Summary
İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.
Abstract
İki boyutlu jel elektroforezi (2DE) potansiyel olarak farklı fizyolojik veya patolojik durumlar ile ilgili proteomdaki değişiklikleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Temel olarak, bu teknik, SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile bir birinci aşamada, izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve ikinci olarak, moleküler ağırlıklarına göre dayanmaktadır. Bu raporda insan post-mortem ve fare beyin dokusu az miktarda için optimize edilmiş bir numune hazırlama protokolü tarif edilmiştir. Bu yöntem, hem iki boyutlu, floresan fark jel elektroforezi (2D-DIGE) ve mini 2DE immünoboyama gerçekleştirmenizi sağlar. Bu yaklaşımların kombinasyonu tek bir kütle spektrometresi algılama ile uyumluluk için kendi ifadesi sayesinde yeni proteinler ve / veya protein değişiklikleri bulmak için değil sadece sağlar, aynı zamanda işaretçileri doğrulama yeni bir fikir. Böylece, mini 2DE sonrası belirlemek ve doğrulamak için batı lekeleme izin birleştiğinde-Translasyonel modifikasyonlar, protein katabolizma ve farklı koşullar ve / veya tedaviler arasında niteliksel bir karşılaştırma sağlar. Burada, bu tür amiloid beta-peptidi ve alfa-sinüklein olarak AD ve Lewy vücut demans bulunan protein agrega bileşenlerinin çalışma için bir yöntem sağlar. Önerilen yöntem, böylece proteomun analizi için uyarlanabilir ve çözünmeyen proteinler, çok insan beyin dokusu ve farenin modelleri çıkarmak. Buna paralel olarak, nörodejeneratif hastalıklar gibi olası yeni biyolojik belirteç ve terapötik hedefler yer moleküler ve hücresel yollarının çalışması için yararlı bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Zihinsel ve nörolojik bozukluklar hastalık küresel yükünün% 13 temsil eden, patofizyolojik mekanizmaları, risk faktörleri ve prodromal biyomarkerler gibi yeni sorunlar 1 araştırılmalıdır. Bu amaç doğrultusunda, insan beyninin proteomiks çalışmalar fizyolojik hem de patolojik koşulları için değil, sadece hafıza, davranış, duygu ve örneğin nöronal plastisite gibi süreçlerde moleküler yolları ortaya çıkarmak için vazgeçilmez hale. Bu nedenle, hayvan modellerinin kullanımı ve daha özel olarak ise transgenik fareler, insan nörodejeneratif hastalıkların 2 etyolojisini taklit etmek mümkün olan geniş bir yelpazede getiriyor.
Proteomiks yaklaşımlar nörobilim alanında bu yeni perspektifler başarmak için günümüzde mevcuttur. İki boyutlu jel elektroforezi (2DE) Numunelerin geniş bir proteomesini karşılaştırma sağlayan bir kuvvetli ve muhtemelen basit bir yöntemdir. Ayrıca, aynı zamanda birbelirlemek amacıyla kompleks bir karışımdan bir proteini izole etmek ve ayrıca kütle spektrometresi ile analiz etmek için güçlü bir yöntem. (IEF) ile isoelectrofocusing izoelektrik noktası (pl) 'ye göre 1) protein ayırma: Bu teknik, esas olarak birbirini takip eden iki adımda oluşur. Daha özel olarak, bir elektrik potansiyeli arasındaki bir pH gradyanı Immobiline akrilamid şeritler arasında uygulanır ve daha sonra proteinler göç ve küresel net yük fonksiyonu olarak belirli bir pl odaklanacaktır. 2) Isoelectrically odaklı proteinler ilk yapısında, böylece proteinler SDS-PAGE ile 3 bunların görünür molekül ağırlığı (MW) bağlı olarak ayrılmış) denatüre edilmiş ve negatif sodyum dodesil sülfat (SDS ilavesiyle ücret. Bu iki farklı özellikler bize proteomun çalışmada daha ileri gitmek için bir çift değer mücadele verir. Bir yandan bu yaklaşım, minimal boyalar 2D-DIGE yöntemi kullanılarak, kantitatif analiz için imkanı sunar, ve diğer taraftan bir Nitelmini 2DE e analiz western blot bağlanmıştır.
