Summary
인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.
Abstract
이차원 전기 영동 (2DE)는 잠재적으로 다른 생리적 또는 병리 적 조건과 관련 프로테옴 수정 사항을 발견 할 수있는 강력한 도구입니다. 기본적으로,이 기술은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 제 1 단계에서 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 둘째 그 분자량에 따른에 기초한다. 이 보고서에서 인간의 사후와 마우스 뇌 조직의 작은 금액에 대한 최적화 된 샘플 준비 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 개의 차원 형광 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE) 미니 2DE의 면역 블롯을 수행 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식의 조합은 하나의 질량 분석 검출과의 호환성 발현 덕분에 새로운 단백질 및 / 또는 단백질의 변형을 찾을뿐만 아니라 수 있지만, 또한 마커 검증에 새로운 통찰력. 따라서, 미니 2DE은 포스트를 확인하고 검증하기 위해 서부 블로 팅 허가에 결합번역 후 수정, 단백질 이화 작용과 다른 조건 및 / 또는 치료 사이에 질적 인 비교를 제공합니다. 여기서, 우리는 아밀로이드 - 베타 펩티드와 알파 synuclein으로 AD와의 Lewy 몸 치매에있는 단백질 집합체의 구성 요소를 공부하는 방법을 제공한다. 우리의 방법은 이와 같이 프로테옴의 분석을 위해 적응 될 수 불용성 단백질은 인간의 뇌 조직 및 마우스 모델에서 추출한다. 병렬에서는 퇴행성 신경 질환뿐만 아니라 잠재적 인 새로운 바이오 마커 및 치료 표적에 관련된 분자 및 세포 경로의 연구를위한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.
Introduction
정신 및 신경 장애는 질병의 글로벌 부담의 13 %를 나타냅니다, 병태 생리 학적 메커니즘, 위험 요소 및 구성 (prodromal) 바이오 마커와 같은 새로운 도전 1 탐구해야합니다. 이 목적에 부합하는, 인간의 뇌의 단백질 체학 연구는 생리에 대한뿐만 아니라 병적 인 조건뿐만 아니라 메모리, 행동, 감정과 예를 들어 신경 세포의 가소성, 같은 프로세스에 관련된 분자 경로를 발견하기 위해 필수가됩니다. 따라서, 동물 모델의 사용 및보다 구체적으로 형질 전환 마우스는 인간의 신경 퇴행성 질환의 병인이 모방하는 광범위한 가능성을 가져온다.
프로테오믹스 방법은 신경 과학 분야에서 이러한 새로운 관점을 달성하기 위해 요즘 사용할 수 있습니다. 이차원 전기 영동 (2DE)는 시료의 넓은 범위의 프로테옴을 비교할 수 유력한 것으로 간단한 방법이다. 또한,도식별하기 위해 복잡한 혼합물로부터 단백질을 분리하고 추가로 질량 분석법에 의해 분석하기위한 강력한 방법. (IEF)을 isoelectrofocusing하여 자신의 등전점 (PI)에 따라 1) 단백질의 분리 :이 기술은 기본적으로 두 개의 연속적인 단계로 구성되어 있습니다. 보다 정확하게는, 전위의 pH 구배 구비 immobiline 아크릴 아미드 스트립을 가로 질러인가 된 후 단백질은 이주 및 글로벌 넷 충전 기능 판정의 pI에 초점을 맞출 것이다. 2) Isoelectrically 집중된 단백질은 첫 구조하여 단백질이 SDS-PAGE (3)에 의해 그들의 겉보기 분자량 (MW)에 따라 구분되며) 변성하고 부정적인 도데 실 황산나트륨 (SDS의 첨가에 의해 부과. 이 두 가지 속성은 우리가 프로테옴의 연구에 더 갈 수있는 두 값을 해결 할 수 있습니다. 한편이 방법은 최소한의 염료 2D-DIGE 방법을 사용하여 정량 분석을 수행 할 수있는 가능성을 제공하고, 반면에 qualitativ미니 2DE에 의해 전자의 분석은 웨스턴 블로 팅에 결합.
2D-DIGE에 의한 정량 분석 단백질 발현은 모든 샘플의 프로테옴에 변경 수여한다. 간단히 샘플은 세 개의 서로 다른 파장 (블루, 그린, 레드)에 발광 세 시아닌 (CY2,를 Cy3와 Cy5에)로 표시되어 있습니다. N-히드 록시 숙신 이미 딜 에스테르기를 함유 한 불소 최소한 염료는 공유 결합, 아미드 결합 소재 얻어진 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노 그룹과 반응한다. 리신 잔류 물은 1 ~ 3 % 사이 따라서 단백질에 여러 라벨 또한 주요 그물 충전 수정 5, 6을 방지 표시되어 있습니다. 를 Cy3와 Cy5에 자주 CY2 비교할 샘플의 동일한 비율의 혼합에 태그를하는 동안 두 개의 독립적 인 샘플을 레이블로 사용됩니다. 두 가지 주요 이점은 모든 표지 샘플 혼합하고 IEF 및 SDS-PAGE 젤이 비교에 의한 실험들 간 변동을 피하기 위해, 각 단계에 대해 한 번에 한 겔에서 실시되어있다. 또한, 단백질 7의 약 1 femtomole의 높은 탐지 임계 값을 제공한다. 젤 스캔 및 2D 소프트웨어는 CY2는 질량 분석에 의해 그들의 후방 식별을위한 관광 명소 중 통계적 차이의 식별을 허용하는 내부 표준으로 제공하는 2D 겔의 형광 이미지를 비교하고 있습니다. 내부 표준을 사용하여 2 차원 분석 소프트웨어 통계적 신뢰도 8의 95 % 이상과 샘플 사이의 차이의 10 % 미만의 빠른 검출을 달성한다.
