Summary
Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.
Abstract
Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un potente strumento per scoprire le modifiche del proteoma potenzialmente correlati alle diverse condizioni fisiologiche o patologiche. Fondamentalmente, questa tecnica si basa sulla separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico in una prima fase, e in secondo luogo in base al loro peso molecolare mediante SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). In questo rapporto viene descritto un protocollo di preparazione del campione ottimizzato per la piccola quantità di tessuto post mortem e di cervello di topo umano. Questo metodo consente di eseguire sia l'elettroforesi bidimensionale differenza di fluorescenza gel (2D-DIGE) e mini 2DE immunoblotting. La combinazione di questi approcci permette non solo di trovare nuove proteine e / o modifiche proteine nella loro espressione grazie alla compatibilità con rilevazione spettrometria di massa, ma anche una nuova comprensione convalida marcatori. Quindi, mini-2DE accoppiato ai permessi di Western blotting per identificare e convalidare postale-Traduzionali modifiche, proteine catabolismo e fornisce un confronto qualitativo tra condizioni e / o trattamenti diversi. Qui, forniamo un metodo per studiare i componenti di aggregati proteici presenti in AD e demenza Lewy, come il peptide beta-amiloide e l'alfa-sinucleina. Il nostro metodo può quindi essere adattato per l'analisi del proteoma e proteine insolubili estrarre dai modelli di tessuto cerebrale e topi umani. Parallelamente, essa può fornire informazioni utili per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nelle malattie neurodegenerative, nonché i potenziali nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici.
Introduction
Disturbi mentali e neurologici rappresentano il 13% del carico globale di malattia, nuove sfide come meccanismi fisiopatologici, fattori di rischio e biomarcatori prodromici devono essere esplorate 1. In linea con questo obiettivo, proteomica studi del cervello umano diventano indispensabili per scoprire i meccanismi molecolari coinvolti nei processi come la memoria, il comportamento, le emozioni e la plasticità neuronale per esempio, non solo per motivi fisiologici, ma anche per le condizioni patologiche. Pertanto, l'uso di modelli animali e più specificamente i topi transgenici, porta una vasta gamma di possibilità di imitare l'eziologia delle malattie neurodegenerative umane 2.
Proteomica approcci sono oggi disponibili per realizzare queste nuove prospettive nel campo delle neuroscienze. Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un metodo semplice e potente probabile che permette di confrontare il proteoma di una vasta gamma di campioni. Inoltre, è anche unpotente metodo per isolare una proteina da una miscela complessa al fine di identificare e analizzare ulteriormente mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consiste essenzialmente in due fasi successive: 1) la separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico (pI) da isoelettrofocalizzazione (IEF). Più precisamente, un potenziale elettrico viene applicato attraverso le strisce di acrilammide Immobiline tra un gradiente di pH e quindi proteine migreranno e concentrarsi su un pI determinata in funzione della loro carica netta globale. 2) proteine Isoelectrically focalizzati sono denaturati e caricati negativamente con l'aggiunta di sodio dodecil solfato (SDS), in tal modo le proteine nella loro prima struttura sono separati in funzione del loro peso molecolare apparente (MW) mediante SDS-PAGE 3. Queste due proprietà distinte ci permettono di affrontare un valore doppio di andare oltre nello studio del proteoma. Da un lato questo approccio offre la possibilità di effettuare una analisi quantitativa utilizzando coloranti minime metodo 2D-DIGE, e dall'altro un qualitative analisi mini-2DE accoppiato al western blotting.
Analisi quantitativa da 2D-DIGE conferisce espressione della proteina cambia tutto il proteoma del campione. In breve, i campioni vengono etichettati con tre cianine (CY2, Cy3 e Cy5) che emettono a tre lunghezze d'onda distinte (blu, verde e rosso). Questi coloranti minime fluor contenenti N-idrossi gruppo estere succinimidyl reagiscono con il gruppo ε-amminico lysines residui di proteine conseguente covalenti legami ammidici 4. Residui di lisina sono etichettati solo tra 1-3% e impedendo così più etichette, oltre a proteine e importanti modifiche di carica al netto 5, 6. Cy3 e Cy5 sono spesso utilizzati per etichettare due campioni indipendenti mentre Cy2 tag un mix di uguale percentuale dei campioni da confrontare. I due vantaggi principali sono che tutti i campioni etichettati sono miscelati e IEF e SDS-PAGE sono svolte in un gel in una sola volta per ogni passo, evitando l'inter variabilità tra esperimenti a causa di gel confronto. Inoltre, presenta una soglia alta rilevamento di circa 1 femtomole di proteine 7. Gel vengono analizzati e software 2D a confronto le immagini 2D fluorescenza gel, dove Cy2 serve come standard interno consentendo l'identificazione delle differenze statistiche tra i punti per la loro identificazione posteriore mediante spettrometria di massa. Il software di analisi 2D utilizzando lo standard interno raggiunge un rilevamento rapido di meno del 10% delle differenze tra i campioni con più del 95% di confidenza statistica 8.