2D-Dige ile kantitatif analiz protein ekspresyon tüm numune proteomun geçer bahşetmiştir. Kısaca, numuneler üç farklı dalga boylarında (mavi, yeşil ve kırmızı) de yayan üç siyaninler (Cy2, Cy3 ve Cy5) ile etiketli. N-hidroksi succinimidyl ester grubu içeren en az bir flor Bu boyalar, kovalent amid bağları 4 sonuçlanan protein lizinlerinin kalıntılarının ε-amino grubu ile reaksiyona girer. Lizin kalıntıları sadece% 1-3 arasında ve böylece protein başına birden fazla etiket ekleme ve büyük net ücret değişikliklerini 5, 6 önlenmesi etiketli. Cy3 ve Cy5 genellikle Cy2 karşılaştırma örneklerinin eşit oranda bir karışımı etiketler ise iki bağımsız örnekleri etiketlemek için kullanılır. İki ana avantajları, İşaretlenmiş örnekler karıştırılır ve IEF-PAGE ve SDS karşılaştırma jeller dolayı deneyler arasında en arası değişkenliği kaçınarak, her bir aşama için bir kerede bir jel içinde gerçekleştirilmektedir vardır. Ayrıca, protein 7 çevresinde 1 femtomole yüksek bir algılama eşiğini gösterir. Jeller taranır ve 2D yazılım Cy2, kütle spektrometrisi ile posterior tanımlanması için noktalar arasında istatistiksel farklılıklar tanımlamaya olanak sağlayan bir iç standart olarak hizmet 2B jel floresan görüntü karşılaştırır edilir. Dahili standart kullanarak 2B analiz yazılımı istatistiksel güvenliği 8 fazla% 95 örneği arasında fark% 10'dan daha az hızlı bir algılama sağlar.
Mini 2DE nitel analizi, protein karakterizasyonu için çok önemli bir adımdır. Prensibi daha önce pl ve MW ayrılması için anlatılan ile aynı olmakla birlikte, bu durumda, proteinlerin bir membran için küçük bir poliakrilamid jelinden aktarılır ve immunoblotting daha sonra gerçekleştirilir. Bir boyut jel elektroforezi bir ya da antikorun fonksiyonu informatio çeşitli protein epitoplar için protein ifadesindeki değişiklikler sağlarkenmini 2DE n iki ek parametreleri ile endows. İlk olarak, protein isovariants post-translasyonel modifikasyonlar yer alabilir belirten pl fonksiyonu olarak değişir. İkincisi, kütle spektrometresi kimlik makul zimogen ve proteinlerin katabolik ürünleri göstergesi olabilir. Bu nedenle, 2-dige ile gözlemlenen değişiklikler küresel proteom profilinde bir değişiklik altında yatan mekanizmaların gösterge muhtemeldir. Mini 2DE ile aynı proteini epitopiarı / s için çeşitli örnekler arasında İmmünoblotların Hizalanmalar asitliği az görülmüştür post-translasyon değişimleri içine ışık tutan bir değişiklik ya da değil monodimensional imünoblotlarını 9, 10 ile yansıtabilir. Ayrıca bu analiz metabolik kalıntılarının 11,12 pl ve MW bilgisi nedeniyle potansiyel yarılma bölgeleri hakkında bilgi verir.
Bu iki tekniğin kombinasyonu tamamlayıcı proteomiks analizini sağlar. Bir yandan, bir 2D-DIGE tipik değer elde edilirifade farklı polipeptidleri, tam bir izolasyon sağlar farklılıklar e. Bu farklılıklar, bir nokta ya da floresan jellerin analiz yazılımı, belirli bir tek yoğunluğunun artış / azalış görünümünü kayboluşu ya da esas olarak oluşur. Bununla birlikte, tek başlarına bu gözlemler gözlenen değişiklik doğasını açıklamak için olası değildir. En isovariant / izoformu seviyesindeki değişiklik: polipeptid izole edilmiş ve kütle spektrometresi ile tanımlanır kez Bu nedenlerle, mini 2DE kullanılmasıdır) tam olarak 1 onaylamak için izole proteinin kimliğini ve farkın 2) doğasını sağlar Örneğin ekspresyon, post-translasyonel modifikasyonlar ve bölünme işlemleri. Ancak, çok farklı olan ekstraksiyon protokollerin kullanımından kaynaklanan potansiyel dispersiyonlar sınırlamak amacıyla 2D-dige ve mini 2DE uyumlu hem de bir başlangıç lizis tamponu geliştirmek için gereklidir.
Bu yazıda, biz de2D-dige ve insan ve fare beyin dokusundan gelen proteinler için mini 2DE tekniklerinin hazırlanması, ekstre etme ve performans için uyarlanmış bir protokol açıklandığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Homojenizasyon İnsan ve Fare Beyin Dokusu Toplam Protein Ekstraksiyon
- Beyin dokusu homojen hale getirilmesi. Bir (insan örnekleri için) potter cam veya (farenin örnekleri için) teflon homojenleştirici kullanılarak beyin dokusu% 10 (w / v), 8 M üre içinde, 2 M tioüre ve a / h SDS tamponu (UTS)% 1 homojenize. 60 Hz toplam doku parçalanması 13, 14 için 0.5 saniye başvuran bir ultrason jeneratörü ile 30 darbeler sonikasyon.
- Standart olarak BSA kullanılarak Bradford tayini ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Bu tampon çıkarma sürece lisatları Karbamilleme 15 önlemek için ısıtılmış fazla değil gibi bir boyut SDS-PAGE ile tamamen uyumludur UTS.
- % 1 ekleme (ağ / hac) Amberlite ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe karıştırılarak inkübe edilir. Daha sonra 0.22 um şırınga filtreleri üzerinde filtre edilir ve son olarak, üre / tiyoüre çözeltisine SDS ekleyin. Bu adım equilibr olan ürik asit ve izosiyanik asit miktarını azaltırçözelti içinde üre ile birlikte amonyum ve bozulma kolaylaştırır.