미니 2DE 질적 분석은 단백질 특성 분석을위한 중요한 단계입니다. 원리는 이전 pi에서 MW 분리 설명한 것과 동일하지만,이 경우에는 단백질이 막에 작은 폴리 아크릴 아미드 겔로부터 전송 및 면역 블 롯팅은 나중에 수행된다. 하나의 차원 겔 전기 영동은 하나의 항체 기능, 정보 출력 여러 단백질 에피토프에 대한 단백질 발현의 변화를 제공하는 반면미니 2DE에서 북쪽으로 두 개의 추가 매개 변수를 부여한다. 첫째, 단백질 isovariants은 번역 후 변형이 일어날 수 있음을 나타내는 파이의 기능에 변경합니다. 둘째, 질량 분석 식별 그럴듯 zymogens과 단백질의 이화 작용 제품을 나타낼 수있다. 따라서, 2D-DIGE 관찰 수정이 글로벌 프로테옴 프로파일의 변화를 기본 메커니즘을 나타내는 것 같다. 미니 2DE하여 동일한 단백질 에피토프 / S에 대한 몇 가지 샘플들 사이 면역 블롯의 선형은 산도가 약간 관찰 번역 후 변형에 빛을 흘리는 변경 또는하지 monodimensional 면역 블롯 (9, 10)에 의해 반영 될 수 있습니다. 또한,이 분석은 대사 잔기 11,12의 파이 및 MW의 기술에 의한 전위 절단 부위에 대해 알려준다.
이들 두 기술의 조합은 상보 단백질 체학 분석을 제공한다. 한편 2D-DIGE은 일반 가르치시표정이 다른 폴리 펩타이드의 정확한 분리를 허용 차이의 전자. 이러한 차이는 지점 또는 형광 젤의 소프트웨어 분석에 의해 주어진 하나의 강도의 증가 / 감소의 비 표시로 기본적으로 구성되어 있습니다. 그러나, 그 자체로 이러한 관찰은 관찰 변형 예의 본질을 설명 할 확률이다. 의 isovariant / 이소 형 수준의 변화 : 폴리펩티드를 단리하고 질량 분석에 의해 식별되면 이러한 이유로, 미니 2DE의 사용)는 정확하게 하나를 확인하기 위하여 절연 단백질의 정체성과 차이의 2) 자연있게 예를 들어 표현, 번역 후 변형 및 절단 과정. 그러나, 매우 비슷하다 추출 프로토콜의 사용으로 인해 잠재적 분산액을 제한하기 위해 2D-DIGE 가진 미니 2DE 호환 모두 시작 용해 완충액을 개발하는 것이 필요하다.
본 문서에서는, 우리는 드2D-DIGE 인간 및 마우스 조직에서 오는 뇌 단백질 미니 2DE 기술의 준비, 추출 및 성능에 대한 적응 프로토콜을 스 크라이 빙.
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Protocol
1. 균질화 및 인간과 쥐의 뇌 조직에서 총 단백질 추출
- 뇌 조직 균질화. (인간의 샘플) 도공 유리 또는 (쥐 샘플) 테플론 균질화를 사용하여 뇌 조직의 10 % (W / V) 8 M 요소에, 2 M 티오 및 W / V SDS 버퍼 (UTS) 1 % 균질화한다. 60 Hz에서 전체 조직의 분해 (13, 14)에 0.5 초를 적용하는 초음파 발생기 (30) 펄스에서 초음파 처리.
- 표준으로 BSA를 사용하여, 브래드 포드 분석과 단백질 농도를 결정합니다. 이 버퍼 추출만큼 해물이 의해 carbamylation (15)을 방지하기 위해 가열 오버하지 않기 때문에 하나의 차원 SDS-PAGE와 완전히 호환되는 UTS.
- 1 %를 추가 (W / V) 앰버의 실온에서 10 분 동안 부드러운 혼합으로 품어. 그 후 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링하고 마지막 요소 / 티오 우레아 용액에 SDS를 추가합니다. 이 단계는 equilibr에 요산 및 이소시 산의 양을 감소시킨다솔루션의 요소와 IUM 및 분해를 촉진한다.
