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Neuroscience

आम सहमति मस्तिष्क व्युत्पन्न प्रोटीन, 2 डी DIGE और मिनी 2DE immunoblotting दोनों का उपयोग कर मानव और murine मस्तिष्क proteome के अध्ययन के लिए निकालना प्रोटोकॉल

Published: April 10, 2014 doi: 10.3791/51339
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1
1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

Summary

मानव और चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों के लिए यूरिया / Thiourea / एसडीएस बफर का उपयोग एक आम प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल की अनुमति देता है 2 डी DIGE और मिनी 2DE immunoblotting द्वारा उनके बाद लक्षण वर्णन द्वारा प्रोटीन की indentification. इस विधि मानव बायोप्सी और प्रयोगात्मक मॉडल से अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए एक सक्षम बनाता है.

Abstract

दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन (2DE) संभावित विभिन्न शारीरिक या रोग की स्थिति से संबंधित proteome संशोधनों को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. असल में, इस तकनीक एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) द्वारा एक पहला कदम में उनके isoelectric बिंदु के अनुसार प्रोटीन की जुदाई, और दूसरी उनके आणविक भार के अनुसार पर आधारित है. इस रिपोर्ट में मानव पोस्टमार्टम और माउस मस्तिष्क के ऊतकों की छोटी राशि के लिए एक अनुकूलित नमूना तैयार प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि दोनों दो आयामी प्रतिदीप्ति अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन (2 डी DIGE) और छोटा 2DE immunoblotting प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है. इन तरीकों का संयोजन एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री पता लगाने के साथ अपनी संगतता के लिए उनकी अभिव्यक्ति धन्यवाद में नए प्रोटीन और / या प्रोटीन संशोधनों को खोजने के लिए न केवल अनुमति देता है, लेकिन यह भी मार्करों सत्यापन में एक नई अंतर्दृष्टि. इस प्रकार, मिनी 2DE पद की पहचान करने और मान्य करने के लिए पश्चिमी सोख्ता परमिट के लिए युग्मितTranslational संशोधनों, प्रोटीन अपचय और विभिन्न स्थितियों और / या उपचार के बीच एक गुणात्मक तुलना प्रदान करता है. इस के साथ साथ, हम इस तरह amyloid-बीटा पेप्टाइड और अल्फा synuclein के रूप में ई. और Lewy शरीर मनोभ्रंश में पाया प्रोटीन समुच्चय के घटकों का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. हमारे विधि इस प्रकार proteome के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और अघुलनशील प्रोटीन भी मानव मस्तिष्क के ऊतकों और चूहों मॉडल से निकाल सकते हैं. समानांतर में, यह neurodegenerative रोगों के साथ ही संभावित उपन्यास बायोमार्कर और चिकित्सकीय लक्ष्यों में शामिल आणविक और सेलुलर रास्ते के अध्ययन के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकता है.

Introduction

मानसिक और तंत्रिका संबंधी विकार रोग की वैश्विक बोझ का 13% का प्रतिनिधित्व करते हैं, pathophysiological तंत्र, जोखिम कारकों और पूर्वरूप बायोमार्कर की तरह नई चुनौतियों 1 का पता लगाया जाना चाहिए. इस उद्देश्य के साथ लाइन में, मानव मस्तिष्क की प्रोटिओमिक्स पढ़ाई शारीरिक के लिए है लेकिन यह भी रोग की स्थिति के लिए न केवल स्मृति, व्यवहार, भावनाओं और उदाहरण के लिए neuronal plasticity, जैसे प्रक्रियाओं में शामिल आणविक मार्ग को उजागर करने के लिए अपरिहार्य हो गया है. इसलिए, पशु मॉडल का उपयोग करें और अधिक विशेष रूप से ट्रांसजेनिक चूहों, मानव neurodegenerative विकारों 2 की एटियलजि की नकल करने की संभावनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला लाता है.

प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में इन नए दृष्टिकोण को पूरा करने के क्रम में आजकल उपलब्ध हैं. दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन (2DE) नमूने की एक विस्तृत श्रृंखला के proteome तुलना करने के लिए सक्षम बनाता है एक शक्तिशाली और संभावना सरल विधि है. इसके अलावा, यह भी एकपहचान करने के क्रम में एक जटिल मिश्रण से एक प्रोटीन को अलग और आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली विधि. (आईईएफ) isoelectrofocusing द्वारा उनके isoelectric बिंदु (पीआई) के अनुसार 1) प्रोटीन जुदाई: इस तकनीक को अनिवार्य रूप से लगातार दो चरणों में होते हैं. अधिक संक्षेप में, एक बिजली के संभावित एक पीएच ढाल के बीच immobiline acrylamide स्ट्रिप्स भर में लागू किया जाता है और फिर प्रोटीन की ओर पलायन और उनके वैश्विक शुद्ध प्रभारी के समारोह में एक निर्धारित पीआई पर ध्यान दिया जाएगा. 2) Isoelectrically केंद्रित प्रोटीन उनकी पहली संरचना में है, जिससे प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ 3 से उनके स्पष्ट आणविक वजन (मेगावाट) के आधार पर अलग हो रहे हैं,) विकृत कर रहे हैं और नकारात्मक सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस के अलावा द्वारा आरोप लगाया. इन दो विशिष्ट गुण हमें proteome के अध्ययन में आगे जाने के लिए एक डबल मूल्य से निपटने के लिए अनुमति देते हैं. एक ओर इस दृष्टिकोण न्यूनतम रंजक 2 डी DIGE विधि का उपयोग कर एक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए संभावना प्रदान करता है, और दूसरी तरफ एक qualitativमिनी 2DE द्वारा ई विश्लेषण पश्चिमी सोख्ता के लिए युग्मित.