- Kloroform / metanol protein çökeltme. (Bağımsız bir şekilde, IEF gerçekleştirmek için seçilen pH aralığında) 18 cm olanlar için 11 cm IPG pervazlar ve 1-1.5 mg protein 100-150 ug arasında çöktürün.
- Buz üzerinde veya 4 ° C'de tüm adımları uygulayın Çökeltme işlemi başlamadan önce 30 dakika boyunca 4 ° C'de serin, kloroform ve metanol.
- UTS lizatının bir hacim metanol üç hacim ve kloroform arasında bir hacim. Elle karışım çalkalanır ve soğuk su, üç hacim ekleyin. 1 dakika boyunca, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj ile pelet proteinleri Vortex
- Pasteur pipet kullanarak süpernatant atın ve soğuk MeOH üç birimler eklemek. Daha vorteksleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 xg'de santrifüj Nihayet supernatant atmak ve N2 altında pelet kurulayın.
- 2D protein analizi için hazırlanması.2D-tamponu içinde protein kurutulmuş pelet (8 M üre,% 4 CHAPS ile takviye edilmiş 2 M tiyoüre) yeniden süspanse edin. Yukarıda belirtildiği gibi Amberiite ile çözüm yıkayın ve 2D-DIGE için 2D tampon 200 ul başına protein 500 ug oranını tutmaya çalışın. Not: 2D tampon -80 ° C'de saklandı veya (üre bozulmasını önlemek için), bir hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Sonikasyon ve aşağıdaki adımı gerçekleştirilmesi kadar -80 ° C'de örnekleri saklayın. Protein formik asit çözündürme 10 agrega sonra kayda değer, bu protokol kullanılabilir. Kısaca, N2 altında formik asit buharlaşır ve tarif edildiği gibi pelletini.
2.. 2D-DIGE
- Numuneler kalitesini test. Yine Doz örnekleri Bradford yöntemi kullanılarak. LDS numune tamponu, ısı 37 ° C de 15 protein 15 ug seyreltilmiş ve% 4-12 poliakrilamid jellerin üzerine yerleştirin.
- Coomassie boyaması. % 0.1 poliakrilamid jel Leke (ağ / hac) CoomassieMavi G-250,% 50 EtOH ve% 10, en az 1 saat boyunca (v / v) asetik asit çözeltisi. Arka plan% 7 asetik asit ve% 10 (v / v) etanol çözeltisi gece boyunca destain olsun.
- Numunelerin ön-elektroforetik etiketleme. Önceki siyanin boyası etiketleme gerçekleştirmeden, N-hidroksisüksinimid, ikame bir baz pH değerinde daha etkilidir ve pH 8.6 de uygun olduğu verilen Başlangıcı bazik ya da nötr olmalıdır, numunenin pH kanıtlamıştır.
- 50 ug protein/400 pmol boya bir oranı ile, Cy3 veya Cy5 floresan boyalar ile birlikte çalışma minimal iki numune etiketleyin ve protonlanmamış amin ile siyaninler NHS ester reaktif bir grup kolaylaştırmak için karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca devam lisin grupları.
- Belirli cyanine için, bir numunenin bir tercihli bağlanmasını önlemek, Cy3 ve Cy5 boyalarla enine etiketleme yapmak örnek varyasyonu azaltır. Siyanin boyası-minimal etiketleme pr 1 ug oranını tutulması ile proteinlerin küçük bir miktar için adapte edilebilir unutmayın8 pmol cyanine-boya başına otein. Eğer öyleyse, mini 2DE sistemi, bunun yerine büyük bir 2 boyutlu jel sistemi kullanılabilir. Bu beyin dokusunun küçük bir miktar için 2D-DIGE analizini sağlayacaktır.
- Cy2'nin floresan boya ile protein aynı miktarda (toplam 50 ug), her iki numune, bir havuz etiketleyin ve iç standart olarak kullanılmıştır. Daha önce belirtildiği gibi aynı koşullar kullanın.
- % 1.1 Destreak reaktifi, IPG tamponu ve% 1.2 bromofenol mavisi etiketli proteinler, toplam 150 mg (Cy2, 50 ug, Cy2, Cy3, 50 ug ve 50 ug) izleri ihtiva eden 2D tamponu ile toplam hacmi 350 ul komple. Dört bağımsız şeritleri kullanarak dört nüsha olarak bu adımı gerçekleştirin. Ayrıca, hazırlayıcı jeller için protein 350-450 ug ile iki etiketli olmayan şeritler (her bir numune için bir adet) hazırlar.
- Pasif rehidrasyonu için mineral yağ ile kaplanmış bir gece boyunca altı yüklenen şeritler bırakın.