- 클로로포름 / 메탄올 단백질 침전. (독립적으로 IEF를 수행하기 위해 선택한 pH 범위에) 18 센티미터 사람을 위해 11cm IPG 스트립과 1.5 밀리그램 단백질 ㎍의 100 ~ 150 사이를 침전.
- 얼음 또는 4 ° C에서 모든 단계를 수행 침전 절차를 시작하기 전에 30 분 동안 4 ° C에서 멋진 클로로포름, 메탄올.
- UTS 용 해물의 하나의 볼륨에 메탄올 세 권 클로로포름 하나의 볼륨을 추가합니다. 수동으로 혼합물을 흔들어 냉수 세 볼륨을 추가합니다. 1 분 동안 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 단백질을 펠릿 소용돌이
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층 액을 버리고 차가운 메탄올의 세 볼륨을 추가합니다. 다시 소용돌이와 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 마지막으로 뜨는을 취소하고 N 2에서 펠렛을 건조.
- 2D 분석을위한 단백질의 제조.2D-버퍼 단백질 건조 펠릿 (8 M 우레아, 4 % CHAPS로 보충 2 M 티오 우레아)을 재현 탁. 위에 표시된대로 앰버와 솔루션을 씻고 2D-DIGE 용 2D 버퍼 200 μL 당 단백질 500 μg의 비율을 유지하려고합니다. 참고 : 2D 버퍼가 -80 ° C에 저장하거나 (요소 저하를 방지하기 위해) 일주 동안 4 ° C로 유지 될 수있다.
- 초음파 처리하고 다음 단계를 수행 할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다. 단백질의 포름산 가용화 10를 집계 후 주목할,이 프로토콜이 사용될 수있다. 간단히, N 2하에 포름산을 증발 바와 같이 펠렛을 재현 탁.
2. 2D-DIGE
- 샘플의 품질을 테스트합니다. 다시 도즈 샘플 브래드 퍼드 방법을 사용. LDS 샘플 버퍼, 열 37 ° C (15)에서의 단백질의 15 μg을 희석 4-12 % 년 폴리 아크릴 아마이드 젤에로드합니다.
- 쿠마시 염색. 0.1 %의 폴리 아크릴 아마이드 젤 얼룩 (w / v)의 쿠마블루 G-250, 50 %의 EtOH 및 10 %, 적어도 1 시간 동안 (v / v) 아세트산 용액. 배경이 7 % 아세트산 및 10 % (v / v) 에탄올 수용액에 하룻밤 destain하자.
- 샘플의 사전 전기 영동 표시. 이전 시아닌 염료 라벨을 수행하는, N-하이드 록시 대체 기본 pH에서 더 효율적이고 pH가 8.6에서 최적으로 주어진부터 기본 또는 중립이어야한다 시료의 pH를 확인합니다.
- 50 μg protein/400 pmol의 염료의 비율과를 Cy3 또는 Cy5의 형광 염료 연구의 최소한 두 개의 샘플을 라벨과 프로톤 아민과 시아닌의 NHS 에스테르 반응 그룹을 용이하게하기 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 1 시간 동안 유지 라이신의 그룹.
- 특히 시아닌 한 시료의 우대 커플 링을 방지를 Cy3와 Cy5에 염료와 크로스 라벨을 만드는 샘플 변형을 줄일 수 있습니다. 시아닌 염료 라벨링 PR 최소한 1 μg의 비율을 유지하면서 단백질 소량 위해 적응 될 수 있음을 유의8 pmol의 시아닌 염료 당 otein. 그렇다면, 미니 2DE 시스템 대신 대형 2D 젤 시스템에 사용될 수있다. 이는 뇌 조직의 소량 2D-DIGE 분석을 가능하게 할 것이다.
- CY2 형광 염료와 동일한 양의 단백질 (총 50 μg)과 함께 두 샘플의 풀을 라벨과 내부 표준 물질로 사용된다. 이전에 나타낸 바와 같은 조건을 사용한다.
- 1.1 %의 Destreak 시약, IPG 버퍼의 1.2 % 및 브로 모 페놀 블루 라벨 단백질의 총 150 μg (CY2 50 μg, CY2 50를 Cy3 ㎍의 50 μg)의 흔적을 포함하는 2D 버퍼와 총 부피 350 μL에 완료. 4 개의 독립적 인 스트립을 사용하여 사통에서이 단계를 수행합니다. 또한, 예비 젤에 대한 단백질의 350 ~ 450 μg과 두 개의 추가 비 표지 스트립 (각 샘플에 대해 하나)을 준비합니다.
- 수동 재수 미네랄 오일 하룻밤 덮여 여섯로드 스트립을 남겨주세요.
