am besten geeignete Lösungsmittel von Lipiden, die reichlich im Hirngewebe zu entfernen beschrieben wurde, brachte es uns, das Chloroform / Methanol-Fällung 27 wählen. Die Verwendung der zwitterionischen Detergens CHAPS (3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propansulfonat) zum Resuspendieren der pelle Proteine im 2D-Puffer ist aufgrund seiner Eignung zur Erleichterung der Protein Eingang in der ersten Dimension Schritt 28.
Das Profil des menschlichen Gehirns und Mäuse proteome von 2D-DIGE ist in den Fig. 2A und 2B gezeigt. In der 2A verschmolzen Fluoreszenzbilder, die aus der menschlichen Kontrolle und AD Kortex Proben können für Mäuse Proben von Hippocampus von einem Modell der AD-wie Tau-Pathologie 29 beobachtet werden, in 2B idem. Cy2, Cy3 und Cy5 sind jeweils für die Humanproben in den 2C bis 2E veranschaulicht. Beide verschmolzen Muster (2A und 2B) präsentieren eine hohe Auflösung Stelle was eine hochwertige IEF und zweiten Dimension Trennung im Einvernehmen mit dem in Abbildung 1B beobachteten Profil. Dieser Spot-Definition-Qualität zusammen mit der Tatsache, daß die Vernetzung ist, um eine mögliche Bevorzugung der Proteine zu einem bestimmten Cyanin zu beseitigen, machen diese Fluoreszenzbilder (2C-2E) sehr einfach, in der gesamten Software-Analyse durchgeführt ausrichten. Darüber hinaus sind die präparative Gele mit blau gefärbten Coomassie Beweise eine angereicherte Protein Karte mit reichlich Flecken auf der ganzen pH-Bereich eingesetzt, so dass man die Flecken nach der Software-Analyse und für ihre Hinter Identifizierung durch MS / MS herauszuschneiden.
Die qualitative Mini 2DE-Analyse durch Immunoblotting für ein Protein liefert hochwertige Informationen für die Identifizierung und Modifikationen nicht nur für die post-translationale, sondern auch für diejenigen Oligomere und Verkürzungen (3A und 3B). Die Machbarkeit dieser Technik im Mini-2DE führen bietet schnelle und präzise Daten über das Protein von Interesse. Bezug Gewebe von einem Patienten mit Lewy-Körperchen-Demenz (LBD) betroffen, die Charakterisierung der alpha-Synuclein ermöglicht, eine gut definierte 4-7 pH-Profil sichtbar, wo das native Protein bei einem pI-Wert von 4,67 und ein MW von 18 kDa, jedoch mit Mini-2DE kann ferner das Vorhandensein von Dimeren (3A, Sternchen) gleichzeitig pI als die nativen Formen, sondern auch die Existenz UbiQ sehenuitinated Formen, die mehr Grund-und mit einer höheren MW sind, wenn mehr ubiquitinierten sie sind (Abbildung 3A, Pfeile). Ein weiteres Protein eng mit AD verbunden ist, die Amyloid-beta-Peptid, von dem komplexen Abbau des Amyloidvorläuferproteins (APP) erzeugt wird. In der 3B ist die Handlung eines sporadischen AD Fall mit familiärer verglichen. Im Fall des bekannten AD kann beobachtet wie Amyloid-beta 1-42 verringert bezüglich der sporadischen AD werden, und darüber hinaus die isovariants Amyloid-beta-42-x (4 kDa) werden auch nach unten reguliert ganzen Spalt unterdessen die Oligomere bei 8 kDa gefunden reflektieren, dass diese Tatsache ist nicht auf eine geringere Menge des Proteins, da Flecken Intensität ist mehr relevant in vertrauten AD (3B).