- Isoelectrofocusing. 20'de IEF yürütmek6; C. PH 3-11NL için, 18 cm protokolü şerit olduğunu: maksimum akım ayarı 8 aşamalarında 50 uA / şerit: 1) 150 V 1 saat için adım 2) 200 V 5 saat, 3) 500 V gradyan adım için 2 saat, 2 saat için 4) 1.000 V gradyan, 5) 2000 V 2 saat boyunca eğimli, 6), 4,000 V 2 saat boyunca gradyan, 7) 8.000 V ve 2 saat 8) 24.000 V bir toplam için degrade · hr adım . IEF sonra kromatografi kağıdı kullanarak mineral yağın aşırı sevk ve ikinci boyut kadar -20 ° C 'de şeritler saklayın.
- IPG dengelenmesini Şeritleri. Aynı tampon içerisinde iyodoasetamit% 4.7 ile değil DTT olmadan 6 M üre,% 2 SDS,% 30 gliserol, 50 mM Tris-HCl, pH 15 dakika boyunca DTT% 1 ile 8.6 tamponu içinde ve sonra şeritler dengelenmesi.
- İkinci boyut veya SDS-PAGE elektroforez. Altı 12% SDS-PAGE jelleri (1.5 M Tris-HCl pH 8.6,% 12 akrilamid / bisakrilamid,% 0.1 (ağ / hac) SDS,% 0.072 (ağ / h) APS ve% 0.1 (v / v) Yap TEMED ) stri için dört düşük floresan cam plakalar ile, büyük bir 2D sistemini kullanarak aynı andaprotein noktalar tüketim için hazırlayıcı jeller için kalınlığı 1.5 mm ile floresan örnekleri ve diğer iki cam plakalar ile ps.
- (Ağırlık / hacim)% 0.5 agaroz ile jeller üzerinde ve tabakalı fazla altı IPG Şeritler yerleştirin. Çalıştırma tamponu 25 mM Tris, 192 mM glisin ve% 0.1 (ağ / hac) SDS oluşmaktadır. 4 ° C 16,17 ayarlanmış bir soğutma sistemi ile bir gecede 2,5 W / jel 'de göç yürütmek.
- Floresan görüntüleri toplama ve analizi. Floresan jeller görüntüleri (bir deney için 12 fotoğraf) elde etmek için bir Typhoon 9400 tarayıcı kullanın. Tarama Cy2'nin, 488/520 nm, 532/580 nm ve 630/670 nm uyarma / emisyon dalga boylarında, sırasıyla her jel için Cy3 ve Cy5 görüntüler. Görüntüleri analiz etmek bilişim yazılımı kullanın. Veriler, incelenen iki örnekleri arasında dört jeller üzerinde sinyalinin dağıtımı ile ilişkili bir yer hacim değişiklikleri temsil etmektedir.
- Büyük jeller için Coomassie boyaması. 5 olarak hazırlayıcı jeller saptamak0% (v / v) EtOH ve% 3, en az 24 saat boyunca (hacim / hacim) orto-fosforik asit çözeltisi. Daha sonra, 20 dakika için ultra saf su ile iki kere yıkayın. % 34 bir renk gerçekleştir (v / v) MeOH,% 17 (a / h) amonyum sülfat ve (ağ / hac) Coomassie Blue G-250,% 0.1 ilave edilmeden önce 1 saat boyunca% 2 ortofosforik asit. En az 48 saat ve ultra saf su içinde rengi giderildi için renk olarak jeller tutun.
- MS tanımlanması için noktalar. Floresan görüntüleri analiz edildikten sonra, yazılım ifadesi istatistiksel olarak farklı noktalar bir listesini sağlar. Elle hazırlayıcı jellerin bu noktalar tüketim. Bu prosedür keratin kirlenmeyi önlemek için pratik ve bazı el becerisi gerektirir. Daha sonra örnekler MS kalma kadar -20 ° C sıcaklıkta su içinde tutulabilir. Nokta tanımlama Tandem kütle spektrometresi (MS / MS) ve protein kimliklerin alaka ile mükemmel uyumlu olasılık 0.05 (p <0.05) 18 p-değeri ile hesaplanan tabanlı Mowse skor göre değerlendirilir. </ Ol>
3.. Nitel Mini-2DE Deneyi
- 2D protein numune tamponu içinde en fazla 100 ug yeniden süspanse edin, bir 11 cm IPG şerit için 200 ul bir son hacme kadar. Aşın sistem veya saflaştırılmış proteinin durumunda, başlangıç miktarı 20 ug için düşürülebilir.
- 200 ul son hacim olması için (v / v) Destreak Reagent,% 0.55 (v / v) ve IPG tamponu Bromofenol Mavisi izleri% 1.1 ekleyin. Daha sonra, girdap, hızlı döndüğü ve gece boyunca, mineral yağ ile kaplanmış (orijinal kalınlığının için şerit getirmek) için bir pasif rehidrasyon IPG şerit içine yükleyin. Not: IPG tamponu pH oranı istenen (pH 3-11, 4-7, 7-11, vb) her aralık için aynıdır, ancak bileşim, seçilen pH aralığının fonksiyonu olarak değişir.