- Isoelectrofocusing. (20)에서 IEF을 수행6, C. pH가 3-11NL의 경우 18 cm의 프로토콜을 제거합니다 : 최대 전류 설정은 8 단계에서 50 μA / 스트립입니다 : 1) 150 V 1 시간 동안 단계, 2) 200 V 5 시간, 3) 500 V 그라데이션 단계 2 시간, 2 시간 4) 1,000 V의 그라데이션, 5) 2,000 V 2 시간 동안 그라데이션, 6) 4,000 V 2 시간 동안 그라데이션, 7) 8,000 V 2 시간 8) 24,000 V의 총에 대한 그라데이션 · 시간 단계 . IEF 후, 크로마토 그래피 페이퍼를 사용하여 미네랄 오일의 과잉을 파견 및 제 사이즈까지 -20 ° C에서 스트립을 저장한다.
- IPG는 평형을 제거합니다. 같은 버퍼에 요오도 아세트 아미드 4.7 %로하지만, DTT없이 6 M 요소, 2 % SDS, 30 % 글리세롤, 50 MM 트리스 - 염산 pH를 15 분 동안 DTT의 1 %와 8.6 버퍼와 후 스트립을 평형.
- 두 번째 차원 또는 SDS-PAGE 전기 영동. 6 ~ 12 % SDS-PAGE 젤 (1.5 M 트리스 - 염산의 pH 8.6, 12 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드, 0.1 % (W / V) SDS, 0.072 % (W / V) APS 0.1 % (V / V)을 확인 TEMED ) STRI 네 낮은 형광 유리판으로, 대형 2D 시스템을 사용하여 동시에단백질 반점을 절제하기 위해 예비 젤에 대한 두께 1.5 mm의 형광 샘플 및 두 개의 다른 유리 접시와 PS.
- (w / v) 아가로 오스의 0.5 %와 젤의 상단에 레이어드를 통해 여섯 IPG 스트립을로드합니다. 실행 버퍼는 25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % (W / V) SDS로 구성되어있다. 4 ° C 16, 17로 설정 냉동 시스템 야간에 2.5 W / 젤에서 마이그레이션을 수행하십시오.
- 형광 이미지 획득 및 분석. 형광 젤 이미지 (하나의 실험에 대한 12 이미지)를 얻기 위해 태풍 9400 스캐너를 사용합니다. 스캔 CY2, 520분의 488 nm의 580분의 532 nm의 670분의 630 nm의 여기 / 방출 파장, 각각 각 젤를 Cy3와 Cy5에 이미지. 이미지를 분석하는 INFORMATIC 소프트웨어를 사용합니다. 데이터 공부 두 샘플 간의 네 겔 걸쳐 신호의 분포와 연관된 스폿 볼륨의 변동을 반영한다.
- 큰 젤에 대한 쿠마시 염색. 5에 예비 젤 수정0 % (V / V)을 EtOH 3 %에서 최소 24 시간 동안 (V / V) 오르토 인산 솔루션을 제공합니다. 그런 후, 20 분 동안 매우 순수한 물로 2 회 세척한다. 34 %에 착색을 수행합니다 (v / v)의 메탄올, 17 % (W / V) 암모늄 황산 (w / v)의 쿠마시 블루 G-250 0.1 %를 추가하기 전에 1 시간 동안 2 % 오르토 인산. 최소 48 시간 초순수에 탈색을위한 색채 젤을 유지합니다.
- MS의 식별을위한 관광 명소입니다. 형광 이미지를 분석하면, 소프트웨어는 식 통계적 다른 스폿의리스트를 제공한다. 수동으로 예비 젤에서 이러한 장소를 절제. 이 절차는 각질 오염을 피하기 위해 약간의 연습과 손재주를 필요로한다. 다음 샘플은 MS로 전송 될 때까지 -20 ° C에서 물에 보관하실 수 있습니다. 스팟 식별 탠덤 질량 분석 (MS / MS)와 단백질 정체성의 관련성과 완벽하게 호환되는이 확률 0.05 (P <0.05) (18)의 P-값을 계산 기반 Mowse 점수에 따라 판단된다. </ OL>
3. 질적 미니 2DE 분석 실험
- 2D 버퍼의 단백질 시료의 최대 100 μg을 재현 탁 11cm의 IPG 스트립 200 μL의 최종 볼륨까지. 과발현 시스템 또는 정제 된 단백질의 경우, 시작 양은 20 μg으로 낮출 수있다.
- 200 μL의 최종 볼륨 (V / V) Destreak 시약, 0.55 % (V / V) IPG 버퍼와 브로 모 페놀 블루의 흔적을 1.1 %를 추가합니다. 그런 다음, 소용돌이, 빠른 스핀을 밤새 미네랄 오일이 덮여 (원래의 두께로 지구를 가져) 수동 수분 보충을 위해 IPG 스트립에로드합니다. 참고 : IPG 버퍼의 비율이 원하는 산도 (pH를 3-11, 4-7, 7-11, 등)의 모든 구간에 대해 동일하지만, 그 조성물 선택된 pH 범위의 함수로 변화한다.