2 डी DIGE द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति सभी नमूना proteome परिवर्तन पर bestows. संक्षेप में, नमूने तीन अलग तरंग दैर्ध्य (नीले, हरे और लाल) में उत्सर्जन तीन cyanines (Cy2, Cy3 और Cy5) के साथ लेबल रहे हैं. N-हाइड्रोक्सी succinimidyl एस्टर समूह युक्त ये Fluor न्यूनतम रंगों सहसंयोजक एमाइड बांड 4 में जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन की lysines अवशेषों की ε अमीनो समूह के साथ प्रतिक्रिया. लाइसिन अवशेषों केवल 1-3% के बीच है और इस तरह के प्रोटीन के प्रति एकाधिक लेबल अलावा और प्रमुख शुद्ध प्रभारी संशोधनों 5, 6 रोकने चिह्नित कर रहे हैं. Cy3 और Cy5 अक्सर Cy2 तुलना करने के लिए नमूने के समान अनुपात का मिश्रण टैग जबकि दो स्वतंत्र नमूने लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है. दो मुख्य लाभ सभी लेबल नमूने मिश्रित कर रहे हैं और आईईएफ और एसडीएस पृष्ठ तुलना जैल के कारण प्रयोगों के बीच अंतर परिवर्तनशीलता से परहेज, हर कदम के लिए एक बार में एक जेल में किया जाता है कि कर रहे हैं. इसके अलावा, यह प्रोटीन 7 के लगभग 1 femtomole की एक उच्च पता लगाने के दहलीज प्रस्तुत करता है. जैल स्कैन और 2 डी सॉफ्टवेयर Cy2 मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उनके पीछे पहचान के लिए स्पॉट के बीच सांख्यिकीय मतभेद की पहचान के लिए अनुमति देने के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में कार्य करता है, जहां 2 डी जेल प्रतिदीप्ति छवियों, तुलना कर रहे हैं. आंतरिक मानक का उपयोग कर 2 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर सांख्यिकीय आत्मविश्वास 8 की 95% से अधिक के साथ नमूने के बीच मतभेद के कम से कम 10% की एक तेजी से पता लगाने को प्राप्त होता है.

मिनी 2DE द्वारा गुणात्मक विश्लेषण प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. सिद्धांत पहले पीआई और मेगावाट अलग होने के लिए वर्णित के रूप में ही है, लेकिन इस मामले में प्रोटीन एक झिल्ली के लिए एक छोटा सा polyacrylamide जेल से स्थानांतरित कर रहे हैं और immunoblotting बाद में किया जाता है. एक आयाम जेल वैद्युतकणसंचलन एक या एंटीबॉडी का समारोह, informatio में कई प्रोटीन epitopes के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रदान करता हैमिनी 2DE के एन दो अतिरिक्त पैरामीटर के साथ endows. सबसे पहले, प्रोटीन isovariants बाद translational संशोधनों जगह ले सकता है यह दर्शाता है कि गड़बड़ी के समारोह में बदल जाते हैं. दूसरे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री पहचान प्रशंसनीय zymogens और प्रोटीन की catabolic उत्पादों का संकेत हो सकता है. इसलिए, 2 डी DIGE से मनाया संशोधनों वैश्विक proteome प्रोफ़ाइल में परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र का संकेत संभावना है. मिनी 2DE द्वारा ही प्रोटीन का मिलान / एस के लिए कई नमूनों के बीच immunoblots के संरेखण अम्लता थोड़ा मनाया बाद translational रूपों में प्रकाश बहा परिवर्तन या भी नहीं monodimensional immunoblotting 9, 10 से प्रतिबिंबित कर सकते हैं. इसके अलावा, इस विश्लेषण चयापचय अवशेषों 11,12 के पीआई और मेगावाट का ज्ञान होने के कारण संभावित दरार साइटों के बारे में बताते हैं.

इन दो तकनीकों के संयोजन एक पूरक प्रोटिओमिक्स विश्लेषण प्रदान करता है. एक तरफ 2 डी DIGE एक typ परमिटजिनकी अभिव्यक्ति अलग है polypeptides के एक सटीक अलगाव की अनुमति मतभेद के ए. इन मतभेदों को एक जगह या फ्लोरोसेंट जैल के सॉफ्टवेयर विश्लेषण करके किसी एक की तीव्रता की वृद्धि / कमी की उपस्थिति या लापता होने में अनिवार्य रूप से मिलकर बनता है. हालांकि, खुद के द्वारा इन टिप्पणियों मनाया संशोधन के स्वरूप की व्याख्या की संभावना नहीं है. के isovariant / isoform स्तर में परिवर्तन: पॉलीपेप्टाइड अलग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की है एक बार इन कारणों के लिए, मिनी 2DE का प्रयोग) ठीक 1 की पुष्टि करने के लिए अलग प्रोटीन की पहचान और अंतर का 2) प्रकृति में सक्षम बनाता है उदाहरण के लिए अभिव्यक्ति, बाद translational संशोधनों और दरार प्रक्रियाओं. हालांकि, यह बहुत भिन्न हैं कि निकासी प्रोटोकॉल के उपयोग से उत्पन्न संभावित dispersions को सीमित करने के क्रम में 2 डी DIGE साथ और मिनी 2DE साथ संगत दोनों एक प्रारंभिक lysis बफर का विकास जरूरी है.

वर्तमान अनुच्छेद में, हम डी2 डी DIGE और मानव और चूहे के ऊतकों से आ रही मस्तिष्क प्रोटीन के लिए मिनी 2DE तकनीक की तैयारी, निष्कर्षण और प्रदर्शन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल मानते.