- Isoelectrofocalisation. 20 ° C'de IEF yapın Programının süresi seçilen pH aralığına bağlıdır. Dikkate değer, bu tür electroendosmosis İEF profilini rahatsız olabilir ve bu durumlarda parametreler,electrofocalisation zamanında optimizasyonu 19 gereklidir. Not: Mutlaka daha iyi sonuç verir ama IEF'nin süresini kısaltarak da çözünürlüğünü artırabilir uzun bir İEF değildir. IEF sonra IPG şeritler ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
- IPG dengelenmesini şeritler. 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 20 mM DTT,% 10 gliserol,% 5 SDS,% 0.05 bromofenol mavisi ihtiva eden bir tampon içinde şeritler dengelenmesi. Üç dengeleme her banyosu arasındaki tampon çözeltisi değiştirme ile, 15 dakika boyunca banyoları yapın.
- SDS-PAGE. Ilgilenilen proteinin MW bağlı olarak seçilir poliakrilamid bir yüzdesi olan bir prekast jel (IPG 1 de, 11 cm IPG şerit) üzerine IPG şeridi Katman. Daha sonra, 33 dakika boyunca 100 mV'de bir nitroselüloz / PVDF zarı üzerine jel leke.
- Gerekli antikor ile bir gece boyunca inkübe edin ve peroksidaz aktivitesi ile görselleştirmek. Ikincil antikor ile açığa olmayan polipeptidler kullanılarak İmmünoblotların hizalamalarını yapın. Yarı quantit ulaşmakImageJ yazılım ile izleri / noktalar için hacim ve yoğunluk dansitometreyle analizini Ative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İdeal bir tampon proteinlerin% 100, özellikle membran-ilişkili veya hücre iskeleti proteinleri kurtarmak için var yana beyin dokusu üzerine Proteomiks zorlu kalır. Deneylerin ilk seti proteinin büyük bir panel kurtarmak sağlayan iki yaklaşım ile uyumlu uygun bir parçalama tamponu için arama üzerinde duruldu. Böylece, üç lizis tampon, en uygun olanı belirlemek için analiz edilmiştir. İlk olarak,% 1 ile 10 mM (w / v) SDS (Şekil 1A), ortak biyokimyasal ve moleküler biyoloji tampon Tris-HCl 20 kullanılmıştır. Ayrıca, Tris-HCl poliakrilamid ve agaroz jeli elektroforezi için bir tampon olarak güçlü bir uygulaması vardır. Diğer iki liziz tamponları UTS (Şekil 1 B) ve 2DE bir edildi. Tris-SDS kötü çözünürlük verim ve lekelerin sayısının oldukça yüksek nokta ayırma, hiçbir distorsion ve bir fa UTS, gözlemlenen profili ile karşılaştırıldığında (Şekil 1B) indirdi edildir daha proteinlerinin geri kazanılması (Şekil 1 B) gözlenmiştir. Bu nokta, Tris-HCl tezgah santrifüj işleminden sonra kalın bir UTS çıkarma verimi hemen hemen hiçbir kalıntı pelet, borçlu ise gerçeği ile desteklenir. Deseni Şekil 1B 'de açık bir şekilde gösterdi gibi Tris-HCI gibi başka tamponlar ile ilgili UTS en yüksek protein çözünürlüğünün kanıt sağlar. Hatta 2DE tampon ayrıca test edildi Notheworthy, kullanımı pelet rağmen yana ekarte edildi ne gözlendi lipidler çözülmüş değil ve onlar manipülasyon difficulting üst tabakada kalmıştır. Bu veriler ile uyumlu olarak, bu amino asit kalıntıları arasındaki nonconvalent ve iyonik bağı bozan ve 21 2) ek olarak hücresel proteinleri indirgeme proteazların aktivitesini önlemek proteinleri denatüre 1) nötr kaotrop çeşitli nedenlerle UTS tamponu kullanılması tavsiye edilir Üre çözeltisine, tiyoüre büyük ölçüde hidrofobik zar proteinlerinin çözünürlüğünü artırırve toplam 22, 23 meyilli ve 3) anyonik deterjan SDS içinde adjunction lipidler keser proteinlerin hidrofobik etkileşimi yolu ile bağlanan proteinlerin yanı sıra, proteaz ve fosfataz aktivitesi inhibisyonu 24,25 artırır. Dahası IEF bozabilir impureties ortadan kaldırmak için bir çökeltme adımı eklemek karar verildi. Bu şekilde, çöktürme yöntemi olarak 26 ve daha önce metanol beyin dokusunda bol miktarda bulunan lipidlerin kaldırmak için en uygun olan bir çözücü olarak tanımlanmıştır proteinlerinin çözünürlüğünü belirler, bu, kloroform / metanol çökeltme 27 tercih getirdiler. Zitteriyonik deterjan CHAPS (3 - [(3-kolamidopropil)-dimetilamonyo]-1-propan sülfonat) 'in kullanımı proteinlerini yeniden süspanse için 2B tampon maddesi içinde boyut pelet ilk adım 28' de protein girişini kolaylaştırmak için uygunluğu kaynaklanmaktadır.