- Isoelectrofocalisation. 20 ° C에서 IEF를 수행 프로그램의 지속 기간은 선택된 산도 간격에 의존한다. 주목할만한, 그런 electroendosmosis는 IEF 프로필을 방해 할 수와 같은 이러한 경우에 매개 변수,electrofocalisation 시간 최적화는 19이 필요합니다. 주 : 반드시 더 나은 결과를 제공하지만, IEF의 시간을 단축하는 것도 해상도를 향상시킬 수있다 이상 IEF 아니다. IEF 후, IPG 스트립 개월 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- IPG는 평형을 제거합니다. 25 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 20 mM의 DTT, 10 % 글리세롤, 5 % SDS, 0.05 % 브로 모 페놀 블루를 함유하는 완충액에 스트립을 평형화. 세 가지 평형이 각 화장실 사이의 완충 용액을 변화와 함께 15 분 동안 목욕합니다.
- SDS-PAGE. 관심의 단백질의 분자량에 따라 선택 폴리 아크릴 아미드의 비율로 프리 캐스트 젤 (IPG +1 아니라, 11cm의 IPG 스트립)에 IPG 스트립 레이어. 그 후, 33 분 동안 100 MV에 니트로 셀룰로오스 / PVDF 멤브레인 상에 겔을 가릴.
- 필요한 항체를 밤새 품어 과산화 효소 활성에 의해 시각화. 이차 항체에 의해 밝혀 관련이없는 폴리 펩타이드를 사용하여 면역 블롯의 정렬을 수행합니다. 반으로 Quantit 도달ImageJ에 소프트웨어를 추적 / 반점의 볼륨과 강도의 농도계에 의해 분석는 ative.
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Representative Results
제공된 이상적인 버퍼 단백질의 100 %, 특히 막 - 연관 또는 세포 골격 단백질을 복구하기 위해 존재하지 않기 때문에 뇌 조직에 프로테오믹스 도전 남아있다. 실험의 첫 번째 세트는 단백질의 대형 패널을 복구 할 수 있도록 두 개의 접근법과 호환 적합한 용해 버퍼의 검색에 집중 하였다. 따라서, 세 용해 버퍼는 가장 적절한 하나를 결정하기 위해 분석 하였다. 첫째, 그것은 1 %와 10 밀리미터 (W / V) SDS (그림 1A)에서 공통의 생화학 및 분자 생물학 버퍼 트리스 - 염산 (20)를 사용 하였다. 또한, 트리스 - 염산은 폴리 아크릴 아미드 및 아가 로스 젤에 대한 전기 영동 버퍼와 같은 강력한 응용 프로그램이 있습니다. 다른 두 용해 버퍼는 UTS (그림 1B)와 2DE 하나 있었다. 트리스 SDS는 가난한 해상도를 얻을 수 및 지점의 수는 상당히 높은 자리 분리, 아니 distorsion과 FA UTS, 관찰 프로파일과의 비교 (그림 1B)를 낮춘R 더 나은 단백질의 복구 (그림 1B) 관찰되었다. 이 점은 트리스 - 염산 벤치 원심 분리 한 후 두께를 UTS 추출 수율 거의 잔류 펠렛을, 빚 반면 사실에 의해 지원됩니다. 패턴은 그림 1B에서 보여준 것은 명확하게 트리스 - 염산과 같은 다른 버퍼에 대한 UTS의 높은 단백질의 용해도의 증거를 제공합니다. 심지어 2DE 버퍼도 테스트되었습니다 Notheworthy, 그것의 사용이 펠릿에도 불구하고 있기 때문에 배제 하였다는 어느 쪽도 관찰되지 않았다 지질 용해되지 않은 그들이 조작을 difficulting 상위 계층에 남아 있었다. 이러한 데이터와 계약에서, 아미노산 잔기 사이 nonconvalent과 이온 결합을 방해하고 (21) 2) 또 세포 단백질을 분해 프로테아제의 활성을 방지하여 단백질을 변성 1) 중립 chaotrope 여러 가지 이유로 UTS 버퍼의 사용을 권장 우레아 용액에 티오 비약적 소수성 막 단백질의 용해도를 향상집계 (22, 23)에 발생하기 쉬운 3) 음이온 세제 SDS의 특별 수당은 지질을 분해 단백질은 소수성 상호 작용을 통해 단백질을 결합뿐만 아니라, 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 활성 억제 (24, 25)을 증가시킨다. 또한 그것은 IEF를 방해 할 수 impureties을 제거하는 침전 단계를 추가하기로 결정했다. 이러한 방식으로, 같은 침전 법 26 및 메탄올 이미 뇌 조직에서 풍부 지질을 제거하는 최적 용매로서 설명되었다 단백질의 용해도를 결정하고, 그것의 클로로포름 / 메탄올 침전 (27)를 선택하도록 우리를 가져왔다. 양쪽이 온성 세제 CHAPS (3 - [(3 - cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 - 프로판 설포 네이트)의 활용 단백질을 재현 탁에 대한이 2D 버퍼에 펠렛은 첫 번째 차원의 28 단계에서 단백질 입구를 용이하게하기위한 적합성 때문이다.
