Summary
Ett vanligt proteinutvinning protokoll med hjälp av urea / tiourea / SDS-buffert för människa och mus hjärnvävnad möjliggör identifikation av proteiner genom 2D-DIGE och deras efterföljande karakterisering av mini 2DE immunoblotting. Denna metod gör det möjligt att få mer reproducerbara och tillförlitliga resultat från humana biopsier och experimentella modeller.
Abstract
Två-dimensionell gelelektrofores (2DE) är ett kraftfullt verktyg för att avslöja proteome ändringar potentiellt relaterade till olika fysiologiska eller patologiska tillstånd. I grund och botten är denna teknik bygger på separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkt i ett första steg och för det andra i enlighet med deras molekylvikter med SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). I den här rapporten en optimerad provberedningsprotokoll för liten mängd humant efter slakt och mus hjärnvävnad beskrivs. Denna metod gör det möjligt att utföra både tvådimensionella fluorescens skillnad gelelektrofores (2D-DIGE) och mini 2DE immunoblotting. Kombinationen av dessa metoder gör att man kan inte bara hitta nya proteiner och / eller protein ändringar i sina uttryck, tack vare dess förenlighet med massdetektering spektrometri, men också en ny insikt markörer validering. Således, mini-2DE kopplad till västra läsk tillstånd för att identifiera och validera inläggetTranslationella modifieringar, proteiner katabolism och ger en kvalitativ jämförelse mellan olika förhållanden och / eller behandlingar. Häri, tillhandahåller vi en metod för att studera komponenterna i proteinaggregat som finns i AD och Lewy body demens, såsom amyloid-beta-peptiden och den alfa-synuklein. Vår metod kan således anpassas för att analysera proteomet och olösliga proteiner extrakt från human hjärnvävnad och musmodeller också. Samtidigt kan det ge användbar information för studier av molekylära och cellulära involverade i neurodegenerativa sjukdomar samt potentiella nya biomarkörer och terapeutiska mål.
Introduction
Psykiska och neurologiska sjukdomar utgör 13% av den globala sjukdomsbördan, måste nya utmaningar som patofysiologiska mekanismer, riskfaktorer och prodromal biomarkörer utforskas 1. I linje med detta mål, proteomik studier av den mänskliga hjärnan blivit oumbärlig för att avslöja molekylära vägar som är inblandade i processer som minne, beteende, känslor och neuronal plasticitet till exempel, inte bara för fysiologisk utan också för patologiska tillstånd. Därför är användning av djurmodeller och mer specifikt transgena möss, ger en mängd möjligheter att härma etiologin av humana neurodegenerativa störningar 2.
Proteomik metoder är numera tillgängliga för att uppnå dessa nya perspektiv inom neurovetenskap fältet. Tvådimensionell gelelektrofores (2DE) är en potent och sannolikt enkel metod som gör det möjligt att jämföra proteomet av ett brett spektrum av prov. Dessutom är det också enkraftfull metod för att isolera ett protein från en komplex blandning i syfte att identifiera och ytterligare analysera genom masspektrometri. Denna teknik består i huvudsak i två på varandra följande steg: 1) proteinseparation i enlighet med deras isoelektriska punkt (pl) av isoelectrofocusing (lEF). Mer exakt, är en elektrisk potential appliceras över remsor på Immobiline akrylamid bland en pH-gradient och sedan proteiner kommer att migrera och fokusera på en bestämd pl i funktion av deras globala nettoladdning. 2) isoelektriskt fokuserade proteiner denatureras och negativt laddad genom tillsättning av natriumdodecylsulfat (SDS), och därigenom proteiner i deras första strukturen separeras beroende på deras skenbara molekylvikt (MW) genom SDS-PAGE 3. Dessa två distinkta egenskaper tillåter oss att ta itu med ett dubbelt värde att gå vidare i studien av proteomet. Å ena sidan ger denna metod möjlighet att utföra en kvantitativ analys med minimala färgämnen 2D-DIGE metoden, och å andra sidan en qualitative analys av mini-2DE kopplad till western blotting.