Analisi qualitativa da mini-2DE è un passo cruciale per la caratterizzazione delle proteine. Il principio è lo stesso come precedentemente descritto per pI e separazione MW, ma in questo caso le proteine vengono trasferite da una piccola gel di poliacrilammide ad una membrana e immunoblotting viene eseguita dopo. Mentre una elettroforesi su gel di dimensione fornisce cambiamenti nell'espressione di proteine per uno o più epitopi proteici in funzione della anticorpo, il information di mini-2DE dota di due parametri aggiuntivi. In primo luogo, le isovariants proteine cambiano in funzione del pI, indicando che modificazioni post-traduzionali potrebbero aver luogo. In secondo luogo, l'identificazione spettrometria di massa può essere indicativo di zimogeni plausibili e prodotti catabolici di proteine. Pertanto, le modifiche osservate da 2D-DIGE sono probabilmente indicativi dei meccanismi alla base cambiamenti nel profilo proteoma globale. Allineamenti di immunoblots tra i diversi campioni per la stessa proteina epitopo / s in mini-2DE possono riflettere i cambiamenti di acidità che faccia luce sulle variazioni post-traslazionali leggermente osservate o addirittura non da immunoblotting monodimensionale 9, 10. Inoltre, questa analisi informa circa i potenziali siti di taglio dovuti alla conoscenza del pI e MW dei residui metabolici 11,12.
La combinazione di queste due tecniche fornisce un complementare analisi proteomica. Da un lato 2D-DIGE offre un tipicoe di differenze che permettono un isolamento precisa di polipeptidi la cui espressione è diversa. Queste differenze consistono essenzialmente nella comparsa o scomparsa di un punto o di aumento / diminuzione dell'intensità di un dato da una analisi software dei gel fluorescenti. Tuttavia, queste osservazioni da soli sono difficilmente spiegare la natura della modifica osservato. Per queste ragioni, una volta che il polipeptide è isolato e identificato mediante spettrometria di massa, l'uso di mini-2DE permette di confermare precisamente 1) l'identità della proteina isolata e 2) la natura della differenza: variazione del livello isovariant / isoforma espressione, modificazioni post-traslazionali e processi di scissione per esempio. Tuttavia, è necessario sviluppare un tampone di lisi a partire sia compatibile con 2D-DIGE e mini-2DE per limitare i potenziali dispersioni derivanti dall'uso di protocolli di estrazione che sono molto dissimili.
Nel presente articolo, DEdescritto un protocollo adattato per la preparazione, estrazione e prestazioni delle tecniche mini-2DE per proteine cerebrali provenienti da tessuti umani e mouse 2D-DIGE e.
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Protocol
1. Omogeneizzazione e Total estrazione di proteine da umano e mouse tessuto cerebrale
- Cervello omogeneizzazione del tessuto. Omogeneizzare il tessuto cerebrale 10% (w / v) in 8 M urea, 2 M tiourea e 1% w / v tampone SDS (UTS) utilizzando una lente potter (per campioni umani) o Teflon omogeneizzatore (per topi campioni). Ultrasuoni a 60 Hz 30 impulsi con un generatore di ultrasuoni applicazione 0.5 sec per la disintegrazione del tessuto totale 13, 14.
- Determinare la concentrazione di proteine con saggio Bradford, utilizzando BSA come standard. Questo UTS estrazione buffer è completamente compatibile con una dimensione SDS-PAGE purché non lisati sono sovra-riscaldato per evitare carbamilazione 15.
- Aggiungere 1% (w / v) di Amberlite e incubare con miscelazione delicata per 10 min a temperatura ambiente. Successivamente filtrare su 0.22 micron filtri per siringa e infine aggiungere la SDS per la soluzione di urea / tiourea. Questo passaggio riduce la quantità di acido urico e acido isocianico, che sono in equilibrIUM con urea in soluzione e facilitare la sua degradazione.