인간과 쥐의 뇌 홍보의 프로필2D-DIGE 의하여 oteome는 각각도 2a 및도 2b에 도시된다. 그림 2A에서 인간의 통제에서 나오는 형광 이미지를 병합 AD 피질 샘플 AD와 같은 타우 병리 (29)의 모델의 해마에서 마우스의 샘플 그림 2B IDEM에서 관찰 할 수있다. CY2,를 Cy3와 Cy5에 각각 그림에서 인간의 샘플 2C-2E에 도시되어있다. 두 병합 패턴 (그림 2A와 2B)는 고품질 IEF 및 그림 1B에서 관찰 프로파일과 계약 두 번째 차원의 분리를 반영하는 높은 자리 해상도를 제시한다. 함께 가교가 소프트웨어 분석을 통해 정렬 할 수있는 형광 이미지 (그림 2C-2E)은 매우 쉽게 특정 시아닌에 단백질의 가능한 환경을 제거하기 위해 수행한다는 사실이 자리 정의 품질. 또한, 예비 겔은 파란색 공동으로 염색omassie 증거 하나의 소프트웨어 분석 후 MS / MS에 의해 자신의 사후 확인을 위해 지점을 절제 할 수 있도록 모든 사용되는 pH 범위에 풍부한 관광 명소와 풍부한 단백질지도.
단백질에 대한 면역 블에 의한 질적 미니 2DE 분석은 번역 후 사람을 위해뿐만 아니라, 올리고머 및 잘림을 위해 (그림 3a 및 3b)뿐만 아니라, 자사의 식별 및 수정을위한 높은 가치의 정보를 제공합니다. 미니 2DE에이 기술을 수행 할 수있는 가능성은 관심의 단백질에 대한 신속하고 정확한 데이터를 제공합니다. Lewy 바디 치매 (LBD)에 의해 영향을받는 환자에서 조직에 관해서는, 알파 synuclein의 특성 그럼에도 불구하고 함께 원시 단백질은 4.67 파이에 있으며, 18 kDa의의 MW 위치를 잘 정의 된 4-7의 pH 프로파일을 시각화 할 수 있습니다 미니 2DE는 상기 원시 형태보다 동일의 pI에 다이머 (도 3a, 별표)의 존재뿐만 아니라 UBIQ의 존재를 알 수있다그들은 (그림 3A, 화살표) 때 더 유비퀴틴 더 기본 및 높은 MW에 있습니다 uitinated 형태. 속속들이 AD 링크 된 다른 단백질은 아밀로이드 전구 단백질 (APP)의 복소 이화 작용에 의해 생성 된 아밀로이드 - 베타 펩티드,이다. 그림 (b)에서 그것은 가족 하나 산발적 AD 케이스의 플롯을 비교한다. 익숙한 AD의 경우는 아밀로이드 - 베타 1-42가 산발적 AD에 대해 감소하는 방법을 관찰 할 수있다, 또한, isovariants은 아밀로이드 - 베타 X-42 (4 kDa의)도 모든 차이를 넘어 규제된다 한편 8 kDa의에서 발견 된 올리고머 반점의 강도가 잘 AD (그림 3B)에서 더 많은 관련이 있기 때문에이 사실은, 단백질의 낮은 수량으로 인해 아니라는 것을 반영합니다.
그림 1 : 2DE 홍보ofile 10 mM 트리스, 1 % SDS w / V 버퍼 추출 (A) 및 UTS 사용률 (B) 후에 얻어지는 패턴. 후에 패널 B에서 그것은 스폿 강도 해상도의 개수보다 훨씬 높다 어떻게 알 수 패널 (A). UTS의 사용이 2DE 쿠마시 염색에 반영되어 거의 전체 단백질을 추출 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 사람 (A) 및 마우스 (B)를위한 2D-DIGE 프로파일이 도시되어 이미지 (A)와 (B)가 18cm 스트립 3-11 pH 범위에서 세 시아닌위한 병합 된 이미지를 나타낸다.. 그림 (C), (D) 및 (<강한> E) 시아닌은 빨간색 (파란색 CY2, 녹색를 Cy3와 Cy5에) 독립적으로 노출되어있다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 상단 패널은 고유의 pl (4.4) LBD 환자의 단백질 알파 시누 클레인의 미니 2DE 프로파일을 관찰 할 수있는 이합체 (별표)의 기능 MW (18 kDa의) 변화 곳 MW 기본적인 하나 (화살표) (A)까지 PI를 이동, 이중, 유비퀴틴입니다. 아래 그림은 AD의 산발적과 유전 경우 아밀로이드 - 베타 펩티드 항체의 프로파일을 보여준다. 2DE 패턴은 올리고머 및 분해가 DISE의 원인에 따라 다른 방식으로 일어날 방법을 보여줍니다ASE. 이 면역 블롯은 명확하게 두 가지 조건 사이의 APP 이화 작용의 차이를 지적한다. 올리고머 이하 (B)를 표시하는 것 한 손에 가족 한 (화살표)에 대한 산발적 AD에서의 이화 제품의 증가가있다. 이 실험은 각각 12 % 비스 - 트리스 젤 4-7의 pH 차이와 16.5 % 트리스 - 트리 신 하나에 11cm 스트립에서 수행 한 (A, B). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단백질의 병리학 적 발현 변화를 발견, 생체에 대한 검색 및 약물 표적에 대한 잠재적 인 경로의 변조 neuroproteomics의 목적 중입니다 (30)에 접근한다. 새로운 도구 가운데, 2DE 필드는 유망한 expectative을 추가합니다. 그럼에도 불구하고, 합의 변동을 최소화하고 실험의 재현성을 높이기 위해 도달되어야한다. 이 아이디어의 라인에서 2D-DIGE (그림 2)와 모노 차원 면역 블롯과 완벽하게 호환 인간과 생쥐의 뇌 조직에 대한 후속 2DE의 면역 블롯 (그림 3)을 수행하는 표준화 된 프로토콜은 여기에 대한 상세한 설명되어 있습니다.