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Protocol

1. Homogenization और मानव और माउस मस्तिष्क के ऊतकों से कुल प्रोटीन निष्कर्षण

  1. मस्तिष्क के ऊतकों homogenization. एक (मानव नमूनों के लिए) पॉटर कांच या (चूहों के नमूने के लिए) Teflon homogenizer का उपयोग कर मस्तिष्क के ऊतकों 10% (w / v) 8 एम यूरिया में, 2 एम Thiourea और w / वी एसडीएस बफर (यूटीएस) 1% homogenize. 60 हर्ट्ज कुल ऊतक विघटन 13, 14 के लिए 0.5 सेकंड लागू करने के एक अल्ट्रासाउंड जनरेटर के साथ 30 दालों पर sonicate.
    1. मानक के रूप में बीएसए का उपयोग, ब्रैडफोर्ड परख के साथ प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण. इस बफर निकासी के रूप में लंबे lysates carbamylation 15 से बचने के लिए गर्म से अधिक नहीं कर रहे हैं के रूप में एक आयाम एसडीएस पृष्ठ के साथ पूरी तरह से संगत है यूटीएस.
    2. 1% जोड़ें (w / v) Amberlite की और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के दौरान सौम्य मिश्रण के साथ सेते हैं. इसके बाद 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर पर फिल्टर और अंत में यूरिया / Thiourea समाधान के लिए एसडीएस जोड़ने. यह कदम equilibr में हैं जो यूरिक एसिड और isocyanic अम्ल की मात्रा कम कर देता हैसमाधान में यूरिया के साथ IUM और उसके पतन की सुविधा.
  2. क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल प्रोटीन तेज़ी. (स्वतंत्र रूप से आईईएफ प्रदर्शन करने के लिए चयनित पीएच सीमा पर) 18 सेमी लोगों के लिए 11 सेमी IPG स्ट्रिप्स और 1-1.5 मिलीग्राम के लिए प्रोटीन के ग्राम 100-150 के बीच वेग.
    1. बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों को पूरा करें वर्षा की प्रक्रिया शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कूल क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल.
    2. यूटीएस lysate के एक मात्रा को मेथनॉल के तीन खंडों और क्लोरोफॉर्म की एक मात्रा में जोड़ें. मैन्युअल रूप से मिश्रण हिला और ठंडे पानी के तीन खंडों को जोड़ने. 1 मिनट के दौरान और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा प्रोटीन गोली भंवर
    3. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ठंड MeOH के तीन खंडों को जोड़ने. फिर भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के दौरान 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र अंत में सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एन 2 के तहत गोली सूखी.
  3. 2D विश्लेषण के लिए प्रोटीन की तैयारी.2 डी बफर में प्रोटीन सूखे गोली (8 एम यूरिया, 4% CHAPS के साथ पूरक 2 एम Thiourea) Resuspend. जैसा कि ऊपर Amberlite साथ समाधान धो लें और 2 डी DIGE के लिए 2 डी बफर के 200 μl प्रति प्रोटीन की 500 ग्राम का अनुपात रखने की कोशिश. नोट: 2D बफर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या (यूरिया गिरावट को रोकने के लिए) एक सप्ताह के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.
    1. Sonicate और निम्नलिखित कदम से बाहर ले जाने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान. प्रोटीन की फार्मिक एसिड solubilization 10 समुच्चय के बाद उल्लेखनीय है, इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षेप में, एन 2 के तहत फार्मिक एसिड लुप्त हो जाना और वर्णित के रूप में गोली resuspend.

2. 2 डी DIGE

  1. नमूनों की गुणवत्ता का परीक्षण. फिर खुराक नमूने ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग. एलडीएस नमूना बफर, गर्मी 37 डिग्री सेल्सियस 15 में प्रोटीन की 15 ग्राम पतला और 4-12% polyacrylamide जैल पर लोड.
  2. Coomassie धुंधला. 0.1% के साथ polyacrylamide जेल दाग (w / v) Coomassieब्लू जी 250, 50% EtOH और 10% कम से कम 1 घंटे के लिए (v / v) एसिटिक एसिड समाधान. पृष्ठभूमि 7% एसिटिक एसिड और 10% (v / v) इथेनॉल समाधान में रात भर destain करते हैं.
  3. नमूनों की पूर्व electrophoretic लेबलिंग. पिछले जाती डाई लेबलिंग करने के लिए प्रदर्शन, एन hydroxysuccinimide प्रतिस्थापन बुनियादी पीएच पर अधिक कुशल है और पीएच 8.6 पर इष्टतम होना करने के लिए दिया क्योंकि बुनियादी या भी तटस्थ होना चाहिए जो नमूना के पीएच, सत्यापित.
    1. 50 माइक्रोग्राम protein/400 pmol डाई के अनुपात के साथ Cy3 या Cy5 फ्लोरोसेंट रंगों के साथ अध्ययन की न्यूनतम दो नमूने लेबल और unprotonated amine साथ cyanines की एनएचएस एस्टर प्रतिक्रियाशील समूह की सुविधा के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए रख lysines के समूह.
    2. एक विशेष जाती को एक नमूने के एक तरजीही युग्मन परहेज, Cy3 और Cy5 रंगों के साथ एक पार लेबलिंग बनाने नमूना विविधताओं को कम करें. जाती डाई न्यूनतम लेबलिंग जनसंपर्क 1 ग्राम का अनुपात रखने के साथ प्रोटीन की छोटी राशि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि नोट8 pmol जाती डाई प्रति otein. यदि हां, मिनी 2DE प्रणाली के बजाय बड़े 2D जेल प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह मस्तिष्क के ऊतकों की एक छोटी राशि के लिए 2 डी DIGE विश्लेषण सक्षम हो जाएगा.
    3. Cy2 फ्लोरोसेंट डाई के साथ प्रोटीन की एक ही राशि (कुल 50 ग्राम) के साथ दोनों के नमूनों का एक पूल लेबल और आंतरिक मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है. पहले संकेत के रूप में एक ही शर्तों का उपयोग करें.
    4. 1.1% Destreak अभिकर्मक, IPG बफर के 1.2% और Bromophenol ब्लू लेबल प्रोटीन की कुल 150 ग्राम (Cy2 की 50 ग्राम, Cy2 की 50 Cy3 के ग्राम और 50 ग्राम) के निशान से युक्त 2 डी बफर के साथ कुल मात्रा 350 μl को पूरा करें. चार स्वतंत्र स्ट्रिप्स का उपयोग चार प्रतियों में इस चरण को पूरा. इसके अलावा, प्रारंभिक जैल के लिए प्रोटीन की 350-450 ग्राम के साथ दो अतिरिक्त गैर लेबल स्ट्रिप्स (प्रत्येक नमूने के लिए) तैयार करते हैं.
    5. निष्क्रिय पुनर्जलीकरण के लिए खनिज तेल रातोंरात के साथ कवर छह भरी हुई स्ट्रिप्स छोड़ दें.
  4. Isoelectrofocusing. 20 पर आईईएफ बाहर ले जाने के6, सी. एक पीएच 3 11NL के लिए, 18 सेमी प्रोटोकॉल पट्टी है: अधिकतम वर्तमान सेटिंग 8 दौर के दौरान 50 μA / पट्टी है: 1) 150 वी 1 घंटे के लिए कदम, 2) 200 वी 5 घंटा, 3) 500 वी ढाल के लिए कदम के लिए 2 घंटा, 2 घंटे के लिए 4) 1,000 वी ढाल, 5) 2,000 वी 2 घंटे के लिए ढाल, 6) 4000 वी 2 घंटे के लिए ढाल, 7) 8000 वी 2 घंटा और 8) 24,000 वी की कुल के लिए के लिए ढाल · घंटा कदम . आईईएफ के बाद, क्रोमैटोग्राफी कागज का उपयोग कर खनिज तेल की अतिरिक्त प्रेषण और दूसरा आयाम तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्ट्रिप्स की दुकान.
  5. IPG संतुलन स्ट्रिप्स. उसी बफर में iodoacetamide के 4.7% के साथ, लेकिन डीटीटी के बिना 6 एम यूरिया, 2% एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 15 मिनट के दौरान डीटीटी का 1% से 8.6 बफर में और बाद स्ट्रिप्स संतुलित करना.
  6. दूसरा आयाम है या एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन. छह से 12% एसडीएस पृष्ठ जैल (1.5 एम Tris-एचसीएल पीएच 8.6, 12% acrylamide / bisacrylamide, 0.1% (w / v) एसडीएस, 0.072% (w / v) ए पी एस और 0.1% (v / v) बनाओ TEMED ) stri के लिए चार कम प्रतिदीप्ति ग्लास प्लेट के साथ एक बड़े 2 डी प्रणाली का उपयोग कर एक ही समय मेंप्रोटीन स्पॉट आबकारी क्रम में प्रारंभिक जैल के लिए मोटाई 1.5 मिमी के साथ प्रतिदीप्ति नमूने और दो अन्य ग्लास प्लेट के साथ पी एस.
    1. (W / v) agarose के 0.5% के साथ जैल के शीर्ष पर और बहुस्तरीय से अधिक छह IPG स्ट्रिप्स लोड करें. रनिंग बफर 25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन और 0.1% (w / v) एसडीएस से बना है. 4 डिग्री सेल्सियस 16,17 करने के लिए सेट एक प्रशीतन प्रणाली के साथ रातोंरात 2.5 डब्ल्यू / जेल में प्रवास करते हैं.
  7. प्रतिदीप्ति छवियों अधिग्रहण और विश्लेषण. प्रतिदीप्ति जैल छवियों (एक प्रयोग के लिए 12 तस्वीरें) प्राप्त करने के लिए एक आंधी 9400 स्कैनर का प्रयोग करें. स्कैन Cy2, 488/520 एनएम, 532/580 एनएम और 630/670 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, क्रमशः पर प्रत्येक जेल के लिए Cy3 और Cy5 छवियों. छवियों का विश्लेषण करने के लिए सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. आंकड़ों का अध्ययन दो नमूनों के बीच चार जैल भर में संकेत के वितरण के साथ जुड़े स्पॉट मात्रा के बदलाव के प्रतिनिधि हैं.
  8. बड़ा जैल के लिए Coomassie धुंधला. 5 में प्रारंभिक जैल फिक्स0% (v / v) EtOH और 3% से कम से कम 24 घंटे के लिए (v / v) orthophosphoric एसिड समाधान. फिर उसके बाद 20 मिनट के लिए अति शुद्ध पानी के साथ दो बार धोने. 34% में रंगाई प्रदर्शन करना (v / v) MeOH, 17% (w / v) अमोनियम सल्फेट और (w / v) Coomassie ब्लू जी 250 0.1% जोड़ने से पहले 1 घंटे के लिए 2% orthophosphoric एसिड. कम से कम 48 घंटे और अति शुद्ध पानी में decolorized के लिए रंगाई में जैल रखें.
    1. एमएस पहचान के लिए स्पॉट. प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण कर रहे हैं, सॉफ्टवेयर जिनकी अभिव्यक्ति सांख्यिकीय अलग है स्थानों की एक सूची प्रदान करता है. मैन्युअल प्रारंभिक जैल से इन स्थानों आबकारी. यह प्रक्रिया केरातिन संक्रमण से बचने के क्रम में अभ्यास और कुछ मैनुअल कौशल की आवश्यकता है. फिर नमूने एमएस करने के लिए भेजने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर पानी में रखा जा सकता है. स्पॉट पहचान अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) और प्रोटीन पहचान की प्रासंगिकता के साथ पूरी तरह से संगत है प्रायिकता 0.05 (पी <0.05) 18 में से एक पी मूल्य के साथ गणना आधारित Mowse स्कोर के अनुसार माना जाता है.
      2. </ राजभाषा>

