Summary
Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.
Abstract
Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtig hulpmiddel om proteoom veranderingen mogelijk gerelateerd aan verschillende fysiologische of pathologische omstandigheden duidelijk worden. In principe is deze techniek gebaseerd op de scheiding van eiwitten op basis van hun iso-elektrisch punt in een eerste stap, en anderzijds naar hun molecuulgewichten door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). In dit rapport wordt een geoptimaliseerd monstervoorbereiding protocol voor kleine hoeveelheid menselijke post-mortem en muis hersenweefsel wordt beschreven. Deze methode maakt het mogelijk om zowel tweedimensionale fluorescentie verschil gelelektroforese (2D-DIGE) en mini 2DE immunoblotting voeren. De combinatie van deze benaderingen kan men niet alleen nieuwe eiwitten en / of eiwitmodificaties voorbeeld in hun expressie door de compatibiliteit met massaspectrometrische detectie, maar ook een nieuw inzicht in markers validatie. Zo, mini-2DE gekoppeld aan western blotting vergunningen om bericht te identificeren en te valideren-Translationele modificaties, eiwitten katabolisme en geeft een kwalitatieve vergelijking tussen verschillende omstandigheden en / of behandelingen. Hierin geven we een methode om onderdelen van eiwitcomplexen gevonden in AD en Lewy body dementie, zoals de amyloïd-beta peptide en de alfa-synucleïne bestuderen. De werkwijze kan dus worden aangepast voor de analyse van het proteoom en onoplosbare eiwitten extraheren uit menselijk hersenweefsel en muismodellen ook. Tegelijkertijd kan het nuttige informatie voor de studie van moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten als potentiële nieuwe biomerkers en therapeutische targets.
Introduction
Psychische en neurologische aandoeningen vertegenwoordigen 13% van de wereldwijde ziektelast, moet nieuwe uitdagingen zoals pathofysiologische mechanismen, risicofactoren en prodromale biomarkers worden onderzocht 1. In lijn met deze doelstelling, proteomics studies van het menselijk brein onmisbaar geworden moleculaire pathways betrokken bij processen zoals geheugen, gedrag, emoties en neuronale plasticiteit bijvoorbeeld, niet alleen voor de fysiologische, maar ook voor pathologische omstandigheden duidelijk worden. Daarom is het gebruik van diermodellen en meer specifiek de transgene muizen, brengt een groot aantal mogelijkheden om de etiologie van humane neurodegeneratieve aandoeningen 2 nabootsen.
Proteomics benaderingen zijn tegenwoordig beschikbaar om deze nieuwe perspectieven te bereiken op het gebied neurowetenschappen. Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtige en waarschijnlijke eenvoudige methode waarmee vergelijken het proteoom van een groot aantal monsters. Bovendien is ook eenkrachtige methode om een isolaat uit een complex mengsel te identificeren en verder geanalyseerd door massaspectrometrie. Deze techniek bestaat in hoofdzaak in twee opeenvolgende stappen: 1) eiwit gescheiden volgens hun iso-elektrisch punt (pI) van isoelectrofocusing (IEF). Meer bepaald wordt een elektrische potentiaal aangebracht over de Immobiline acrylamide strips onder een pH-gradiënt en dan eiwitten zal migreren en zich richten op een bepaalde pI in functie van de globale netto-lading. 2) Isoelectrically gericht eiwitten denatureren en negatief geladen door toevoeging van natriumdodecylsulfaat (SDS), waardoor eiwitten in de eerste structuur gescheiden afhankelijk van hun schijnbaar molecuulgewicht (MW) van SDS-PAGE 3. Deze twee verschillende eigenschappen kunnen we een dubbele waarde aan in de studie van het proteoom verder gaan aanpakken. Enerzijds Deze benadering biedt de mogelijkheid om een kwantitatieve analyse uit te voeren met minimale kleurstoffen 2D-DIGE methode en anderzijds een qualitative analyse door mini-2DE gekoppeld aan western blotting.