- Cloroformio / metanolo precipitazione delle proteine. Precipitare tra 100-150 mg di proteine per 11 centimetri strisce IPG e 1-1,5 mg per 18 centimetri quelli (indipendentemente sulla gamma pH selezionato per eseguire l'IEF).
- Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio oppure a 4 ° C. Fresco cloroformio e metanolo a 4 ° C per 30 min prima di iniziare la procedura di precipitazione.
- Aggiungere tre volumi di metanolo e un volume di cloroformio per un volume di UTS lisato. Agitare manualmente la miscela e aggiungere tre volumi di acqua fredda. Vortex per 1 min e agglomerare le proteine mediante centrifugazione a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur e aggiungere tre volumi di freddo MeOH. Nuovamente Vortex e centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. Infine, scartare il surnatante e asciugare il pellet sotto N 2.
- Preparazione di proteine per analisi 2D.Risospendere il pellet di proteine-essiccati in 2D-buffer (8 M urea, 2 M tiourea integrato con 4% CHAPS). Lavare la soluzione con Amberlite come indicato sopra e cercare di mantenere la proporzione di 500 mcg di proteine per 200 ml di tampone per 2D 2D-DIGE. Nota: tampone 2D può essere conservato a -80 ° C o mantenuta a 4 ° C per una settimana (per evitare degradazione dell'urea).
- Sonicare e conservare i campioni a -80 ° C fino effettuare il passaggio seguente. Degno di nota, questo protocollo può essere usato dopo solubilizzazione di acido formico di proteine aggregati 10. In breve, far evaporare l'acido formico sotto N 2 e risospendere il pellet come descritto.
2. 2D-DIGE
- Campioni di prova di qualità. Campioni di dose ancora utilizzando il metodo di Bradford. Diluire 15 pg di proteine in tampone campione LDS, riscaldare a 37 ° C e 15 caricare sul 4-12% gel di poliacrilammide.
- Colorazione con Coomassie. Macchiare gel di poliacrilammide con 0.1% (w / v) CoomassieBlu G-250, 50% EtOH e 10% (v / v) di acido acetico per almeno 1 ora. Sia sfondo Destain notte in 7% di acido acetico e 10% (v / v) di etanolo.
- Etichettatura pre-elettroforetica dei campioni. Prima di eseguire l'etichettatura colorante cianina, verificare il pH del campione, che dovrebbe essere di base o anche neutro poiché la sostituzione N-idrossisuccinimmide è più efficiente a pH basico e somministrato essere ottimale a pH 8,6.
- Etichettare minimamente i due campioni di studio con coloranti fluorescenti Cy3 o Cy5 con un rapporto di 50 ug protein/400 pmol colorante e mantenere per 1 ora a 4 ° C al buio per facilitare il gruppo estere attivo NHS delle cianine con l'ammina senza protoni gruppi di lisine.
- Ridurre le variazioni di esempio facendo un cross-etichettatura con Cy3 e Cy5 coloranti, evitando un accoppiamento preferenziale di un campione a un particolare cianina. Si noti che il cianina-colorante marcatura minima può essere adattato per piccole quantità di proteine con mantenere la proporzione di 1 ug protein per 8 pmol Cyanine-dye. Se è così, il sistema mini-2DE può essere usata al posto della grande sistema gel 2D. Ciò consentirà l'analisi 2D-DIGE per una piccola quantità di tessuto cerebrale.
- Etichettare un pool di entrambi i campioni con la stessa quantità di proteina (50 mg in totale) con colorante fluorescente Cy2 e usato come standard interno. Utilizzare le stesse condizioni come precedentemente indicato.
- Completa in un volume totale di 350 microlitri di tampone 2D contenente 1,1% di reagente Destreak, 1,2% di tampone IPG e tracce di blu di bromofenolo totale 150 mcg di proteine marcate (50 mg di Cy2, 50 mg di Cy3 e 50 ug di Cy2). Eseguire questo passaggio in quadruplice copia utilizzando quattro strisce indipendenti. Inoltre, preparare due ulteriori strisce non etichettati (uno per ogni campione) con 350-450 mg di proteine per i gel preparative.
- Lasciare le sei strisce cariche ricoperte di pernottamento oli minerali per la reidratazione passiva.