Abbildung 1: 2DE profile mit 10 mM Tris, 1% SDS w / v Extraktionspuffer (A) und der nach UTS Auslastung (B) erhaltenen Musters. In der Tafel B ist zu erkennen, wie die Anzahl der Punkte, die Intensität und Auflösung ist viel höher als die, der Platte (A). Die Verwendung von UTS ermöglicht eine nahezu vollständige Proteinextraktion, die es in der 2DE Coomassie-Färbung reflektiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2: 2D-DIGE-Profile für den menschlichen (A) und Mäusen (B) dargestellt Images (A) und (B) stellen die zusammengeführten Bilder für die drei Cyanine in einem pH-Bereich 3-11 von 18 cm Streifen.. In den Abbildungen (C), (D) und (<strong> E) Cyanine unabhängig (Cy2 in blau, grün Cy3 und Cy5 in rot) ausgesetzt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3: In das obere Feld kann es die Mini-2DE Profil des Proteins Alpha-Synuclein in einer LBD Patienten beobachtet werden: Der native pI (4.4) und MW (18 kDa) Änderung in Abhängigkeit von der Dimerisierung (Stern), wo die MW. ist die Doppel-, und Ubiquitinierung, die den pI verschiebt, bis ein basischer eine (Pfeile) (A). Das Bild unten zeigt das Profil eines Amyloid-beta-Peptid-Antikörper in einer sporadischen und genetischen Fall der AD. 2DE Muster zeigen, wie Oligomerisierung und Abbau erfolgt in einer anderen Art und Weise nach der Ätiologie der disease. Dies weist darauf hin, Immunoblot deutlich die Unterschiede in der APP Katabolismus zwischen den beiden Zuständen. Auf der einen Seite gibt es eine Zunahme in der Abbauprodukte in den in der sporadischen AD bezüglich der familiären eine (Pfeile), während die Oligomere scheint weniger ausgeprägt werden (B). Diese Experimente wurden in 11 cm Streifen in einer 4-7 pH-Lücke in einem 12% Bis-Tris-Gel und in einem 16,5% Tris-Tricin einem bzw. durchgeführt wurden (A, B). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Entdecken pathologischen Expression von Proteinen, die Suche nach Biomarkern und die Modulation der möglichen Pfade für pharmakologische Targets gehören zu den Zielen der Neuroproteomics 30 nähert. Unter den Schwellenwerkzeuge, ergänzt das Feld 2DE eine vielversprechende Erwartungs. Dennoch sollte ein Konsens, um die Variabilität zu minimieren und die Reproduzierbarkeit der Experimente erreicht werden. Entsprechend dieser Idee ein standardisiertes Protokoll, um 2D-DIGE (Abbildung 2) und die anschließende 2DE Immunoblotting (Abbildung 3) für Mensch und Mäusen Hirngewebe kompatibel mit eindimensionalen Immunoblotting durchführen wird hier in detaillierten beschrieben.
Eines der größten Dilemmas in der Proteomik ist die Solubilisierungspuffer Wahl. Um die Reproduzierbarkeit zwischen den verschiedenen Ansätzen zu erhöhen, UTS wurde gewählt, weil es vollständig kompatibel mit dem IEF ist. Darüber hinaus ergibt UTS Extraktionspuffer keine pellet oder ein wirklich leichter ein nach der Zentrifugation bei 12.000 xg (nicht mit dem SDS Niederschlag verwechseln bei 4 ° C). Dies ist ein entscheidender Punkt, unter Berücksichtigung, dass viele neurodegenerative Erkrankungen vorhandenen Proteine Aggregation, einschließlich AD. Die Tatsache, dass es keine Pellets erleichtert die Leistung und die Interpretation der Daten, da keine unabhängige Studien sollten für lösliche und nicht-lösliche Fraktion durchgeführt werden.