Kwantitatieve analyse van 2D-DIGE schenkt eiwit expressie verandert over de hele steekproef proteoom. In het kort worden monsters gelabeld met drie cyaninen (Cy2, Cy3 en Cy5) emitteert bij drie verschillende golflengten (blauw, groen en rood). Deze fluor minimale kleurstoffen die N-hydroxy-succinimidyl ester groep reageren met de ε-aminogroep van lysines residuen van eiwitten waardoor covalente amide bindingen 4. Lysineresiduen zijn gelabeld slechts tussen de 1-3% en dus meerdere labels toevoeging per eiwit en grote netto lading wijzigingen 5, 6 voorkomen. Cy3 en Cy5 worden vaak gebruikt om twee onafhankelijke steekproeven benoemen terwijl Cy2 labels een mengeling van gelijke delen van de monsters te vergelijken. De twee belangrijkste voordelen zijn dat alle gelabelde monsters zijn gemengd en IEF en SDS-PAGE worden uitgevoerd in een gel uitgevoerd in een keer voor elke stap, het vermijden van de inter variabiliteit onder experimenten te wijten aan vergelijking gels. Bovendien presenteert een hoge detectiegrens van circa 1 femtomole eiwit 7. Gels worden gescand en 2D software vergelijkt het 2D gel fluorescentie afbeeldingen waar Cy2 dient als interne standaard ter identificatie van statistische verschillen tussen de plaatsen voor de achterste identificatie door massaspectrometrie. De 2D analyse software met de interne standaard bereikt een snelle detectie van minder dan 10% verschillen tussen monsters met meer dan 95% van statistische betrouwbaarheid 8.
Kwalitatieve analyse door mini-2DE is een cruciale stap voor eiwitkarakterisering. Het principe is hetzelfde als eerder beschreven voor pI en MW scheiding, maar in dit geval eiwitten die door een kleine polyacrylamidegel naar een membraan en immunoblotting wordt daarna uitgevoerd. Terwijl een dimensie gelelektroforese bepaald veranderingen in eiwitexpressie voor een of meer eiwitten epitopen in functie van het antilichaam, de informatin van mini-2DE begiftigt met twee extra parameters. Ten eerste, het eiwit isovariants veranderen in functie van de PI, wat aangeeft dat post-translationele modificaties zou kunnen plaatsvinden. Ten tweede mag de massa van identificatie spectrometrie indicatief plausibele zymogenen en katabole producten van eiwitten. Daarom wijzigingen waargenomen door 2D-DIGE zijn waarschijnlijk een aanwijzing voor de mechanismen die ten grondslag liggen aan veranderingen in de wereldwijde proteoom profiel. De aanpassing van het immunoblots tussen verschillende monsters voor hetzelfde eiwit epitoop / s door mini-2DE kan zuurgraad veranderingen die licht werpen in post-translationele variaties iets waargenomen of zelfs niet door monodimensional immunoblotten 9, 10 weerspiegelen. Bovendien, deze analyse informeert over de mogelijke splitsingsplaatsen vanwege de kennis van de pI en MW van de metabolische residuen 11,12.
De combinatie van deze twee technieken biedt een aanvullende proteomics analyse. Aan de ene kant 2D-DIGE biedt een type verschillen waardoor een nauwkeurige isolatie van polypeptiden waarvan de expressie is anders. Deze verschillen bestaan in hoofdzaak in het uiterlijk of de verdwijning van een plek of toename / afname van de intensiteit van een gegeven een door software analyse van de tl-gels. Deze vaststellingen zelf waarschijnlijk niet de aard van de wijziging waargenomen verklaren. Daarom, wanneer het polypeptide wordt geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie, het gebruik van mini-2DE kunnen precies bevestiging 1) de identiteit van het eiwit geïsoleerd en 2) de aard van de verschil verandering in de isovariant / isovorm niveau expressie, post-translationele modificaties en splitsing werkwijzen bijvoorbeeld. Het is echter noodzakelijk om een conferentie lysisbuffer beide geschikt voor 2D-DIGE en mini-2DE om mogelijke dispersies door het gebruik van extractie protocollen die zeer verschillend beperken ontwikkelen.
In dit artikel, we Debeschreven een aangepast protocol voor de voorbereiding, de winning en de prestaties van 2D-DIGE en mini-2DE technieken voor de hersenen eiwitten afkomstig van mens en muis weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Homogenisering en Total Eiwitextractie van de mens en de muis hersenweefsel
- Hersenweefsel homogenisering. Homogeniseer het hersenweefsel 10% (w / v) in 8 M ureum, 2 M thioureum en 1% w / v SDS buffer (UTS) met een potter glas (menselijke monsters) of Teflon homogenisator (voor muizen monsters). Ultrasone trillingen bij 60 Hz 30 pulsen met een ultrasone generator toepassing van 0,5 sec voor volledige desintegratie weefsels 13, 14.
- Bepaal eiwitconcentratie met Bradford assay, met behulp van BSA als standaard. Dit UTS buffer extractie is volledig compatibel met een dimensie SDS-PAGE zolang lysates zijn niet over-verhit tot carbamylering 15 voorkomen.
- Voeg 1% (w / v) Amberlite en incubeer onder voorzichtig mengen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna filteren op 0,22 pm spuit filters en tenslotte de SDS toe te voegen aan de ureum / thioureum oplossing. Deze stap vermindert de hoeveelheid urinezuur en isocyaanzuur, die in equilibrium met ureum in oplossing en de afbraakproducten vergemakkelijken.