- Isoelettrofocalizzazione. Effettuare la IEF a 206; C. Per un pH 3-11NL, 18 centimetri striscia il protocollo è: l'impostazione corrente massima è di 50 ìA / strip durante le 8 tappe: 1) 150 V step per 1 ora, 2) 200 V fase per 5 ore, 3) 500 V con pendenza 2 ore, 4) gradiente di 1,000 V per 2 ore, 5) 2,000 V pendenza per 2 ore, 6) 4,000 V pendenza per 2 ore, 7) 8,000 V pendenza per 2 ore e 8) per un totale di 24.000 V · h passo . Dopo IEF, inviare l'eccesso di olio minerale con carta cromatografica e memorizzare le strisce a -20 ° C fino alla seconda dimensione.
- IPG Strips equilibratura. Equilibrare strisce in 6 M urea, 2% SDS, 30% glicerolo, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 tampone con 1% di DTT durante e dopo 15 min con 4,7% di iodoacetamide nello stesso tampone ma senza DTT.
- Seconda dimensione o SDS-PAGE elettroforesi. Effettuare le sei 12% gel SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% di acrilammide / bisacrylamide, 0.1% (w / v) di SDS, 0,072% (w / v) APS e 0,1% (v / v) TEMED ) Allo stesso tempo utilizzando un grande sistema 2D, con quattro lastre di vetro a bassa fluorescenza per la strips con campioni di fluorescenza e altri due lastre di vetro con 1,5 mm di spessore per i gel preparative, al fine di asportare le macchie proteiche.
- Caricare i sei IPG strisce sulla cima dei gel e più strati con 0,5% (w / v) di agarosio. Tampone di corsa è composta da 25 mM Tris, glicina 192 mM e 0,1% (w / v) di SDS. Eseguire la migrazione a 2,5 W / gel durante la notte con un sistema di refrigerazione impostato a 4 ° C 16,17.
- Immagini di fluorescenza acquisizione e l'analisi. Utilizzare uno scanner Typhoon 9400 per ottenere le immagini gel di fluorescenza (12 immagini per un esperimento). Scan Cy2, Cy3 e Cy5 immagini per ogni gel a 488/520 nm, 532/580 nm e 630/670 nm di eccitazione / lunghezze d'onda, rispettivamente. Utilizzare il software informatico per analizzare le immagini. I dati sono rappresentativi delle variazioni di volume posto associati alla distribuzione del segnale di tutti i quattro gel tra i due campioni studiati.
- Coomassie colorazione per i grandi gel. Fissare il gel di preparazione in 50% (v / v) EtOH e 3% (v / v) di acido ortofosforico per almeno 24 ore. Poi, dopo, lavare due volte con acqua ultra pura per 20 min. Eseguire colorazione in 34% (v / v) metanolo, 17% (w / v) di solfato di ammonio e acido ortofosforico 2% per 1 ora prima di aggiungere 0,1% (w / v) Coomassie Blu G-250. Tenere i gel nella colorazione per almeno 48 ore e decolorati in acqua ultra pura.
- Spot per l'identificazione MS. Una volta che le immagini di fluorescenza vengono analizzate, il software fornisce un elenco di punti la cui espressione è statisticamente diverso. Asportare manualmente queste macchie dai gel di preparazione. Questa procedura richiede pratica e una certa destrezza manuale per evitare contaminazione cheratina. Poi i campioni possono essere mantenuti in acqua a -20 ° C fino invio di MS. Identificazione Spot è perfettamente compatibile con spettrometria di massa tandem (MS / MS) e la rilevanza delle identità di proteine è giudicata in base al punteggio Mowse basato calcolato con un p-value di 0,05 (p <0,05) 18 probabilità. </ Ol>
3. Qualitativa Mini-2DE Assay
- Risospendere massimo 100 pg di proteina in tampone campione 2D fino a un volume finale di 200 microlitri di una striscia IPG 11 cm. Nel caso di sistema sovraespressione o proteina purificata, l'importo di partenza può essere abbassata a 20 mg.
- Aggiungere 1,1% (v / v) Destreak reagente, 0,55% (v / v) di tampone di IPG e tracce di blu di bromofenolo in un volume finale di 200 microlitri. Poi, vortice, fare un giro veloce e caricare in una striscia IPG per la reidratazione passiva (per portare il nastro al suo spessore originale) durante la notte coperto con olio minerale. Nota: la percentuale di buffer di IPG è la stessa per tutti l'intervallo di pH desiderato (pH 3-11, 4-7, 7-11, ecc), ma la sua composizione varia in funzione del campo di pH selezionato.