    3. गुणात्मक मिनी 2DE परख

    1. 2 डी बफर में प्रोटीन के नमूने की अधिकतम 100 माइक्रोग्राम Resuspend एक 11 सेमी IPG पट्टी के लिए 200 μl के अंतिम मात्रा तक. Overexpression प्रणाली या शुद्ध प्रोटीन के मामले में प्रारंभिक राशि 20 ग्राम तक कम किया जा सकता है.
    2. 200 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए (v / v) Destreak अभिकर्मक, 0.55% (v / v) IPG बफर और Bromophenol ब्लू के निशान 1.1% जोड़ें. फिर, भंवर, एक तेजी से स्पिन बनाने के लिए और रातोंरात खनिज तेल के साथ कवर (अपने मूल मोटाई के लिए पट्टी लाने के लिए) निष्क्रिय पुनर्जलीकरण के लिए एक IPG पट्टी में लोड. नोट: IPG बफर के अनुपात में पीएच वांछित (पीएच 3-11, 4-7, 7-11, आदि) के सभी अंतराल के लिए ही है, लेकिन इसकी संरचना चयनित पीएच श्रेणी के समारोह में बदलता है.
    3. Isoelectrofocalisation. 20 डिग्री सेल्सियस पर आईईएफ प्रदर्शन करना कार्यक्रम की अवधि चयनित पीएच अंतराल पर निर्भर करता है. उल्लेखनीय है, ऐसे electroendosmosis आईईएफ प्रोफाइल खलल पड़ सकता है के रूप में और इन मामलों में पैरामीटर,electrofocalisation समय में अनुकूलन 19 की आवश्यकता है. नोट: यह जरूरी बेहतर परिणाम प्रदान करता है, लेकिन आईईएफ के समय छोटा भी संकल्प सुधार कर सकते हैं कि एक लंबे समय तक आईईएफ नहीं है. आईईएफ के बाद, IPG स्ट्रिप्स महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    4. IPG संतुलन स्ट्रिप्स. 25 मिमी Tris-एचसीएल 6.8 पीएच, 20 मिमी डीटीटी, 10% ग्लिसरॉल, 5% एसडीएस, 0.05% Bromophenol ब्लू युक्त बफर में स्ट्रिप्स संतुलित करना. तीन संतुलन प्रत्येक स्नान के बीच बफर समाधान बदलने के साथ 15 मिनट के लिए bathes बनाओ.
    5. एसडीएस पृष्ठ. ब्याज की प्रोटीन की मेगावाट के आधार पर चुना polyacrylamide के एक प्रतिशत के साथ एक मिल में बना हुआ जेल (IPG एक अच्छी तरह से, 11 सेमी IPG पट्टी) पर IPG पट्टी परत. फिर, 33 मिनट के दौरान 100 एम वी पर एक nitrocellulose / PVDF झिल्ली पर जेल दाग.
    6. आवश्यक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात सेते हैं और peroxidase गतिविधि द्वारा कल्पना. माध्यमिक एंटीबॉडी से पता चला असंबंधित polypeptides का उपयोग immunoblots के संरेखण प्रदर्शन करना. एक अर्द्ध quantit रीचImageJ सॉफ्टवेयर के साथ निशान / स्थानों के लिए मात्रा और तीव्रता के densitometry द्वारा विश्लेषण ative.