- Chloroform / methanol eiwitprecipitatie. Neerslag tussen 100-150 ug eiwit 11 cm IPG strips en 1-1,5 mg 18 cm die (onafhankelijk van de pH bereik gekozen om de IEF voeren).
- Voer alle stappen op ijs of bij 4 ° C. Koel chloroform en methanol bij 4 ° C gedurende 30 minuten voordat de precipitatie procedure.
- Voeg drie delen methanol en een volume van chloroform tot een volume van UTS lysaat. Hand schudden van het mengsel en voeg drie delen van koud water. Vortex gedurende 1 min en de pellet eiwitten door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant met behulp van een Pasteur pipet en voeg drie delen van koude MeOH. Vortex opnieuw en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Tenslotte gooi supernatant en droog de pellet onder N2.
- Bereiding van eiwitten voor 2D analyse.Resuspendeer de pellet gedroogd eiwit in 2D-buffer (8 M ureum, 2 M thioureum aangevuld met 4% CHAPS). Was de oplossing met Amberlite zoals boven aangegeven en proberen om het aandeel van 500 ug eiwit per 200 gl buffer 2D bewaren 2D-DIGE. Opmerking: 2D buffer bij -80 ° C worden opgeslagen of bij 4 ° C gehouden gedurende een week (ureum afbraak te voorkomen).
- Ultrasone trillingen en monsters worden bij -80 ° C totdat het uitvoeren van de volgende stap. Opmerkelijk, kan dit protocol worden gebruikt na mierenzuur oplosbaarheid van eiwit aggregaten 10. Kort verdampen mierenzuur onder N2 en resuspendeer de pellet beschreven.
2. 2D-DIGE
- Monsters te testen kwaliteit. Dosis monsters opnieuw met Bradford methode. Verdun 15 ug van eiwitten in LDS monsterbuffer warmte bij 37 ° C en 15 laden op 4-12% polyacrylamidegels.
- Coomassie kleuring. Vlekken polyacrylamidegel met 0,1% (w / v) CoomassieG 250, 50% EtOH en 10% (v / v) azijnzuur oplossing ten minste 1 uur. Laten achtergrond overnacht Destain in 7% azijnzuur en 10% (v / v) ethanol oplossing.
- Pre-elektroforetische etikettering van de monsters. Voorafgaand aan het uitvoeren cyanine kleurstof etikettering, verifiëren de pH van het monster, die basisch of neutraal zou zijn omdat de N-hydroxysuccinimide substitutie efficiënter bij basische pH en gezien optimaal bij pH 8,6 te zijn.
- Label minimaal twee monsters van studie met Cy3 of Cy5 fluorescente kleurstoffen met een verhouding van 50 ug protein/400 pmol kleurstof en houd gedurende 1 uur bij 4 ° C in het donker aan NHS ester reactieve groep van de cyaninen met de geprotoneerde amine vergemakkelijken groepen lysinen.
- Verminder monster variaties maken van een cross-labeling met Cy3 en Cy5 kleurstoffen, het vermijden van een preferentiële koppeling van een monster aan een bepaalde cyanine. Merk op dat de cyanine kleurstof minimale labeling kan worden aangepast aan kleine hoeveelheid eiwitten met het houden van de verhouding van 1 pg protein per 8 pmol cyanine-kleurstof. Zo ja, kan de mini-2DE systeem worden gebruikt in plaats van de grote 2D gel systeem. Hierdoor wordt de 2D-DIGE analyse een kleine hoeveelheid hersenweefsel mogelijk.
- Label een pool van beide monsters met dezelfde hoeveelheid eiwit (50 ug totaal) Cy2 fluorescente kleurstof en als interne standaard. Gebruik dezelfde voorwaarden als eerder aangegeven.
- Complete om een totaal volume 350 pi met 2D buffer die 1,1% Destreak reagens, 1,2% IPG-buffer en sporen van broomfenolblauw het totaal 150 ug van gelabelde eiwitten (50 ug Cy2, Cy3 50 ug en 50 ug Cy2). Voer deze stap in viervoud met vier onafhankelijke strips. Bovendien bereiden twee extra niet-gelabelde stroken (een voor elk monster) met 350-450 ug eiwit voor de preparatieve gels.
- Laat de zes geladen strips bedekt met minerale olie 's nachts voor passieve rehydratatie.