- Isoelectrofocalisation. Eseguire IEF a 20 ° C. La durata del programma dipende dall'intervallo di pH selezionato. Degno di nota, parametri come elettroendosmosi possono disturbare il profilo IEF e in questi casi,ottimizzazione in tempo electrofocalisation è necessaria 19. Nota: non è necessariamente un IEF più che fornisce risultati migliori ma accorciare il tempo di IEF può anche migliorare la risoluzione. Dopo IEF, strisce IPG possono essere conservati a -20 ° C per mesi.
- IPG strisce di equilibrio. Equilibrare le strisce in un tampone contenente 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glicerolo, 5% SDS, 0,05% blu di bromofenolo. Fai tre equilibratura bagna per 15 minuti con il cambiamento la soluzione tampone tra ogni bagno.
- SDS-PAGE. Strato strip IPG su gel prefabbricato (IPG +1 ben 11 centimetri striscia IPG) con una percentuale di poliacrilammide scelto a seconda del MW della proteina di interesse. Poi, asciugare il gel su una membrana di nitrocellulosa / PVDF a 100 mV durante 33 min.
- Incubare per una notte con l'anticorpo richiesta e visualizzare per attività perossidasi. Eseguire gli allineamenti di immunoblots usando polipeptidi indipendenti rivelate dal anticorpo secondario. Raggiungere un semi-quantitative analisi densitometria del volume e l'intensità delle tracce / spot con il software ImageJ.
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Representative Results
Proteomica sul tessuto cerebrale rimane difficile poiché nessun tampone ideale esiste per recuperare il 100% di proteine, proteine del citoscheletro soprattutto associata alla membrana o. La prima serie di esperimenti si sono concentrati sulla ricerca di un tampone di lisi adatto compatibile con i due approcci e che consente di recuperare un grande pannello di proteine. Così, tre buffer di lisi sono stati analizzati per determinare la più appropriata. In primo luogo, è stato utilizzato il buffer comune biologia molecolare e biochimica Tris-HCl 20 mM a 10 con 1% (w / v) di SDS (Figura 1A). Inoltre, Tris-HCl ha un'applicazione robusta come buffer per elettroforesi di poliacrilammide e gel di agarosio. Gli altri due buffer di lisi erano UTS (Figura 1B) e la 2DE uno. Tris-SDS cedere una risoluzione scarsa e il numero di punti sono stati notevolmente abbassata (figura 1B) in confronto con il profilo osservato con UTS, dove una separazione punto alto, senza distorsione e una far migliore recupero delle proteine sono stati osservati (Figura 1B). Questo punto è confermato dal fatto che le rese di estrazione UTS pochissimo pellet residuo, mentre Tris-HCl deve una spessa uno dopo panca centrifugazione. Il modello mostrato nella Figura 1B dà chiaramente prova della maggiore solubilità della proteina in UTS riguardanti altri buffer come Tris-HCl. Notheworthy che il buffer anche 2DE è stato anche testato, il suo uso è stato escluso in quanto, nonostante pellet non è stata osservata, lipidi non sono stati sciolti e rimasero nello strato superiore difficulting la manipolazione. In accordo con questi dati, si consiglia l'uso di buffer di UTS per diversi motivi 1) la sua caotropo neutro che denatura le proteine interrompendo legami nonconvalent e ionici tra i residui di aminoacidi e di evitare l'attività della proteasi che degradano le proteine cellulari 21 2) Inoltre di tiourea per la soluzione di urea aumenta drasticamente la solubilità delle proteine di membrana idrofobicae proteine inclini alla aggregato 22, 23 e 3) l'aggiunzione del detergente anionico SDS rompe i lipidi legano proteine tramite interazioni idrofobiche, così come aumenta proteasi e fosfatasi inibizione 24,25. Inoltre si è deciso di aggiungere un passaggio di precipitazione per eliminare impureties che possono disturbare l'IEF. In questo modo, come metodo di precipitazione determina la solubilità delle proteine 26 e metanolo è già stato descritto come il solvente più adatto per rimuovere i lipidi che sono abbondanti nel tessuto cerebrale, ci ha portato a scegliere il cloroformio / metanolo precipitazione 27. L'utilizzo dei CHAPS zwitterionici detergenti (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propano solfonato) per risospendere le proteine pellet nel buffer 2D è dovuto alla sua idoneità per facilitare l'ingresso proteina nella prima dimensione passo 28.