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Representative Results

कोई आदर्श बफर प्रोटीन की 100%, विशेष रूप से झिल्ली जुड़े या cytoskeleton प्रोटीन ठीक करने के लिए मौजूद है के बाद से मस्तिष्क के ऊतकों पर प्रोटिओमिक्स चुनौती बनी हुई है. प्रयोगों का पहला सेट प्रोटीन की एक बड़ी पैनल को ठीक करने के लिए सक्षम बनाता है जो दो दृष्टिकोणों के अनुकूल है तथा एक उपयुक्त lysis बफर के लिए खोज पर ध्यान केंद्रित किया गया. इस प्रकार, तीन सेल बफ़र्स सबसे उपयुक्त एक निर्धारित करने के लिए assayed थे. सबसे पहले, यह 1% के साथ 10 मिमी (w / v) एसडीएस (चित्रा 1 ए) पर आम जैव रासायनिक और आणविक जीव विज्ञान बफर Tris-एचसीएल 20 इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, Tris-एचसीएल polyacrylamide और agarose जैल के लिए एक वैद्युतकणसंचलन बफर के रूप में एक मजबूत आवेदन किया है. अन्य दो सेल बफ़र्स यूटीएस (चित्रा 1 बी) और 2DE एक थे. Tris-एसडीएस एक गरीब संकल्प उपज और धब्बों की संख्या काफी है, जहां एक उच्च स्थान जुदाई, कोई distorsion और एक पिता यूटीएस, साथ मनाया प्रोफाइल के साथ तुलना में (चित्रा 1 बी) उतारा गयाआर बेहतर प्रोटीन की वसूली (चित्रा 1 बी) मनाया गया. इस बिंदु Tris-एचसीएल बेंच Centrifugation के बाद एक मोटी एक यूटीएस निकासी की पैदावार लगभग कोई अवशिष्ट गोली, बकाया है, जबकि तथ्य यह है कि द्वारा समर्थित है. पैटर्न चित्रा 1 बी में दिखाया स्पष्ट रूप से इस तरह के Tris-एचसीएल के रूप में अन्य बफ़र्स के बारे में केन्द्र शासित प्रदेशों में उच्च प्रोटीन विलेयता का सबूत देता है. कि यहां तक ​​कि 2DE बफर भी परीक्षण किया गया था Notheworthy, इसके उपयोग के गोली के बावजूद के बाद से ही इनकार कर दिया गया था न तो मनाया गया लिपिड भंग नहीं कर रहे थे और वे हेरफेर difficulting ऊपरी परत में बने रहे. इन आंकड़ों के साथ समझौते में, यह अमीनो एसिड के अवशेष के बीच nonconvalent और ईओण बांड में खलल न डालें और 21 2) इसके अलावा सेलुलर प्रोटीन नीचा जो proteases की गतिविधि से बचने के द्वारा प्रोटीन denatures कि 1) अपने तटस्थ chaotrope कई कारणों के लिए यूटीएस बफर का उपयोग की सिफारिश की है यूरिया समाधान के लिए Thiourea की काफी हाइड्रोफोबिक झिल्ली प्रोटीन की विलेयता को बढ़ाता हैऔर कुल 22, 23 के लिए प्रवण और 3) anionic डिटर्जेंट एसडीएस की adjunction लिपिड टूटता प्रोटीन hydrophobic बातचीत के माध्यम से प्रोटीन बाँध, साथ ही प्रोटीज और फॉस्फेट गतिविधि निषेध 24,25 बढ़ जाती है. इसके अलावा यह आईईएफ बाधित हो सकता है कि impureties को खत्म करने के लिए एक तेज़ी कदम जोड़ने का निर्णय लिया गया था. इस तरह, के रूप में तेज़ी विधि 26 और मेथनॉल पहले से ही मस्तिष्क के ऊतकों में प्रचुर मात्रा में हैं जो लिपिड को दूर करने के लिए सबसे उपयुक्त विलायक के रूप में वर्णित किया गया है प्रोटीन की विलेयता निर्धारित करता है, यह क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल वर्षा 27 का चयन करने के लिए हमें लाया. zwitterionic डिटर्जेंट चैप्स (3 - [(3 cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-प्रोपेन सल्फ़ोनेट) का उपयोग प्रोटीन resuspending के लिए 2 डी बफर में गोली प्रथम आयाम कदम 28 में प्रोटीन प्रवेश द्वार को सुविधाजनक बनाने के लिए इसकी उपयुक्तता के कारण है.

मानव और चूहों के मस्तिष्क जनसंपर्क की प्रोफाइल2 डी DIGE द्वारा oteome क्रमशः आंकड़े 2A और 2 बी में दिखाया गया है. चित्रा 2A में मानव नियंत्रण से आ रही फ्लोरोसेंट छवियों विलय कर दिया और ई. प्रांतस्था नमूने ई. तरह ताउ विकृति 29 की एक मॉडल के हिप्पोकैम्पस से चूहों के नमूने लिए चित्रा 2B वही में मनाया जा सकता है. Cy2, Cy3 और Cy5 क्रमशः आंकड़े में मानव नमूनों -2 सी -2 ई के लिए सचित्र हैं. दोनों का विलय कर दिया पैटर्न (2A चित्रा और 2 बी) एक उच्च गुणवत्ता आईईएफ और चित्रा 1 बी में मनाया प्रोफाइल के साथ समझौते में दूसरा आयाम जुदाई को दर्शाती एक उच्च स्थान संकल्प प्रस्तुत करते हैं. एक साथ पार से जोड़ने सॉफ्टवेयर विश्लेषण भर के लिए पंक्ति में इन प्रतिदीप्ति छवियों (आंकड़े -2 सी -2 ई) बहुत आसान बनाने के लिए, एक विशेष जाती के लिए प्रोटीन का एक संभव वरीयता खत्म करने के क्रम में किया जाता है कि इस तथ्य के साथ इस मौके परिभाषा गुणवत्ता. इसके अलावा, प्रारंभिक जैल नीले सह के साथ दागomassie सबूत एक सॉफ्टवेयर विश्लेषण के बाद और एमएस / एमएस द्वारा उनके पीछे पहचान के लिए स्पॉट आबकारी करने की अनुमति सभी उपयोग पीएच सीमा पर प्रचुर मात्रा में स्पॉट, साथ एक समृद्ध प्रोटीन का नक्शा.