Insan ve farelerde beyin pr profili2D-dige ile oteome sırasıyla Şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir. Şekil 2A insan kumandadan gelen floresan görüntü birleştirilmiş ve AD korteks örnekleri, AD-benzeri patolojinin Tau 29 bir modelinin hipokampusdan farenin örnekler için Şekil 2B'de idem olarak, gözlemlenebilir. Cy2, Cy3 ve Cy5 sırasıyla Şekiller insan örnekleri 2C-2E için gösterilmiştir. İkisi birleşti desenleri (Şekil 2A ve 2B) yüksek kaliteli IEF ve Şekil 1B gözlenen profili ile anlaşarak ikinci boyut ayırma yansıtan yüksek nokta çözünürlük sunuyoruz. Birlikte çapraz bağlanma analizi programı boyunca hizalamak için, bu floresans görüntüleri (Şekiller 2C-2E) çok kolay yapmak, belirli bir cyanine için proteinlerin olası tercih ortadan kaldırmak amacıyla gerçekleştirilir gerçeği ile bu nokta tanımlama kalitesi. Ayrıca, hazırlayıcı jeller Co mavi ile boyanmıştıromassie kanıtlar bir yazılım analizinden sonra ve MS / MS ile posterior kimlik noktalar tüketim sağlayan tüm kullanılan pH aralığında bol noktalar ile zenginleştirilmiş bir protein haritası.
Bir protein için immünolojik işaretleme ile kalitatif Mini 2DE analiz translasyon sonrası olanlar için değil, aynı zamanda oligomerler ve kesikler için (Şekiller 3A ve 3B), sadece kendi tanımlama ve değişiklikler için yüksek değerli bilgiler sağlar. Mini 2DE Bu teknik fizibilite gerçekleştirmek için ilgilenilen protein ile ilgili hızlı ve hassas verileri sağlar. Lewy Body Dementia (LBD) etkilenen bir hastadan bir doku ile ilgili olarak, alfa-sinüklein yine karakterizasyonu ile, doğal protein 4,67 arasında bir pl olduğu ve 18 kDa'lık bir MW burada, iyi tanımlanmış bir 4-7 pH profilini görüntülenmesine olanak tanımaktadır mini 2DE bundan başka, doğal formları ile aynı pl de dimerler (Şekil 3A, yıldız) varlığını değil, aynı zamanda Ubiq varlığını görülebilirOnlar (Şekil 3A, oklar) olduğunda daha ubikitinlenmiş daha temel ve daha yüksek MW ile vardır uitinated formlar. MS yakından bağlantılı bir başka protein amiloid öncü proteinin (APP) ve karmaşık katabolizması tarafından oluşturulan amiloit-beta peptid vardır. Şekil 3B bir ailesel biriyle sporadik AD davanın arsa karşılaştırılır. Tanıdık AD durumda amiloid-beta 1-42 sporadik AD saygı azaltılır nasıl gözlenebilir, ve dahası, isovariants amiloid beta-x-42 (4 kDa), aynı zamanda tüm boşluğu boyunca aşağı-düzenlenmiş , bu arada 8 kDa bulunan noktalar yoğunluk oligomerler bilinen AD (Şekil 3B) daha uygun olduğu için, bu durum, daha düşük bir protein miktarı nedeniyle olmadığını yansıtmaktadır.
Şekil 1: 2DE prckutuk 10 mM Tris,% 1 SDS ağırlık / hacim ekstraksiyon tamponu (A) ve UTS kullanımı (B) 'den sonra elde edilen model. sonra, panel B ise bu noktalar, yoğunluğu ve çözünürlüğü sayısının olandan çok daha yüksektir kadar görülebilir Panelin (A). UTS kullanımı, 2DE Koomassie boyama yansıyan neredeyse toplam protein çıkarma sağlar. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan (A) ve fareler (B) için 2D-DIGE profilleri gösterilmektedir Görüntü (A) ve (B) 18 cm şeridin bir 3-11 pH aralığı içinde üç siyaninler için birleştirilmiş görüntüleri temsil eder.. Resimlerin (C), (D) içinde ve (<strong> E) siyaninler kırmızı (mavi Cy2, yeşil Cy3 ve Cy5) bağımsız maruz kalmaktadır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3:. Üst panelinde bu yerel PI (4,4), bir LBD hastada protein alfa sinüklein mini 2DE profili görülmektedir edilebilir ve dimerizasyonu (yıldız) bir fonksiyonu olarak MW (18 kDa) bir değişiklik burada MW daha temel bir (oklar) (A) kadar pl'ya kaydırır, çift ve ubikuitinasyon olduğunu. Aşağı resim AD sporadik ve genetik durumda bir amiloid beta peptid antikorun profilini ortaya koymaktadır. 2DE desen Oligomerizasyon ve bozulma dise etiyolojisinde göre farklı bir şekilde gerçekleşecek nasıl gösterirase. Bu immünoblot açıkça iki durum arasındaki APP katabolizmasında farklılıkları işaret. Oligomerler daha az (B) işaretlenmesi gibi iken bir yandan ailesel bir (oklar) ile ilgili sporadik AD içindeki katabolik ürünlerde bir artış vardır. Bu deneyler sırasıyla% 12 Bis-Tris jel 4-7 pH boşluğu ve% 16.5 Tris-Trişin birinde 11 cm şeritler halinde yapılmıştır (A, B). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinlerinin patolojik ifadesi değişiklikleri keşfetmek, biyomarkerler için arama ve farmakolojik hedefler için potansiyel yolların modülasyon neuroproteomics amaçları arasındadır 30 yaklaşır. Gelişmekte olan araçları ortasında, 2DE alan bir gelecek vaat expectative ekler. Bununla birlikte, bir konsensüs değişkenliği en aza indirmek ve deneylerde tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla ulaşılmalıdır. Bu fikrin doğrultusunda 2D-dige (Şekil 2) ve mono-boyutlu immunoblotting ile tam uyumlu insan ve fare beyin dokusu için sonraki 2DE immunoblotting (Şekil 3) gerçekleştirmek için standart bir protokol, burada detaylı bir şekilde tarif edilmektedir.