- Isoelectrofocusing. Voer de IEF bij 206; C. Voor een pH 3-11NL, 18 cm strip het protocol is: maximale stroom instelling is 50 uA / strip in 8 etappes: 1) 150 V stap voor 1 uur, 2) 200 V stap voor 5 uur, 3) 500 V gradiënt voor 2 uur, 4) 1000 V gradiënt gedurende 2 uur, 5) 2000 V gradiënt gedurende 2 uur, 6) 4000 V helling van 2 uur, 7) 8000 V gradiënt gedurende 2 uur en 8) voor in totaal 24.000 V · u stap . Na IEF verzending de overmaat minerale olie met behulp van chromatografie papier en bewaar de stroken bij -20 ° C totdat de tweede dimensie.
- IPG Strips verevening. Equilibreren stroken 6 M ureum, 2% SDS, 30% Glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 buffer met 1% DTT gedurende 15 minuten en na 4,7% van iodoacetamide in dezelfde buffer maar zonder DTT.
- Tweede dimensie of SDS-PAGE elektroforese. Maak de zes 12% SDS-PAGE gels (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% acrylamide / bisacrylamide, 0,1% (w / v) SDS, 0.072% (w / v) APS en 0,1% (v / v) TEMED ) tegelijkertijd met een grote 2D systeem met vier lage fluorescentie glasplaten voor de strips met fluorescentie monsters en twee glazen platen met 1,5 mm dikte preparatieve gels heeft het eiwit spots uit te snijden.
- Plaats de zes IPG strips bovenop de gels en over gelaagde met 0,5% (w / v) agarose. Running buffer bestaat uit 25 mM Tris, 192 mM glycine en 0,1% (w / v) SDS. Het uitvoeren van de migratie op 2,5 W / gel 's nachts met een koelsysteem ingesteld op 4 ° C 16,17.
- Fluorescentie afbeeldingen acquisitie en analyse. Gebruik een Typhoon 9400 scanner om de fluorescentie gels beelden (12 beelden voor een experiment) te verkrijgen. Scan Cy2, Cy3 en Cy5 afbeeldingen voor elke gel bij 488/520 nm, 532/580 nm en 630/670 nm excitatie / emissie golflengten, respectievelijk. Gebruik informatic software om de beelden te analyseren. Gegevens zijn representatief voor de veranderingen spot volume voor de distributie van het signaal over de vier gels tussen de twee onderzochte monsters.
- Coomassie kleuring voor grote gels. Bevestig de preparatieve gels in 50% (v / v) EtOH en 3% (v / v) fosforzuur oplossing ten minste 24 uur. Dan na, twee keer wassen met ultra zuiver water gedurende 20 minuten. Voer kleuring in 34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) ammoniumsulfaat en 2% orthofosforzuur gedurende 1 uur voor het toevoegen van 0,1% (w / v) Coomassie Blue G-250. Houd de gels in kleur gedurende ten minste 48 uur en ontkleurd in ultra puur water.
- Spots voor MS identificatie. Zodra fluorescentie beelden worden geanalyseerd, biedt de software een lijst van plekken waarvan de expressie is statistisch verschillend. Handmatig uitsnijden deze vlekken uit de preparatieve gelen. Deze procedure vergt oefening en enkele handvaardigheid om keratine besmetting te voorkomen. Dan monsters kunnen in water worden bewaard bij -20 ° C totdat zendt MS. Spot identificatie perfect verenigbaar met tandem massaspectrometrie (MS / MS) en relevantie eiwit identiteiten wordt beoordeeld volgens de waarschijnlijkheid gebaseerde MOWSE score berekend met een p-waarde van 0,05 (p <0,05) 18. </ Ol>
3. Kwalitatieve Mini-2DE Assay
- Resuspendeer maximaal 100 ug eiwit monster in 2D buffer tot een eindvolume van 200 ul van een 11 cm IPG strip. Bij overexpressie systeem of gezuiverd eiwit, kan het uitgangsbedrag worden verlaagd tot 20 ug.
- Voeg 1,1% (v / v) Destreak Reagent, 0,55% (v / v) IPG buffer en sporen van broomfenolblauw tot een eindvolume van 200 pl. Dan, vortex, maak een snelle spin en laden in een IPG strip voor passieve rehydratie nachts bedekt met minerale olie (om de strip in zijn oorspronkelijke dikte te brengen). Opmerking: de verhouding van IPG buffer hetzelfde voor alle interval gewenste pH (pH 3-11, 4-7, 7-11, enzovoort), maar de samenstelling varieert in functie van het pH-gebied gekozen.