एक प्रोटीन के लिए immunoblotting द्वारा गुणात्मक छोटा 2DE विश्लेषण बाद translational लोगों के लिए बल्कि oligomers और truncations के लिए (आंकड़े 3 ए और 3 बी) न केवल अपने पहचान और संशोधन के लिए उच्च मूल्य जानकारी प्रदान करता है. मिनी 2DE में इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए व्यवहार्यता ब्याज की प्रोटीन के बारे में तेजी से और सटीक आंकड़े उपलब्ध कराता है. Lewy शरीर मनोभ्रंश (LBD) से प्रभावित एक रोगी से ऊतक के बारे में, अल्फा synuclein के लक्षण वर्णन फिर साथ, देशी प्रोटीन 4.67 की एक अनुकरणीय में है और 18 केडीए के एक मेगावाट जहां एक अच्छी तरह से परिभाषित 4-7 पीएच प्रोफाइल कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है मिनी 2DE यह आगे देशी रूपों की तुलना में एक ही पीआई पर dimers (चित्रा 3, तारांकन) की उपस्थिति भी है लेकिन ubiq के अस्तित्व को देखा जा सकता हैवे (चित्रा 3A, तीर) कर रहे हैं जब अधिक ubiquitinated अधिक बुनियादी और एक उच्च मेगावाट के साथ कर रहे हैं कि uitinated रूपों. परिचित ई. से जुड़ा हुआ एक अन्य प्रोटीन amyloid प्रोटीन अग्रदूत (एपीपी) के जटिल अपचय द्वारा उत्पन्न amyloid-बीटा पेप्टाइड है. चित्रा 3 बी में यह एक पारिवारिक एक साथ एक छिटपुट ई. मामले की साजिश तुलना में है. परिचित ई. के मामले में यह amyloid-बीटा 1-42 छिटपुट ई. के संबंध में कमी आई है कैसे मनाया जा सकता है, और इसके अलावा, isovariants amyloid-बीटा X-42 (4 केडीए) ने भी सभी अंतराल पर नीचे विनियमित रहे हैं इस बीच 8 केडीए में पाया oligomers स्पॉट तीव्रता परिचित ई. (3B चित्रा) में अधिक प्रासंगिक है, क्योंकि इस तथ्य, प्रोटीन की कम मात्रा के कारण नहीं है कि दर्शाते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1: 2DE जनसंपर्कofile 10 मिमी Tris 1% एसडीएस डब्ल्यू / वी बफर निष्कर्षण (ए) और यूटीएस उपयोग (बी) के बाद प्राप्त पैटर्न. के बाद पैनल बी में यह धब्बे, तीव्रता और संकल्प की संख्या एक से ज्यादा है कैसे देखा जा सकता है पैनल की (ए). यूटीएस का उपयोग यह 2DE Coomassie धुंधला में परिलक्षित होता है कि एक लगभग कुल प्रोटीन निकासी की अनुमति देता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2: मानव (ए) और चूहों (बी) के लिए 2 डी DIGE प्रोफाइल के सचित्र हैं छवियाँ (ए) और (बी) 18 सेमी पट्टी के एक 3-11 पीएच रेंज में तीन cyanines के लिए मर्ज किए गए छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं.. चित्र (सी), (डी) में और (<मजबूत> ई) cyanines लाल रंग में (नीले रंग में Cy2, हरे रंग में Cy3 और Cy5) स्वतंत्र रूप से उजागर कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3:. ऊपरी पैनल में देशी पीआई (4.4) एक LBD रोगी में प्रोटीन अल्फा synuclein का मिनी 2DE प्रोफाइल मनाया जा सकता है और dimerization (तारांकन) के समारोह में मेगावाट (18 केडीए) परिवर्तन जहाँ मेगावॉट एक और अधिक बुनियादी एक (तीर) (ए) तक पीआई बदलाव कि डबल, और ubiquitination है. नीचे चित्र ई. के एक छिटपुट और आनुवंशिक मामले में एक amyloid-बीटा पेप्टाइड एंटीबॉडी के प्रोफाइल का पता चलता है. 2DE पैटर्न oligomerization और गिरावट डीआईएसई के एटियलजि के अनुसार एक अलग ढंग से जगह लेने के शो कैसेएएसई. इस immunoblot स्पष्ट रूप से दो स्थितियों के बीच एपीपी अपचय में मतभेद बताते हैं. Oligomers कम (बी) के रूप में चिह्नित होने लगते हैं, जबकि एक ओर पारिवारिक एक (तीर) के बारे में छिटपुट ई. में में catabolic उत्पादों में वृद्धि हुई है, वहाँ है. इन प्रयोगों से क्रमश: 12% बीआईएस-tris जेल में एक 4-7 पीएच अंतराल में और एक 16.5% Tris-Tricine एक में 11 सेमी स्ट्रिप्स में प्रदर्शन किया गया है (ए, बी). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटीन का रोग अभिव्यक्ति परिवर्तन की खोज, बायोमार्कर के लिए खोज और औषधीय लक्ष्यों के लिए संभावित रास्ते के मॉडुलन neuroproteomics के उद्देश्य के बीच में हैं 30 दृष्टिकोण. उभरते उपकरणों के बीच, 2DE क्षेत्र एक होनहार उत्तराधिकार प्राप्त करने की आशा वाला कहते हैं. फिर भी, एक आम सहमति परिवर्तनशीलता को कम करने और प्रयोगों में reproducibility बढ़ाने के लिए पहुँच जाना चाहिए. इस विचार की लाइन में 2 डी DIGE (चित्रा 2) और मोनो आयामी immunoblotting के साथ पूरी तरह से संगत मानव और चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों के लिए बाद में 2DE immunoblotting (चित्रा 3) प्रदर्शन करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल के साथ साथ विस्तृत में वर्णित है.