단백질 체학에서 가장 큰 딜레마 중 하나는 가용화 버퍼 선택입니다. 그것이 IEF 완전히 호환 때문에 다른 접근법들 사이의 재현성을 높이기 위해, UTS가 선택되었다. 또한, UTS 추출 완충액은 PELLE를 산출하지t 또는 12,000 XG에 원심 분리 후 정말 약간의 하나 (4 ° C에서 SDS의 강수량과 혼동하지 마십시오). 이 계정에 중요한 점하고 있음 AD 등 많은 신경 퇴행성 질환에 존재하는 단백질의 응집. 독립적 인 연구는 수용성 및 비 - 수용성 분획에 대해 수행되지 않아야 이후 제공된 펠릿가 없다는 사실은, 성능 및 데이터 해석을 단순화한다.
2D-DIGE 또는 미니 2D 접근 방법을 수행 할 예정간에, 표시해야합니다 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째 UTS 버퍼의 화학적 특성은,이 솔루션은 과열되지 않아야합니다, 또는 의해 carbamylation 일차 아민에 발생하기 때문에 IEF (15)을 손상하여 장소의 해상도를 악화, 시아닌 염료 커플 링 및 2D 프로파일을 모두 방해 할 수 있습니다. 둘째, 없음 pH 범위는, 요즘 광범위한 pH를 간격 3-11 구비하고,이 요소는 IPG 스트립 상으로 모든 단백질 엔트리 EXPL 수없는 확률에 접합염색 후 겔의 양측에 적층 된 단백질 밴드를 원할때. 전체 프로테옴은 2D에 의해 연구 될 수없는 이유는이 제한 사항은 상세히 설명 할 수 있습니다. 또 다른 중요한 한계는 강수량의 논쟁의 사용이다. 한편, 효율적 지질 함량 (27)을 줄일 수 있도록, 클로로포름 / 메탄올로 침전 단계를 수행하기 위해 매우 추천 할, 염, 핵산 및 IEF 파라미터 방해하고 해상도 및 / 또는 재현성에 영향을 미칠 수 청구 세제 2D. 또한, 다른 한편으로는 강하게 막에 부착 단백질 일부가 손실 될 수 있다는 것을 배제 할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 다른 추출 버퍼 대신 UTS 중 어느 하나 또는 프로테아제 또는 포스파타제 억제제를 첨가하지 않고 사용되는 경우, 침전 단계의 사용은 매우 IEF 동안 함정 추천. 마지막으로, 그것은 2D-DIGE 이미지 분석은 형광을 겹쳐 불편을 제시 주목할 만하다소프트웨어 분석에 상당한 변화처럼이를 고려하지 않기 때문에 반점, 정보의 손실로 이어질 수 있습니다.
이 결합 방법의 참신은 재현성하고, 다양하고, 단백질의 특성에있다. 오직 하나의 추출 버퍼는 한 개의 상보 적 기법을 수행 할 수있다. 2D-DIGE 단백질 발현 변화와 MS / MS에 의해 그들의 이후의 식별에 대한 정량적 인 정보를 제공합니다. 그러나, 이소, isovariants, zymogens, 번역 후 변형 및 이화 제품은 다른 단백질과 중복 형광 때문에 식별 할 수있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 그것은 미니 2DE의 병렬 사용을 제안한다. 사실, 우리의 지식을 약속 할 수있는 가장 중요한 함정 중 하나는 2D-DIGE 결과의 완전한 검증으로 모노 차원 면역 블롯을 위해, 또는 어떤 단백질 체학 수정 유효성을 검사 할 필요가 없습니다 것을 고려하는 것입니다. Furthermore, 미니 2DE의 기술적 인 장점은 1) 작은 SDS-PAGE 시스템, 2) 상대적으로 낮은 재료 필요, 산도, 3) 폭 넓은 범위를 제공, 4) 면역 블롯의 감성과의 5) 쉽게 추정을 사용할 수있는 가능성 변경. 미니 2DE 기법 fussiest 양태는 계량화 미니 2DE에도 불구하고 이런 방식으로 신뢰성을 가구, 반점 또는 플롯 정렬 후에는 산성 및 염기성 부분 또는 그 반대 사이의 비율을 설정하는 것이 가능하고, 정량적 인 방법으로 간주 될 수 없다 변화의 추정은 9를 관찰했다.