- Isoelectrofocalisation. Voer IEF bij 20 ° C. De duur van het programma afhankelijk van de pH interval gekozen. Opmerkelijk parameters zoals electroendosmosis kan de IEF profiel verstoren en in deze gevallen,optimalisatie in electrofocalisation tijd nodig is 19. Let op: het is niet per se een langere IEF die betere resultaten geeft, maar het verkorten van de tijd van IEF kan ook het verbeteren van de resolutie. Na IEF kan IPG strips worden bewaard bij -20 ° C gedurende maanden.
- IPG strips verevening. Equilibreren van de strips in een buffer die 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glycerol, 5% SDS, 0,05% broomfenol blauw. Maak drie equilibrering baadt gedurende 15 minuten met het veranderen van de bufferoplossing tussen elk bad.
- SDS-PAGE. Laag de IPG strip op een prefab gel (IPG 1 en 11 cm IPG strip) met een percentage polyacrylamide gekozen afhankelijk van het MW van het eiwit van belang. Vervolgens dep de gel op een nitrocellulose / PVDF membraan aan 100 mV gedurende 33 minuten.
- Incubeer overnacht met de vereiste antilichaam en visualiseren door peroxidaseactiviteit. Voer de uitlijning van immunoblots gebruik ongerelateerde polypeptiden onthuld door de secundaire antilichaam. Bereik een semi-quantittieve analyse door densitometrie van het volume en de intensiteit van de sporen / vlekken met ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteomics on hersenweefsel blijft een uitdaging omdat geen ideale buffer bestaat om 100% van eiwitten, in het bijzonder membraan-geassocieerde eiwitten van het cytoskelet of herstellen. De eerste reeks experimenten waren gericht op de zoektocht naar een geschikte lysebuffer compatibel met de twee benaderingen en die het mogelijk maakt om een groot panel van eiwit te herstellen. Zo werden drie lysis buffers onderzocht op de meest geschikte bepalen. Eerst werd het gebruikt gemeenschappelijke biochemische en moleculaire biologie buffer Tris-HCl 20 mM bij 10 met 1% (w / v) SDS (figuur 1A). Bovendien Tris-HCl is een robuuste toepassing als electroforese buffer polyacrylamide en agarosegels. De andere twee lysis buffers waren UTS (Figuur 1B) en een 2DE. Tris-SDS leveren een slechte resolutie en het aantal spots aanzienlijk verlaagd (Figuur 1B) in vergelijking met het profiel waargenomen met UTS, waarbij een hoge plek scheiding, geen vervorming en een far beter terugwinnen van eiwitten waargenomen (Figuur 1B). Dit punt wordt ondersteund door het feit dat UTS extractie rendement bijna geen residuele pellet, terwijl Tris-HCl dankt een dikke ene na bankje centrifugeren. Het patroon getoond in figuur 1B duidelijk getuigt van de hogere oplosbaarheid proteïne in UTS over andere buffers zoals Tris-HCl. Notheworthy dat zelfs 2DE buffer werd ook getest, werd het gebruik uitgesloten omdat ondanks pellet werd niet waargenomen, lipiden werden niet opgelost en ze bleven in de bovenlaag difficulting de manipulatie. In overeenstemming met deze gegevens, wordt aanbevolen het UTS buffer om verschillende redenen 1) een neutraal chaotroop dat eiwitten denatureert door het verstoren nonconvalent en ionische bindingen tussen de aminozuurresten voorkomen en de activiteit van proteasen die cellulaire eiwitten afbreken 21 2) toevoeging thioureum de ureumoplossing verhoogt drastisch de oplosbaarheid van hydrofobe membraaneiwittenen eiwitten gevoelig voor aggregaat 22, 23 en 3) de toevoeging van het anionische detergens SDS breekt lipiden binden eiwitten via hydrofobe interacties, en verhoogt protease en fosfatase-activiteit remming 24,25. Verder werd besloten om een precipitatie stap om impureties dat de IEF kunnen verstoren elimineren toevoegen. Zo bepaalt als neerslagwerkwijze de oplosbaarheid van de eiwitten 26 en methanol werd reeds beschreven als de meest geschikte oplosmiddel lipiden die overvloedig in hersenweefsel zijn verwijderd, bracht ons de chloroform / methanol precipitatie 27 kiezen. Het gebruik van het zwitterionische detergens CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propaan sulfonaat) resuspenderen van de pellet eiwitten in de 2D buffer door zijn geschiktheid om de ingang eiwit vergemakkelijken de eerste dimensie stap 28.