Was auch immer 2D-DIGE-oder Mini-2D Ansätze gehen, um durchgeführt werden, gibt es einige Einschränkungen, die angezeigt werden sollen. Zunächst werden die chemischen Eigenschaften der UTS-Puffer, muss diese Lösung nicht überhitzt werden oder Carbamylierung tritt auf primäre Amine und daher stören sowohl Cyaninfarbstoff Kupplung und 2D-Profil, Verschlechterung Flecken Auflösung von IEF 15 zu beeinträchtigen. Zweitens sind die pH-Bereiche zur Verfügung, die heute die breiteste pH-Intervall ist auf 3 bis 11, mit der Wahrscheinlichkeit, dass nicht alle Proteine Eintritt in den IPG-Streifen kann expl trat dieser Faktorain die gestapelten Proteine Bänder in den beiden Seiten der Gele nach Färbung. Diese Einschränkung könnte erklären, warum nicht die ganze Proteoms kann durch 2D sucht werden. Eine weitere wichtige Einschränkung ist die Kontroverse Nutzung der Niederschlag. Auf der einen Seite ist es sehr empfehlenswert, die Fällungsschritt mit Chloroform / Methanol, die den Lipidgehalt 27 effizient reduzieren können tun, Salze, Nukleinsäuren und Reinigungsmittel geladen, die mit den IEF Parameter beeinflussen und Auswirkungen auf die Auflösung und / oder Reproduzierbarkeit könnte 2D. Darüber hinaus ist auf der anderen Seite ist es nicht ausgeschlossen, daß einige Proteine stark an die Membran gebunden sind, verloren gehen. Dennoch in dem Fall, daß andere Extraktionspuffer anstelle von UTS, entweder mit oder ohne die Zugabe von Proteasen oder Phosphatasen Inhibitoren verwendet, die Verwendung von Fällungsschritt wird stark an allen Fallen während IEF empfohlen. Schließlich ist es bemerkenswert, dass 2D-DIGE Bilder Analyse stellt die Unannehmlichkeiten, die Fluoreszenz überlagertFlecken können zu einem Verlust von Informationen führen, da die Software-Analyse hält dies nicht wie eine signifikante Veränderung.
Die Neuheit dieses kombinierten Verfahrens liegt in der Reproduzierbarkeit, Vielseitigkeit und Proteine Charakterisierung. Nur eine Extraktionspuffer erlaubt es, zwei sich ergänzende Techniken durchzuführen. 2D-DIGE liefert quantitative Informationen über Proteine Ausdruck Veränderungen und deren spätere Identifizierung durch MS / MS. Es ist jedoch möglich, dass Isoformen isovariants, Zymogene, post-translationale Modifikationen und Abbauprodukte konnten nicht seit dem überlappten Fluoreszenz mit anderen Proteinen identifiziert werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird es parallel den Einsatz von Mini-2DE vorgeschlagen. In der Tat, nach unserem Wissen eine der wichtigsten Fallstrick, die begangen werden kann, ist die eindimensionale Immunoblotting als vollständige Validierung der 2D-DIGE Ergebnisse nehmen, oder auch zu bedenken, dass jede Änderung der Proteomik ist nicht notwendig, zu überprüfen. Furthermore, technischen Vorteile der Mini-2DE sind 1) die Möglichkeit der Verwendung von kleinen SDS-PAGE-Systeme, 2) die relativ geringe Material erforderlich, 3) die breiten pH-Bereiche verfügbar, 4) die Immunoblot Sensibilität und 5) die einfache Abschätzung der Veränderungen. Die anspruchsvollsten Aspekte der Mini-2DE-Technik ist die Quantifizierung, trotz Mini-2DE können nicht berücksichtigt werden ein quantitativer Ansatz, nach Flecken-oder Grundausrichtung ist es möglich, ein Verhältnis zwischen sauren und basischen Teil oder umgekehrt zu etablieren, Einrichtungs auf diese Weise eine zuverlässige Schätzung der Veränderungen beobachtet 9.
Mehrere Literaturdaten genauer die Verwendung Mini-2DE Proteincharakterisierung zu erreichen, z. B. für überexprimierten Proteine mit und ohne post-translationalen Modifikationen für die Demenz mit Lewy-Körpern und 32,33 in der Figur 3A für eine 31 beschrieben, Oligomerisierungs-und Abbauwege AD Patienten. Ein weiteres Beispiel für die Informationen von M ini 2DE ist das Abschneiden von Beta in nicht-dementen und AD-Fälle als potenzielles Ziel für die Impfung durchgeführt Amyloid-Ansatz 34 Arten. Die Anwesenheit von Oligomeren und seine differentiell Abbau wird auch in 3B abhängig von einem Breitbildschirm vertraut AD Patienten gezeigt. Zusätzlich öffnet Mini-2DE Ansatz eine große und praktische Fenster der Möglichkeiten, da verschiedene Behandlungen durchgeführt werden. Zum Beispiel im Bereich der AD kann Phosphatase-Inhibitoren zugesetzt werden und entdecken ihre Auswirkungen in Tau-Phosphorylierung. Auch die pharmakologische Wirkung auf Drogen Proteolyse Wege, da die PI-und MW Identifizierung der verkürzten Formen kann die Spaltstelle nach der Antikörper-Epitop 34 zu schaffen. Interessanterweise haben die jüngsten Daten aufgeklärt mit Mini-2DE die Verbindung von Lifestyle und medikamentöse Behandlungen mit kognitiven Beeinträchtigungen in Maus-Modellen sowie die biochemische Profil einer neuen Tau-Mutation 35-37.