Il profilo del pr cervello umano e topioteome da 2D-DIGE è mostrato nelle Figure 2A e 2B, rispettivamente. Nella Figura 2A fusa immagini fluorescenti provenienti dal controllo umano e campioni AD corteccia si possono osservare, nella figura 2B idem per i topi campioni di ippocampo di un modello di AD-come Tau patologia 29. Cy2, Cy3 e Cy5 sono rispettivamente illustrati per i campioni umani delle figure 2C-2E. Entrambi i modelli incorporate (Figura 2A e 2B) presentano un'elevata risoluzione macchia riflette una IEF alta qualità e seconda separazione dimensione in accordo con il profilo osservato in Figura 1B. Questa qualità definizioni loco unitamente al fatto che la reticolazione viene eseguita per eliminare una possibile preferenza delle proteine di un particolare cianina, rendere queste immagini di fluorescenza (figure 2C-2E) molto facile da allineare tutta l'analisi software. Inoltre, il gel di preparazione macchiate di blu Coprove omassie una mappa proteina arricchita con macchie abbondanti in tutto il range di pH utilizzato, permettendo di accise le macchie dopo l'analisi del software e per la loro identificazione posteriore da MS / MS.
La mini analisi 2DE qualitativa mediante immunoblotting per una proteina fornisce informazioni di alto valore per la sua identificazione e modifiche, non solo per quelle post-traduzionali, ma anche per oligomeri e troncamenti (Figure 3A e 3B). La fattibilità per eseguire questa tecnica in mini 2DE fornisce dati rapide e precise circa la proteina di interesse. Per quanto riguarda il tessuto da un paziente affetto da demenza Lewy (LBD), la caratterizzazione di alfa-sinucleina permette di visualizzare un pH 4-7 profilo ben definito dove la proteina nativa è ad un pI di 4.67 e un MW di 18 kDa, comunque con mini-2DE può essere visto più la presenza di dimeri (Figura 3A, asterisco) Allo stesso pI rispetto alle forme native ma anche l'esistenza di ubiqforme uitinated che sono più di base e con un MW maggiore quando più ubiquitinato sono (Figura 3a, frecce). Un'altra proteina intimamente legata alla AD è il peptide beta-amiloide, generato dal complesso catabolismo della proteina precursore dell'amiloide (APP). Nella figura 3B viene confrontato la trama di un caso AD sporadico con uno familiare. In caso di AD familiare si può osservare come beta-amiloide 1-42 viene diminuita rispetto alla AD sporadico, e inoltre, i isovariants amiloide-beta x-42 (4 kDa) sono anche sottoregolata tutto il gap , nel frattempo gli oligomeri trovati alla 8 kDa che riflettono questo fatto non è dovuto ad una minore quantità di proteina, in quanto l'intensità macchie è più rilevante in AD familiare (Figura 3B).
Figura 1: 2DE proFile dopo 10 mM Tris 1% SDS w / v tampone di estrazione (A) e il pattern ottenuto dopo utilizzazione UTS (B). Nel pannello B si può vedere come il numero di punti, l'intensità e la risoluzione è molto più elevata di quella del pannello (A). L'uso di UTS permette una estrazione di proteine quasi totale che si riflette nella colorazione 2DE Coomassie. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2: sono illustrati i profili 2D-DIGE per uso umano (A) e topi (B) Immagini (A) e (B) rappresentano le immagini fuse per i tre cianine in un intervallo di pH 3-11 18 centimetri striscia.. Nelle immagini (C), (D) e (<strong> E) cianine sono esposte in modo indipendente (Cy2 in blu, in verde Cy3 e Cy5 in rosso). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3: Nel pannello superiore si può osservare il profilo mini-2DE della proteina alfa sinucleina in un paziente LBD Il pI nativo (4.4) e MW (18 kDa) variazione in funzione della dimerizzazione (asterisco) se la MW. è il doppio, e ubiquitinazione che sposta il pI finché uno più base (frecce) (A). L'immagine in basso mostra il profilo di un peptide beta-amiloide anticorpo in un caso sporadico e genetica di AD. 2DE modello mostrano come oligomerizzazione e il degrado si svolgono in modo diverso a seconda della eziologia della disease. Questo immunoblot indica chiaramente le differenze nel catabolismo APP tra le due condizioni. Da un lato si ha un aumento nei prodotti catabolici nel nella AD sporadico riguardo quello familiare (frecce), mentre gli oligomeri sembrano essere meno marcata (B). Questi esperimenti sono stati condotti in 11 centimetri strisce in una lacuna 4-7 pH in un gel Bis-Tris 12% e in un 16,5% Tris-Tricina uno, rispettivamente (A, B). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Scoprire cambiamenti di espressione di proteine patologiche, la ricerca dei biomarcatori e la modulazione dei potenziali percorsi di bersagli farmacologici sono tra gli obiettivi delle neuroproteomics avvicina 30. Tra gli strumenti emergenti, il campo 2DE aggiunge un expectative promettente. Tuttavia, un consenso dovrebbe essere raggiunto per minimizzare la variabilità e aumentare la riproducibilità negli esperimenti. In linea di questa idea un protocollo standardizzato effettuare 2D-DIGE (Figura 2) e la successiva 2DE immunoblotting (Figura 3) per l'uomo e topo tessuto cerebrale pienamente compatibile con mono-dimensionale immunoblotting è qui descritta in dettaglio.