Het profiel van de menselijke en muizen hersenen proteome door 2D-DIGE is weergegeven in figuren 2A en 2B respectievelijk. In de figuur 2A samengevoegd fluorescerende beelden afkomstig van menselijke controle en AD cortex monsters kunnen worden waargenomen, in figuur 2B idem voor muizen monsters van hippocampus van een model van AD-achtige Tau pathologie 29. Cy2, Cy3 en Cy5 worden respectievelijk geïllustreerd voor de menselijke monsters in figuren 2C-2E. Beide fusiepartners patronen (Figuur 2A en 2B) een hoge plek resolutie als gevolg van een hoge kwaliteit IEF en tweede dimensie scheiding in overeenstemming met het profiel dat waargenomen in Figuur 1B. Deze plek definition kwaliteit en het feit dat verknoping wordt uitgevoerd om een eventuele voorkeur van de eiwitten aan een bepaalde cyanine elimineren, maken deze fluorescentie afbeeldingen (Figuren 2C-2E) gemakkelijk te lijnen gehele software analyse. Bovendien is de preparatieve gels gekleurd met blauwe Coomassie bewijs een verrijkte eiwit kaart met overvloedige vlekken over het pH-bereik gebruikt, zodat men de vlekken accijnzen na software-analyse en voor hun latere identificatie door MS / MS.
De kwalitatieve mini 2DE-analyse door immunoblotting voor een eiwit levert hoogwaardige informatie voor de identificatie en wijzigingen, niet alleen voor post-translationele degenen maar ook oligomeren en inkortingen (Figuren 3A en 3B). De haalbaarheid van deze techniek uitvoeren mini 2DE biedt snelle en nauwkeurige gegevens over het eiwit van belang. Wat weefsel van een patiënt getroffen door Lewy Body dementie (LBD), de karakterisatie van alfa-synucleïne maakt een nauwkeurig omschreven 4-7 pH-profiel zichtbaar wanneer het natieve eiwit een pI van 4,67 en een MW van 18 kDa, echter met mini-2DE kan verder worden gezien dat de aanwezigheid van dimeren (figuur 3A, asterisk) en het pI dan de natieve vormen, maar ook het bestaan van ubiquitinated vormen die meer basic en met een hogere MW wanneer meer ubiquitinated ze (Figuur 3A, pijlen). Een ander eiwit nauw verbonden met AD is het amyloid-beta peptide, gegenereerd door de complexe afbraak van het amyloïd precursor proteïne (APP). In de figuur 3B wordt het vergeleken de plot van een sporadische AD geval met een familiaire een. Bij de bekende AD kan worden waargenomen hoe amyloïd-bèta 1-42 verlaagd ten opzichte van de sporadische AD, en bovendien de isovariants amyloid-beta x-42 (4 kDa) zijn eveneens neerwaarts gereguleerd over de kloof , ondertussen de oligomeren gevonden op 8 kDa weerspiegelen dat dit feit is niet te wijten aan een lagere hoeveelheid van het eiwit, omdat vlekken intensiteit is meer relevant in vertrouwde AD (Figuur 3B).
Figuur 1: 2DE productomschrijving na 10 mM Tris 1% SDS w / v extractie buffer (A) en de patroon verkregen na gebruik UTS (B). In het kader B is te zien hoe het aantal spots, intensiteit en resolutie veel hoger dan die van het paneel (A). Het gebruik van UTS laat een bijna totale eiwitextractie dat wordt weerspiegeld in de 2DE Coomassie kleuring. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2: 2D-DIGE profielen voor menselijke (A) en muizen (B) is afgebeeld Afbeeldingen (A) en (B) vertegenwoordigen de samengevoegde afbeeldingen voor drie cyaninen in 3-11 pH van 18 cm strip.. Op de foto's (C), (D) en (<strong> E) cyaninen onafhankelijk blootgesteld (Cy2 in blauw, Cy3 in groen en Cy5 in het rood). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3: In het rugpaneel kan de mini-2DE profiel van het eiwit alfa-synucleïne per LBD patiënt geobserveerd De natieve pI (4.4) en MW (18 kDa) verandering in functie van de dimerisatie (asterisk) indien de MW. is het dubbele, en ubiquitination dat de pI verschuift tot een meer fundamentele een (pijlen) (A). De foto toont het profiel van een amyloïd-beta peptide antilichaam in een sporadische en erfelijke geval van AD. 2DE patroon zien hoe oligomerisatie en afbraak plaatsvindt op een andere wijze volgens de etiologie van de disease. Deze immunoblot wijst duidelijk op de verschillen in de APP katabolisme tussen de twee condities. Enerzijds is er een toename van de katabolische producten die in de sporadische AD over de familiaire een (pijlen), terwijl de oligomeren lijken minder worden gemerkt (B). Deze experimenten zijn uitgevoerd in 11 cm strips in een 4-7 pH gat in een 12% Bis-Tris gel en in een 16,5% Tris-Tricine een, respectievelijk (A, B). Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontdekken van pathologische expressie veranderingen van eiwitten, zoektocht naar biomarkers en de modulatie van mogelijke pistes voor farmacologische doelwitten behoren tot de doelstellingen van de Neuroproteomics benadert 30. Temidden van de opkomende instrumenten, het veld 2DE voegt een veelbelovende afwachtend. Niettemin moet een consensus om variabiliteit te minimaliseren en verhoging reproduceerbaarheid in de experimenten worden bereikt. In het verlengde van dit idee een gestandaardiseerd protocol om 2D-DIGE (figuur 2) en de daaropvolgende 2DE immunoblotting (figuur 3) voor menselijke en muizen hersenweefsel volledig compatibel met mono-dimensionale immunoblotten voeren wordt hierin beschreven in gedetailleerde.