문학의 여러 데이터 정확한 등의 Lewy 기관 (32, 33)과 치매와의 그림 (a)에 기재된 31, 올리고머 및 분해 경로와 및 번역 후 변형없이 과다 발현 된 단백질로 단백질의 특성을 달성하기 위해 사용하는 미니 2DE, AD 환자. 정보의 다른 예는 m에 의해 제공된 INI 2DE 예방 접종 방법 (34)에 대한 잠재적 인 대상으로 비 치매와 AD의 경우 수행 베타 아밀로이드 종의 절단이다. 올리고머 및 차등 저하의 존재는 또한 산발적 또는 익숙한 AD 환자에 따라 그림 (b)에 표시됩니다. 다른 처리가 수행 될 수 있기 때문에 또, 소형 2DE 접근법 가능성의 폭과 실제 윈도우를 연다. AD의 분야에서 예를 들어, 포스파타제 억제제를 첨가 할 수 있으며, 타우 인산화에 미치는 영향을 밝히기. 또한 pi에서 절단 된 형태의 MW 식별이 항체의 항원 결정기 (34)에 따라 절단 부위를 제공 할 수 주어진 단백질 분해 경로의 약리학 약물 효과. 흥미롭게도, 최근의 데이터는 미니 2DE에게 마우스 모델에서인지 장애와 라이프 스타일과 약물 치료의 연결뿐만 아니라 새로운 타우 돌연변이 35-37의 생화학 적 프로파일을 사용하여 해명했다.
ntent는 "> 인간 또는 마우스의 기원뿐만 아니라 뒤에 미니 2DE를 사용하여 유효성 검사에서 얻을 뇌 조직의 2D-DIGE을 가능하게하는 방법의 개발, 새로운 약물 표적 및 신경 질환의 연구에 대한 생체 폭로로 빛을 발산 할 수 있습니다. 이러한 질환은 뇌에서 기원을 가지고 있다는 사실은, 그러나, 사람의 샘플이 제한된다. 이상적인 정보 소스로서이 기관을 연구하기 위해 강요하므로 동물 모델의 사용은이 목적을 달성하기 위해 불가결해진다. 여기서보기에 접근 방법을 사용하는 중요성 샘플의 두 유형에 대해 평행하고 그 결과를 검증. 그것은 결국 조만간 신뢰성 후보가 발견되며, 플라즈마 및 뇌척수액 등 하사 유체 시험 질병 진행의 조기 진단, 평가를 확립하기 위해하고있는 것이 바람직하다 사용할 수있는 그럴듯한 치료의 평가.프로토콜 내에서 중요한 단계는 suitab을 위해 고려되어야한다르 응용 프로그램입니다. 2D-DIGE의 경우, 샘플 테스트 품질은 중요한 특징이다. 이 시험 허가 단백질이 단백질의 실제 양 프로필 및 검증 알고 침전 후 2D 버퍼에 기존의 압축을 풉니 다. 스테인드 프로필은 우리에게 샘플의 품질과 동질성에 관한 정보를 제공합니다. 유사한 패턴 만 샘플 그렇지 않으면 2D-DIGE이 좋지 염색 및 단백질 프로파일의 가난한 해상도로 이어질 수, 2D-DIGE 연구에 사용되어야합니다. 이러한 샘플 패턴의 차이는 마우스의 뇌 조직에서보다 인간에 더 일반적입니다, 많은 불편 (38, 39)와 연구 계약에 대한 인간의 뇌 샘플입니다. 또, 인해 사후 간격 단백질 분해의 식별은 이미 2D-DIGE 40,41 의해보고되었다. 시아닌 염료 라벨링 전에 pH를 검증이 단계. 시아닌 염료 라벨링 모든 후방 절차 악영향해야과 SDS-PAGE 전기 영동은 어두운 곳에서 수행되어야형광 라벨에 영향을하지 않기 위해 가능한 한 많이. 마지막으로, 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 마이그레이션하는 동안 간 변동성을 제거하고 패턴이 겹치는 촉진 및 사후 분석 42,43하기 위해, 그들 사이에 가능한 한 균일해야합니다.
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Disclosures
저자는 선언하는 어떠한 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 INSERM, 릴 2의 대학에 의해 지원되었다, MEDIALZ, LabEx (우수 실험실, 프로그램은 미래에 대한 투자) 및 DISTALZ (알츠하이머 병에 대한 학문적 접근을위한 혁신적인 전략의 개발). FJ.FG 현재 ANR (프랑스 국립 연구 기관 / NeuroSplice 드 타우 01 인텔리 ANR-2010-BLAN-1114)의받는 사람의 교제이지만,이 작품은 JCCM (스페인)에서 교부금의 지원 아래도했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
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