Proteomikteki büyük çıkmazlarından biri çözünürleşme tampon seçimdir. Bu IEF'nin ile tamamen uyumlu olduğundan farklı yaklaşımlar arasında tekrar elde edilebilirliğini arttırmak amacıyla, UTS seçildi. Ayrıca, UTS ekstraksiyon tamponu no Pelle verimlerit veya 12.000 x g'de santrifüj sonra gerçekten hafif bir (4 ° C'de SDS yağış ile karıştırmayın). Bu hesaba çok önemli bir nokta alarak olduğunu MS dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıklar mevcut proteinler toplama,. Bağımsız bir çalışma çözünür ve çözünür olmayan kısmıyla yapılmalıdır yana bir topak olduğu gerçeği, performansı ve veri yorumlama kolaylaştırır.
2D-DIGE veya mini-2D yaklaşımlar gerçekleştirilebilir olacak olursa olsun, belirtilmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. Öncelikle UTS tampon kimyasal özellikleri, bu çözüm ısınmış olmamalıdır, ya da Karbamilleme birincil aminler oluşur ve bu nedenle IEF 15 bozarak noktalar çözünürlüğü kötüleşmesi, siyanin boyası kavrama ve 2D profili hem de engelleyebilir. İkincisi, mevcut pH aralıkları, günümüzde geniş pH aralığı 3-11 arasında olduğunu, bu faktör IPG şerit üzerine tüm proteinler giriş Expl olabilir değil olasılığına katıldıboyama sonra jeller iki tarafında da istiflenmiş protein bantları değilim. Bütün proteom 2D tarafından ele alınabilir neden bu sınırlama açıklamak olabilir. Bir diğer önemli sınırlama yağış tartışma kullanılmasıdır. Bir yandan, verimli lipid içeriği 27 azaltmak sağlar kloroform / metanol ile yağış adımı yapmak için son derece tavsiye, tuzlar, nükleik asitler ve İEF parametreleri ile müdahale ve çözünürlük ve / veya uyarlık etkileyebilir tahsil deterjanlar 2D. Ayrıca, diğer taraftan kuvvetli bir zara bağlı bazı proteinler kaybolabilir olduğu göz ardı edilemez. Bununla birlikte, diğer ekstre etme tampon yerine UTS, iki ya da proteaz inhibitörlerinin fosfatazlar ya da ilavesi olmadan kullanıldığı durumda, çöktürme aşamasının kullanılması son derece IEF sırasında herhangi bir tuzaklar önerilir. Son olarak, 2D-DIGE görüntüleri analiz floresan çakışan rahatsızlık sunar dikkat çekicidiryazılım analizi, önemli bir değişiklik gibi bu dikkate almaz beri noktalar, bir bilgi kaybına neden olabilir.
Bu kombine yöntemin yenilik onların tekrarlanabilirliği, çok yönlülük ve proteinlerin karakterizasyonu yatıyor. Sadece bir ekstraksiyon tampon bir iki bütünleyici teknikleri gerçekleştirmek için olanak sağlar. 2D-DIGE proteinler ifade değişiklikler ve MS / MS ile bunların sonraki kimlik hakkında kantitatif bilgi sağlar. Ancak, izoformları, isovariants, zimogenlerinin, translasyon sonrası modifikasyonlar ve katabolik ürünleri diğer proteinler ile çakışan floresan beri tespit edilememiştir ki mümkündür. Bu sınırlamayı aşmak için bu mini 2DE paralel kullanımı önerilmiştir. Aslında, bizim bilgi taahhüt edilebilir en önemli sıkan biri 2D-DIGE sonuç tam bir doğrulama olarak mono-boyutlu immünoboyama almak için, hatta herhangi bir proteomiks değişiklik doğrulamak için gerekli olmadığını ele almaktır. Furthermore, mini 2DE teknik avantajları 1) küçük SDS-PAGE sistemleri, 2) göreceli olarak düşük malzeme gerekli, pH 3) geniş aralıkları mevcuttur, 4) immünoblot duyarlılık ve 5) kolay tahmin kullanarak fizibilite değişir. Mini 2DE tekniğinin fussiest yönleri, sayısallaştırılmasıdır mini 2DE rağmen bu şekilde güvenilir bir mobilya, lekeler veya araziler uyum sonra asidik ve bazik kısmen veya tersi arasında bir oran kurmak mümkündür, nicel bir yaklaşım olarak kabul edilemez Değişikliklerin tahmin 9 görülmektedir.