Een van de grootste dilemma's in proteomics is de solubilisatiebuffer keuze. Om de reproduceerbaarheid van de verschillende benaderingen verhogen, werd UTS gekozen omdat het volledig compatibel met de IEF. Bovendien UTS extractiebuffer levert geen pellet of een heel lichte ene na centrifugeren bij 12.000 xg (niet te verwarren met de SDS neerslag bij 4 ° C). Dit is een cruciaal punt in aanmerking nemen dat veel neurodegeneratieve aandoeningen aanwezige eiwitten aggregatie, waaronder AD. Het feit dat er geen pellet vereenvoudigt de uitvoering en interpretatie van gegevens, aangezien geen onafhankelijke studies moeten worden gedaan oplosbare en niet-oplosbare fractie.
Wat ook 2D-DIGE of mini-2D benaderingen zullen worden uitgevoerd, zijn er een aantal beperkingen die moeten worden aangegeven. Ten eerste is de chemische eigenschappen van de UTS buffer, deze oplossing mag niet oververhitten of carbamylering gebeurt op primaire aminen en derhalve interfereren met zowel cyaninekleurstof koppeling en 2D profiel verslechtering spots resolutie door afbreuk IEF 15. Ten tweede, de beschikbare pH-trajecten, tegenwoordig de breedste pH interval tussen 3 tot 11, deze factor verbonden met de kans dat niet alle eiwitten intrede op de IPG strip kan verkain de gestapelde eiwitten banden in de beide zijden van de gel na kleuring. Deze beperking zou kunnen verklaren waarom niet de hele proteoom bestudeerd kan worden door 2D. Een andere belangrijke beperking is de controverse gebruik van de precipitatie. Enerzijds is het zeer aan te bevelen de precipitatiestap met chloroform / methanol waarmee het lipidegehalte 27 vermindert efficiënt doen, zouten, nucleïnezuren en geladen detergenten die storende IEF parameters beïnvloeden de resolutie en / of de reproduceerbaarheid van 2D. Bovendien, anderzijds kan niet worden uitgesloten dat sommige eiwitten sterk gehecht aan het membraan verloren. Niettemin, in het geval dat andere extractie buffers gebruikt in plaats van UTS, met of zonder toevoeging van proteasen of fosfatasen remmers het gebruik van precipitatiestap wordt sterk aanbevolen om valkuilen tijdens IEF. Ten slotte is het opmerkelijk dat 2D-DIGE beelden analyse presenteert het ongemak dat fluorescentie overlaptvlekken kan leiden tot een verlies van informatie, omdat de software de analyse acht dit niet als een significante variatie.
De nieuwigheid van deze gecombineerde methode ligt in hun reproduceerbaarheid, veelzijdigheid en eiwitten karakterisering. Slechts een extractiebuffer kan men twee complementaire technieken uit te voeren. 2D-DIGE geeft kwantitatieve informatie over eiwitten expressie veranderingen en hun latere identificatie door MS / MS. Het is echter mogelijk dat isovormen, isovariants, zymogenen, post-translationele modificaties en katabolische producten die niet konden worden geïdentificeerd aangezien de overlappende fluorescentie met andere eiwitten. Om deze beperking te overwinnen wordt voorgesteld in parallel het gebruik van mini-2DE. In feite, onze kennis een van de belangrijkste valkuil dat kan worden vastgelegd is aan de eendimensionale immunoblotting nemen een volledige validatie van het 2D-DIGE resultaten of zelfs overwegen dat proteomics modificatie is niet noodzakelijk valideren. Furthermore, technische voordelen van mini 2DE zijn 1) de haalbaarheid van het gebruik van kleine SDS-PAGE-systemen, 2) het relatief lage materiaal nodig, 3) het brede bereik van pH beschikbaar, 4) de immunoblot gevoeligheid en 5) de gemakkelijke schatting van de veranderingen. De kieskeurigste aspecten van mini 2DE techniek is de kwantificering ondanks mini-2DE niet worden beschouwd als een kwantitatieve benadering na vlekken of plaatsen aanpassing is het mogelijk om een verhouding vast tussen de zure en basische gedeelte of vice versa, inrichting op deze wijze een betrouwbare schatting van de waargenomen veranderingen 9.