प्रोटिओमिक्स में सबसे बड़ी दुविधाओं में से एक solubilization बफर पसंद है. यह आईईएफ के साथ पूरी तरह से संगत है के बाद से अलग अलग दृष्टिकोण के बीच reproducibility बढ़ाने के क्रम में, यूटीएस चुना गया था. इसके अलावा, यूटीएस निष्कर्षण बफर कोई पेले पैदावारटी या 12,000 XG पर centrifugation के बाद एक बहुत मामूली एक (4 डिग्री सेल्सियस पर एसडीएस तेज़ी के साथ भ्रमित नहीं है). इस खाते में एक महत्वपूर्ण बिंदु ले जा रहा है कि ई. सहित कई neurodegenerative विकारों मौजूद प्रोटीन एकत्रीकरण,. कोई स्वतंत्र अध्ययन घुलनशील और गैर घुलनशील अंश के लिए किया जाना चाहिए के बाद से कोई गोली नहीं है कि तथ्य यह है, प्रदर्शन और डेटा व्याख्या सरल करता है.

2 डी DIGE या मिनी 2D दृष्टिकोण का प्रदर्शन होने जा रहे हैं, जो कुछ भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि कुछ सीमाएं हैं. सबसे पहले यूटीएस बफर के रासायनिक गुणों, इस समाधान गरम नहीं होना चाहिए, या carbamylation प्राथमिक amines पर होता है और इसलिए आईईएफ 15 आई. द्वारा स्पॉट संकल्प बिगड़ती जाती डाई युग्मन और 2 डी प्रोफाइल दोनों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. दूसरे, उपलब्ध पीएच पर्वतमाला, आजकल व्यापक पीएच अंतराल 3-11 के बीच है, इस पहलू IPG पट्टी पर सभी प्रोटीन प्रविष्टि expl सकता है नहीं कि संभावना से जुड़ाधुंधला के बाद जैल के दोनों पक्षों में खड़ी प्रोटीन बैंड ऐन. पूरे proteome 2 डी द्वारा अध्ययन किया जा सकता है नहीं क्यों इस सीमा व्याख्या हो सकती है. एक अन्य महत्वपूर्ण सीमा वर्षा के विवाद इस्तेमाल होता है. एक ओर, यह कुशलतापूर्वक लिपिड सामग्री 27 कम करने के लिए सक्षम बनाता है कि क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल के साथ वर्षा कदम करने के लिए उच्च recommendable है, लवण, न्यूक्लिक एसिड और आईईएफ मापदंडों के साथ हस्तक्षेप और संकल्प और / या reproducibility के प्रभाव हो सकता है आरोप लगाया है कि डिटर्जेंट 2D. इसके अलावा, दूसरी ओर यह दृढ़ता से झिल्ली से जुड़ी कुछ प्रोटीन खो दिया जा सकता है कि संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता. बहरहाल, अन्य निष्कर्षण बफ़र्स बजाय यूटीएस के साथ या proteases या फास्फेटेजों inhibitors के अलावा बिना उपयोग किया जाता है उस मामले में, वर्षा कदम का उपयोग अत्यधिक आईईएफ के दौरान किसी भी नुकसान की सिफारिश की है. अंत में, यह 2 डी DIGE छवियों विश्लेषण प्रतिदीप्ति छा कि असुविधा प्रस्तुत करता उल्लेखनीय है किसॉफ्टवेयर विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण बदलाव की तरह इस पर विचार नहीं करता है के बाद से धब्बे, सूचना का नुकसान हो सकता है.

इस संयुक्त विधि की नवीनता उनके reproducibility, बहुमुखी प्रतिभा और प्रोटीन लक्षण वर्णन में निहित है. केवल एक निष्कर्षण बफर एक दो पूरक तकनीकों प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. 2 डी DIGE प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन और एमएस / एमएस द्वारा उनके बाद पहचान के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है. हालांकि, यह isoforms, isovariants, zymogens, बाद translational संशोधनों और catabolic उत्पादों अन्य प्रोटीन के साथ छा प्रतिदीप्ति के बाद से नहीं पहचाना जा सकता है कि संभव है. इस सीमा को पार करने के लिए यह मिनी 2DE के समानांतर उपयोग में प्रस्तावित है. वास्तव में, हमारे ज्ञान करने के लिए प्रतिबद्ध किया जा सकता है कि सबसे महत्वपूर्ण ख़तरा से एक 2 डी DIGE परिणामों की एक पूरी मान्यता के रूप में मोनो आयामी immunoblotting लेने के लिए, या यहां तक ​​कि किसी भी प्रोटिओमिक्स संशोधन मान्य करने के लिए आवश्यक नहीं है कि विचार करने के लिए है. Furthermore, छोटा 2DE के तकनीकी लाभ कर रहे हैं 1) छोटे एसडीएस पृष्ठ प्रणाली, 2) अपेक्षाकृत कम सामग्री आवश्यक, पीएच 3) व्यापक श्रृंखला उपलब्ध, 4) immunoblot संवेदनशीलता और 5) आसान आकलन व्यवहार्यता का उपयोग परिवर्तन. मिनी 2DE तकनीक के fussiest पहलुओं, मात्रा का ठहराव है मिनी 2DE के बावजूद इस तरह से एक विश्वसनीय प्रस्तुत, धब्बे या भूखंडों संरेखण के बाद यह अम्लीय और बुनियादी हिस्सा है या ठीक इसके विपरीत के बीच एक अनुपात स्थापित करने के लिए संभव है, एक मात्रात्मक दृष्टिकोण पर विचार नहीं किया जा सकता परिवर्तन का आकलन 9 मनाया.