ntent "> Die Entwicklung einer Methode ermöglicht die 2D-DIGE von Hirngewebe zu erhalten, aus menschlichen oder Maus Herkunft sowie die Validierung mit Mini-2DE hinten, kann Licht in die Aufdeckung neuer pharmakologischer Targets und Biomarker für die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen zu vergießen. Die Tatsache, dass diese Störungen haben ihren Ursprung im Gehirn zu verpflichten, dieses Organ als eine ideale Informationsquelle zu studieren. Jedoch sind menschliche Proben beschränkt, so dass die Verwendung von Tiermodellen unentbehrlich, um dieses Ziel zu erreichen. Hierin die Bedeutung der Verwendung Ansätzen parallel zu den beiden Arten von Proben und die Ergebnisse zu bestätigen. Es ist wünschenswert, dass in naher Zukunft zuverlässige Kandidaten gefunden und in körperlichen Flüssigkeiten wie Plasma und Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit getestet werden, um eine frühe Diagnose, Beurteilung des Krankheitsverlaufs zu schaffen und schließlich die Auswertung der plausiblen Anwendungen.Kritische Schritte im Protokoll muss für seine geei berücksichtigt werdenle-Anwendung. Im Fall der 2D-DIGE ist Proben Testqualität ein entscheidender Punkt. Dieser Test erlaubt zu wissen, Proteine Profil und Validierung der realen Menge an Proteinen Extrakt in der 2D-Puffer vorhandenen nach der Fällung. Bunt Profile geben uns Informationen über die Qualität und Homogenität zwischen den Proben. Nur Proben mit ähnlichen Mustern muss für 2D-DIGE Studien verwendet werden, da sonst der 2D-DIGE kann schlechte Färbung und schlechte Auflösung von Protein-Profils führt. Unterschiede in diesen Proben-Muster sind in der menschlichen häufiger als in Gehirngewebe der Maus, da die menschliche Gehirnproben für die Forschung befassen sich mit der viele unbequem 38,39. Darüber hinaus ist die Identifizierung von Proteinabbau durch Post-mortem-Intervall wurde bereits von 2D-DIGE 40,41 wiesen. Überprüfung des pH-Wertes vor dem Cyaninfarbstoff Kennzeichnung muß dieser Schritt alle hinteren Verfahren Cyaninfarbstoff Etikettierung beeinträchtigt. Und SDS-PAGE-Elektrophorese ist in Dunkelheit geschehensoweit wie möglich, um nicht Fluoreszenzmarkierung auswirken. Schließlich muss Polyacrylamidgelen so homogen wie möglich sein, unter ihnen, um inter-Variabilität während elektrophoretische Wanderung zu beseitigen und zu erleichtern Muster überlappen und hinteren Analyse 42,43.
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Disclosures
Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von INSERM, Universität Lille 2 unterstützt, MEDIALZ, LABEX (Exzellenz Labor-Programm zu investieren für die Zukunft) und DISTALZ (Entwicklung innovativer Strategien für eine transdisziplinäre Ansatz zur Alzheimer-Krankheit). FJ.FG ist derzeit ein Empfänger Gemeinschaft von ANR (Französisch National Research Agency / NeuroSplice de Projet Tau ANR-2010-BLAN-1114 01), aber diese Arbeit im Rahmen der Unterstützung von einem Stipendium der JCCM (Spanien) war.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
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