Verschillende literatuurgegevens juiste gebruik mini-2DE eiwit karakterisering bereiken, zoals overexpressie eiwitten met en zonder post-translationele modificatie 31, oligomerisatie en omzettingsroutes beschreven dementie met Lewy lichamen 32,33 en in de figuur 3A een AD patiënt. Een ander voorbeeld van de informatie die door m ini 2DE is de inkorting van beta-amyloïde soorten uitgevoerd in niet-demente en AD gevallen als een potentieel doelwit voor vaccinatie benadering 34. De aanwezigheid van oligomeren en zijn verschillend afbraak wordt ook getoond in figuur 3B naargelang een sporadische of bekende AD patiënt. Bovendien mini 2DE benadering opent een breed en praktisch venster mogelijkheden aangezien verschillende behandelingen kunnen worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld op het gebied van AD, kunnen fosfatase remmers worden toegevoegd en ontdekken hun effect op tau fosforylatie. Ook de farmacologische drugs effect op proteolyse wegen, aangezien pI en MW identificatie van de verkorte vormen de splitsingsplaats kan bieden volgens epitoop van het antilichaam 34. Interessant is dat uit recente gegevens opgehelderd met behulp van mini-2DE de vereniging van levensstijl en medicamenteuze behandelingen met cognitieve beperkingen in muismodellen, evenals de biochemische profiel van een nieuwe Tau mutatie 35-37.
ntent "> De ontwikkeling van een methode ontwikkeld om het 2D-DIGE van hersenweefsel te verkrijgen van de mens of de muis oorsprong evenals de validatie met behulp van mini-2DE achter, kan licht werpen in het blootleggen van nieuwe farmacologische targets en biomarkers voor de studie van neurologische ziekten. Het feit dat deze aandoeningen hebben hun oorsprong in de hersenen, verplichten deze organen bestuderen als een ideale informatiebron. echter menselijke monsters beperkt, zodat het gebruik van diermodellen wordt onmisbaar om dit doel te bereiken. Hierin het belang van het gebruik benaderingen parallel beide typen monsters en bevestig de resultaten. Het is wenselijk dat in de nabije toekomst betrouwbare kandidaten gevonden en getest lichamelijke vloeistoffen zoals plasma en cerebrospinale vloeistof om een vroege diagnose, evaluatie van ziekteprogressie stellen en uiteindelijk de evaluatie van de aannemelijke behandelingen.Kritische stappen in het protocol moet in aanmerking worden genomen voor zijn suitable toepassing. In het geval van 2D-DIGE, monsters testkwaliteit is een cruciaal punt. Deze test maakt het mogelijk om te weten eiwitten profileren en valideren van de werkelijke hoeveelheid eiwitten extract bestaande in de 2D-buffer na neerslaan. Stained profielen geven ons informatie over de kwaliteit en de homogeniteit tussen de monsters. Slechts monsters met vergelijkbare patronen worden gebruikt voor 2D-DIGE studies, anders wordt de 2D-DIGE kan leiden tot slechte kleuring en slechte resolutie eiwit profiel. Verschillen in deze monsters patronen komen vaker voor in de menselijke dan in muis hersenweefsel, aangezien menselijke hersenen monsters voor onderzoek deal met de vele lastig 38,39. Bovendien is de identificatie van eiwitafbraak door post-mortem interval reeds gemeld door 2D-DIGE 40,41. Verificatie van de pH vóór cyaninekleurstof etikettering, moet deze stap alle posterieure procedure aantasten. Cyaninekleurstof etikettering en SDS-PAGE-elektroforese moet worden gedaan in de duisternis alsveel mogelijk met het oog fluorescentielabeling niet te beïnvloeden. Tenslotte moet polyacrylamidegels zo homogeen mogelijk onder hen, om inter-variabiliteit elimineren tijdens elektroforetische migratie en achterste analyse 42,43 vergemakkelijken patronen elkaar overlappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Inserm, Universiteit van Lille 2, MEDIALZ, Labex (uitmuntendheid laboratorium, programma investeren voor de toekomst) en DISTALZ (ontwikkeling van innovatieve strategieën voor een transdisciplinaire benadering van de ziekte van Alzheimer). FJ.FG is momenteel een ontvanger gemeenschap van ANR (Franse Nationale Research Agency / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), maar dit werk ook onder de steun van een subsidie van de JCCM (Spanje).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