साहित्य में कई डेटा सटीक ऐसे Lewy निकायों 32,33 साथ पागलपन के लिए और एक के लिए चित्रा 3 में वर्णित 31, oligomerization और गिरावट रास्ते के साथ और बाद translational संशोधन के बिना overexpressed प्रोटीन के लिए के रूप में प्रोटीन लक्षण वर्णन पूरा करने के लिए उपयोग मिनी 2DE, ई. रोगी. जानकारी का एक और उदाहरण एम द्वारा प्रदान की पहल 2DE टीकाकरण दृष्टिकोण 34 के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में गैर बावला और ई. मामलों में प्रदर्शन बीटा amyloid प्रजातियों की ट्रंकेशन है. oligomers और इसके विभिन्न गिरावट की उपस्थिति भी एक छिटपुट या परिचित ई. रोगी के आधार पर चित्रा 3 बी में दिखाया गया है. अलग उपचार किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, छोटा 2DE दृष्टिकोण संभावनाओं की एक विस्तृत और व्यावहारिक खिड़की खोलता है. ई. के क्षेत्र में उदाहरण के लिए, फॉस्फेट inhibitors जोड़ा जा सकता है और ताउ phosphorylation में उनके प्रभाव को उजागर. इसके अलावा पीआई और छोटा रूपों का मेगावाट पहचान एंटीबॉडी का मिलान 34 के अनुसार दरार साइट प्रदान कर सकता है यह देखते हुए कि proteolysis रास्ते पर औषधीय दवाओं प्रभाव,. दिलचस्प है, हाल ही में डेटा मिनी 2DE माउस मॉडल में संज्ञानात्मक impairments के साथ जीवन शैली और दवा उपचार की एसोसिएशन, साथ ही एक नई ताऊ उत्परिवर्तन 35-37 के जैव रासायनिक प्रोफ़ाइल का उपयोग कर elucidated है.

ntent "> मानव या माउस उत्पत्ति के साथ ही पीछे मिनी 2DE का उपयोग कर मान्यता से प्राप्त मस्तिष्क के ऊतकों की 2 डी DIGE सक्रिय करने के एक विधि का विकास, नई औषधीय लक्ष्य और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए बायोमार्कर को उजागर करने में प्रकाश डाला सकता है. इन विकारों के मस्तिष्क में अपने मूल तथ्य यह है कि, हालांकि, मानव नमूनों सीमित कर रहे हैं. एक आदर्श जानकारी के स्रोत के रूप में इस अंग का अध्ययन करने के लिए मजबूर करना, ताकि पशु मॉडल का उपयोग इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए अपरिहार्य हो जाता है. इस के साथ साथ में दृष्टिकोण का उपयोग करने का महत्व नमूने के दोनों प्रकार के लिए समानांतर और परिणामों को मान्य. यह अंत में निकट भविष्य में विश्वसनीय उम्मीदवारों मिल जाएगा और ऐसे प्लाज्मा और मस्तिष्कमेरु द्रव के रूप में शारीरिक तरल पदार्थ में परीक्षण रोग प्रगति के शीघ्र निदान, मूल्यांकन स्थापित करने के लिए और वांछनीय है कि उपलब्ध प्रशंसनीय उपचार के मूल्यांकन.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम अपने suitab के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिएLe आवेदन. 2 डी DIGE के मामले में, नमूने परीक्षण गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण बिंदु है. इस परीक्षा में परमिट प्रोटीन प्रोटीन की वास्तविक राशि रूपरेखा और मान्य पता करने के लिए वर्षा के बाद 2 डी बफर में मौजूदा निकाल सकते हैं. सना हुआ प्रोफाइल्स हमें नमूने के बीच गुणवत्ता और एकरूपता के विषय में जानकारी दे. इसी तरह के पैटर्न के साथ केवल नमूने अन्यथा 2 डी DIGE गरीब धुंधला और प्रोटीन प्रोफाइल के गरीब संकल्प को जन्म दे सकती, 2 डी DIGE अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इन नमूनों के पैटर्न में अंतर माउस मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में मानव में आम हैं, कई असुविधाजनक 38,39 के साथ अनुसंधान के सौदे के लिए मानव मस्तिष्क के नमूने के बाद से. इसके अलावा, के कारण पोस्टमार्टम अंतराल के लिए प्रोटीन गिरावट की पहचान पहले से ही 2 डी DIGE 40,41 द्वारा सूचित किया गया है. जाती डाई लेबलिंग से पहले पीएच का सत्यापन, इस कदम. जाती डाई लेबलिंग सब पीछे प्रक्रिया ख़राब करना चाहिए और के रूप में एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन अंधेरे में किया जाना चाहिएप्रतिदीप्ति लेबलिंग को प्रभावित करने के लिए नहीं क्रम में जितना संभव हो सके. अंत में, polyacrylamide जैल electrophoretic प्रवास के दौरान अंतर - परिवर्तनशीलता को खत्म करने और पैटर्न ओवरलैप की सुविधा और पीछे विश्लेषण 42,43 करने के लिए, उन के बीच यथासंभव सजातीय होना चाहिए.

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Disclosures

लेखक घोषित करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

इस काम INSERM, लिले 2 विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, MEDIALZ, LABEX (उत्कृष्टता प्रयोगशाला, कार्यक्रम भविष्य के लिए निवेश करते हैं) और DISTALZ (अल्जाइमर रोग के लिए एक transdisciplinary दृष्टिकोण के लिए नई रणनीति का विकास). FJ.FG वर्तमान में ANR (फ्रेंच राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी / NeuroSplice डे ताउ 01 Projet ANR-2010-Blan-1114) की एक प्राप्तकर्ता फैलोशिप है, लेकिन इस काम JCCM (स्पेन) से अनुदान के समर्थन के तहत भी था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo GE Healtcare 25-8010-65
Immobiline DryStrip GE Healtcare Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X GE Healtcare Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1  GE Healtcare 551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l GE Healtcare 17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT GE Healtcare 28-9334-92 Plastic box to make the passive rehydration 
MILLEX GS Filter Millipore SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) Bio-Rad Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit GE Healtcare 11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System GE Healtcare 80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm  Gel Company P2D1.5

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तंत्रिका विज्ञान अंक 86 प्रोटिओमिक्स neurodegeneration 2DE मानव और चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों प्रतिदीप्ति immunoblotting. 2 डी DIGE (दो आयामी प्रतिदीप्ति अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन) मिनी 2DE (मिनी 2DE immunoblotting) IPG (Immobilized पीएच अनुपात में) आईईएफ (isoelectrofocusing) ई. (अल्जाइमर रोग )
आम सहमति मस्तिष्क व्युत्पन्न प्रोटीन, 2 डी DIGE और मिनी 2DE immunoblotting दोनों का उपयोग कर मानव और murine मस्तिष्क proteome के अध्ययन के लिए निकालना प्रोटोकॉल
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Fernandez-Gomez, F. J., Jumeau, F.,… More

Fernandez-Gomez, F. J., Jumeau, F., Derisbourg, M., Burnouf, S., Tran, H., Eddarkaoui, S., Obriot, H., Dutoit-Lefevre, V., Deramecourt, V., Mitchell, V., Lefranc, D., Hamdane, M., Blum, D., Buée, L., Buée-Scherrer, V., Sergeant, N. Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting. J. Vis. Exp. (86), e51339, doi:10.3791/51339 (2014).

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