Uno dei più grandi dilemmi nella proteomica è la scelta tampone di solubilizzazione. Per aumentare la riproducibilità tra i diversi approcci, UTS è stata scelta in quanto è completamente compatibile con la IEF. Inoltre, tampone di estrazione UTS produce alcun pellet o davvero un lieve uno dopo centrifugazione a 12.000 xg (da non confondere con la precipitazione SDS a 4 ° C). Questo è un punto cruciale presa in considerazione che molte malattie neurodegenerative proteine presenti aggregazione, tra cui AD. Il fatto che non vi è alcuna pellet semplifica il rendimento e l'interpretazione dei dati, in quanto non esistono studi indipendenti dovrebbe essere fatto per frazione solubile e non solubile.
Qualunque sia approcci 2D-DIGE o mini-2D stanno per essere eseguite, ci sono alcune limitazioni che devono essere indicate. In primo luogo le proprietà chimiche del buffer UTS, questa soluzione non devono essere scaldati, o carbamilazione verifica di ammine primarie e possono quindi interferire sia con accoppiamento cianina colorante e profilo 2D, peggioramento risoluzione macchie alterando IEF 15. In secondo luogo, gli intervalli di pH disponibili, al giorno d'oggi l'intervallo di pH più ampia è tra 3 a 11, questo fattore unito alla probabilità che non tutte le proteine entrata sulla striscia IPG può explain le bande di proteine accatastati in entrambi i lati dei gel dopo colorazione. Questa limitazione potrebbe esporre il motivo per cui non l'intero proteoma può essere studiato da 2D. Un'altra limitazione importante è l'uso controversia della precipitazione. Da un lato, è raccomandabile fare la fase di precipitazione con cloroformio / metanolo che permette di ridurre in modo efficiente il contenuto lipidico 27, sali, acidi nucleici e detergenti cariche che potrebbero interferire con i parametri IEF e influenzare la risoluzione e / o riproducibilità 2D. Inoltre, d'altro canto non si può escludere che alcune proteine fortemente attaccati alla membrana possono essere persi. Tuttavia, nel caso che altri buffer di estrazione sono utilizzati al posto di UTS, con o senza aggiunta di proteasi o inibitori di fosfatasi, l'uso della fase di precipitazione è altamente raccomandato per eventuali insidie durante IEF. Infine, è da notare che le immagini 2D-DIGE analisi presenta l'inconveniente che sovrappone fluorescenzamacchie possono portare ad una perdita di informazioni, dal momento che per l'analisi software non considerare questo come una variazione significativa.
La novità di questo metodo combinato risiede nella loro caratterizzazione riproducibilità, versatilità e proteine. Solo un tampone di estrazione consente di eseguire due tecniche complementari. 2D-DIGE fornisce informazioni quantitative su proteine cambiamenti di espressione e la loro successiva identificazione mediante MS / MS. Tuttavia, è possibile che le isoforme isovariants, zimogeni, modificazioni post-traduzionali e prodotti catabolici non potevano essere identificati poiché la fluorescenza sovrapposta con altre proteine. Per superare questa limitazione si propone in parallelo l'uso di mini-2DE. Infatti, a nostra conoscenza una delle trabocchetto più importante che possono essere impegnate è prendere il immunoblotting mono-dimensionale una convalida completa dei risultati 2D-DIGE, o anche considerare che qualsiasi modifica proteomica non è necessario confermare. Furthermore, vantaggi tecnici di mini 2DE sono: 1) la possibilità di utilizzare piccoli sistemi SDS-PAGE, 2) il materiale relativamente basso necessario, 3) le ampie gamme di pH a disposizione, 4) la sensibilità immunoblot e 5) la semplice stima del modifiche. Gli aspetti più esigente della tecnica mini 2DE è la quantificazione, nonostante mini-2DE non può essere considerato un approccio quantitativo, dopo macchie o piazzole allineamento è possibile stabilire un rapporto tra la parte acidi e basici o viceversa, fornendo in questo modo una certa stima dei cambiamenti osservati 9.