Literatürde çeşitli verilerin doğru, Lewy cisimcikli 32,33 demans ve bir için, Şekil 3A'da anlatılan 31, oligomerizasyon ve bozulma yolları ile birlikte ve post-translasyonel modifikasyon olmadan aşın protein gibi protein karakterizasyonu gerçekleştirmek için kullanım mini 2DE, AD hasta. Bilgilerin başka bir örneği m sağladığı ini 2DE aşılama yaklaşımı 34 için potansiyel bir hedef olarak non-kaçık ve AD olguda beta amiloid türlerin kesme olan. Oligomerler ve farklı olarak bozulma mevcudiyeti, aynı zamanda, bir ya da tanıdık sporadik AD hastaya bağlı olarak Şekil 3B'de gösterilmektedir. Farklı tedaviler yapılabilir beri yanı sıra mini 2DE yaklaşım olanakları geniş ve pratik bir pencere açar. MS alanında Örneğin, fosfataz önleyicileri ilave edilebilir ve Tau fosforilasyonundaki etkilerini ortaya çıkarmak. Ayrıca, pl ve kesilmiş formları MW kimlik antikorun epitopa 34'e göre yarılma sitesi sağlayabilir verilen proteoliz yolları ile ilgili farmakolojik ilaçların etkisi. İlginçtir, son veriler mini 2de fare modellerinde bilişsel bozuklukları olan yaşam tarzı ve ilaç tedavilerinin dernek, yanı sıra yeni Tau mutasyon 35-37 biyokimyasal profili kullanarak aydınlatmıştır.
ntent "> insan ya da fare kökenli yanı sıra arkasında mini 2DE kullanarak doğrulama temin beyin dokusunun 2D-DIGE sağlayan bir yöntem geliştirilmesi, yeni farmakolojik hedefler ve nörolojik hastalıkların çalışma için belirteçler ortaya çıkarılması içine ışık tutabilir. Bu bozukluklar beyin kökenlerine sahip olması, Ancak, insan örnekleri sınırlıdır. ideal bir bilgi kaynağı olarak bu organı çalışmaya mecbur, böylece hayvan modellerinin kullanımı bu hedefe ulaşmak için vazgeçilmez olur. BURADA yaklaşımlarını kullanmanın önemini Numunelerin her iki tip için paralel ve sonuçları doğrulamak. Sonunda yakın gelecekte güvenilir aday bulunabilir ve bu plazma ve beyin omurilik sıvısı olarak fiziksel sıvılarında test hastalığın ilerlemesi bir erken tespit, değerlendirme kurmak için ve arzu edilen bir durumdur mevcut makul tedavilerin değerlendirilmesi.Protokolü içerisindeki kritik adımları kendi suitab dikkate alınmalıdırle uygulama. 2D-Dige durumunda, numuneler test kalite çok önemli bir noktadır. Bu test izin proteinler proteinlerin gerçek miktarını profili ve doğrulamak bilmek yağış sonrası 2B tampon mevcut ayıklamak. Lekeli profiller bize numuneler arasındaki kalite ve homojenliği hakkında bilgi verir. Benzer desenleri ile sadece numuneler aksi 2D-DIGE fakir boyama ve protein profili kötü çözülmesine yol açabilir, 2D-DIGE çalışmaları için kullanılmalıdır. Bu örnekler desenleri farklılıkları fare beyin dokusunda daha insan daha sık görülür, birçok uygunsuz 38,39 ile araştırma anlaşma için, insan beyni örneklerinden beri. Buna ek olarak, bağlı ölüm sonrası aralığına protein degradasyon kimlik önceden 2D-dige 40,41 tarafından bildirilmiştir. Siyanin boya etiketleme önce pH doğrulanması, bu adım. Siyanin boya etiketleme tüm posterior prosedür bozabilir olmalı ve SDS-PAGE elektroforez karanlıkta yapılmalıdırfloresan etiketleme etki sırasına göre değil mümkün olduğunca. Son olarak, poliakrilamid jel elektroforetik göç sırasında arası değişkenliği ortadan kaldırmak için ve kalıplar üst üste kolaylaştırmak ve posterior 42,43 analiz etmek için, aralarında mümkün olduğunca homojen olması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışma INSERM, Lille 2 Üniversitesi tarafından desteklenen, MEDIALZ, LabEx (mükemmellik laboratuvar program geleceğe yatırım) ve DISTALZ (Alzheimer hastalığı için bir Transdisipliner yaklaşım Yenilikçi Stratejilerinin Geliştirilmesi). FJ.FG anda ANR (Fransız Ulusal Araştırma Ajansı / NeuroSplice de Tau 01 Projet Deurne-2010-BLAN-1114) bir alıcı dostluk olduğunu, ancak bu çalışma JCCM (İspanya) bir hibe desteği altında da oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