Numerosi dati di letteratura accurato l'uso mini-2DE realizzare caratterizzazione delle proteine, ad esempio per le proteine overexpressed con e senza modificazione post-traduzionale 31, oligomerizzazione e degradazione percorsi descritti per la demenza con corpi di Lewy 32,33 e nella Figura 3A per un AD paziente. Un altro esempio delle informazioni fornite dal m ini 2DE è il troncamento di beta amiloide specie effettuati in casi di AD e non affetti da demenza come un potenziale bersaglio per l'approccio alla vaccinazione 34. La presenza di oligomeri e la sua degradazione differenzialmente è anche mostrato in Figura 3B seconda un paziente AD sporadico o familiare. Inoltre, l'approccio mini 2DE si apre un ampio e pratico finestra di possibilità dal momento che diversi trattamenti possono essere eseguiti. Ad esempio nel campo della AD, inibitori di fosfatasi possono essere aggiunti e scoprire il loro impatto in Tau fosforilazione. Anche l'effetto farmacologico farmaci sulle vie proteolisi, dato che pI e identificazione MW delle forme troncate possono fornire il sito di taglio secondo epitopo della anticorpo 34. È interessante notare che, dati recenti hanno chiarito utilizzati mini-2DE l'associazione di stile di vita e trattamenti farmacologici con deficit cognitivi in modelli murini, così come il profilo biochimico di una nuova mutazione Tau 35-37.
S copi "> Lo sviluppo di un metodo che consenta il 2D-DIGE del tessuto cerebrale ottenere di origine umana o del mouse, nonché la convalida utilizzando mini-2DE dietro, può far luce nel scoprire nuovi bersagli farmacologici e biomarcatori per lo studio delle malattie neurologiche. Il fatto che questi disturbi hanno origine nel cervello, obbliga a studiare questo organo come fonte di informazioni ideale. Tuttavia, campioni umani sono limitati, quindi l'uso di modelli animali diventa indispensabile per raggiungere questo obiettivo. qui l'importanza di utilizzare approcci in parallelo per entrambi i tipi di campioni e convalidare i risultati. È auspicabile che nel prossimo futuro candidati affidabili saranno trovati e testati nei fluidi corporei come il plasma e liquido cerebrospinale per stabilire una diagnosi precoce, la valutazione della progressione della malattia e infine la valutazione dei trattamenti plausibili disponibili.Fasi critiche all'interno del protocollo devono essere presi in considerazione per la sua Adattale applicazioni. Nel caso di 2D-DIGE, qualità campioni di prova è un punto cruciale. Questo test permette di conoscere le proteine profilo e convalidare la reale quantità di proteine di estratto di esistente nel buffer 2D dopo la precipitazione. Profili Stained ci danno informazioni riguardanti la qualità e l'omogeneità tra i campioni. Solo i campioni con modelli simili devono essere utilizzati per gli studi 2D-Dige, altrimenti il 2D-DIGE può portare a scarsa colorazione e la scarsa risoluzione del profilo proteico. Le differenze in questi modelli campioni sono più comuni in umano che nel tessuto cerebrale del mouse, dal momento che i campioni di cervello umano per accordo di ricerca con molti scomodo 38,39. Inoltre, l'identificazione di degradazione della proteina causa intervallo post-mortem è stato già riportato da 2D-DIGE 40,41. Verifica del pH prima dell'etichettatura cyanine colorante, questo passaggio deve compromettere tutte le procedure posteriore. Etichettatura colorante Cyanine e SDS-PAGE elettroforesi dovrebbe essere fatto al buio comepiù possibile per non influenzare etichettatura fluorescenza. Infine, gel di poliacrilammide devono essere il più omogeneo possibile tra loro, al fine di eliminare inter-variabilità durante la migrazione elettroforetica e facilitare motivi si sovrappongono e analisi posteriore 42,43.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Inserm, dell'Università di Lille 2, MEDIALZ, LABEX (laboratorio di eccellenza, programma di investire per il futuro) e DISTALZ (sviluppo di strategie innovative per un approccio transdisciplinare alla malattia di Alzheimer). FJ.FG è attualmente una borsa destinatario di ANR (francese Agenzia Nazionale di Ricerca / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), ma questo lavoro è stato anche sotto il supporto di una sovvenzione da parte del JCCM (Spagna).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
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