Kvantitativ analys av 2D-DIGE skänker proteinuttryck förändras hela prov proteome. I korthet är prover märkta med tre cyaniner (CY2, Cy3 och Cy5) avger vid tre olika våglängder (blått, grönt och rött). Dessa fluor minimala färgämnen, som innehåller N-hydroxi succinimidylester grupp reagerar med ε-aminogruppen i lysin-rester i proteiner som resulterar i kovalenta amidbindningar 4. Lysinresterna märks endast mellan 1-3% och därmed förhindra flera etiketter tillägg per protein och stora nettoladdnings ändringar 5, 6. Cy3 och Cy5 används ofta för att märka två oberoende urval medan Cy2 taggar en blandning av lika delar av proverna att jämföra. De två främsta fördelarna är att alla märkta proverna blandas och IEF och SDS-PAGE utförs i en gel på en gång för varje steg, undvika bland variationsrikedomen bland experiment på grund av geler jämförelse. Dessutom har den en hög tröskel på cirka 1 femtomol protein 7 upptäckt. Gel skannas och 2D-programvara jämför 2D gel fluorescens bilder, där Cy2 fungerar som en inre standard möjliggör identifiering av statistiska skillnader mellan platserna för deras bakre identifiering av masspektrometri. 2D-analys programvara med hjälp av intern standard uppnår en snabb upptäckt av mindre än 10% av skillnaderna mellan prover med mer än 95% av statistisk konfidens 8.
Kvalitativ analys av mini-2DE är ett avgörande steg för proteinkarakterisering. Principen är densamma som tidigare beskrivits för pl och MW-separation, men i detta fall proteiner överförs från ett litet polyakrylamidgel till ett membran och immunoblotting utföres efteråt. Medan en dimension gelelektrofores ger förändringar i proteinuttryck för ett eller flera protein epitoper i funktion av den antikroppen, INFORMATIOn mini-2DE förser med ytterligare två parametrar. För det första de protein isovariants förändras som funktion av pl, vilket anger att posttranslationella modifieringar kan äga rum. För det andra kan samlas identifiering spektrometri tyda på rimliga zymogener och katabola produkter av proteiner. , Modifieringar observeras av 2D-DIGE är därför sannolikt ett tecken på de mekanismer som ligger bakom förändringarna i den globala proteome profilen. Anpassningar av immunoblots bland flera prover för samma protein epitop / s genom mini-2DE kan återspegla surhetsgraden förändringar sprider ljus i post-translationella variationer lätt observeras eller ens genom monodimensional immunoblottning 9, 10. Dessutom informerar denna analys om de potentiella klyvningsställen på grund av kunskapen om pl och MW de metaboliska rester 11,12.
Kombinationen av dessa två tekniker ger en komplementär proteomik analys. Å ena sidan 2D-DIGE ger en type av skillnader som möjliggör en exakt isolering av polypeptider vars uttryck är olika. Dessa skillnader består i huvudsak i utseende eller försvinnandet av en plats eller ökning / minskning av intensiteten i en viss en och programvara analys av fluorescerande geler. Emellertid är dessa observationer i sig är osannolikt att förklara vilket slag av modifiering observerades. Av dessa skäl, när polypeptiden isoleras och identifieras med masspektrometri, användning av mini-2DE gör det möjligt att exakt bekräfta 1) identiteten av proteinet isoleras och 2) vilken typ av skillnad: förändring av isovariant / isoform nivå uttryck, post-translationella modifieringar och klyvningsprocesser till exempel. Det är dock nödvändigt att utveckla en startlyseringsbuffert både kompatibel med 2D-DIGE och med mini-2DE för att begränsa de potentiella dispersioner följd av användningen av utvinningsprotokoll som är mycket olika.
I denna artikel har vi debeskrivs ett anpassat protokoll för beredning, utvinning och prestanda för 2D-DIGE och mini-2DE tekniker för hjärnproteiner som kommer från människa och mus vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Homogenisering och Total Protein Extraction från Human och mus hjärnvävnad
- Hjärnvävnad homogenisering. Homogenihjärnvävnaden 10% (vikt / volym) i 8 M urea, 2 M tiokarbamid och 1% vikt / volym SDS-buffert (UTS) med användning av en Potter-glas (för prover från människa) eller Teflon-homogenisator (till möss proven). Sonikera vid 60 Hz 30 pulser med en ultraljudsgenerator ansöker 0,5 sek för total vävnad sönderfall 13, 14.
- Bestäm proteinkoncentrationen med Bradford-analysen, med användning av BSA som standard. Detta UTS buffert utvinning är helt kompatibel med en dimension SDS-PAGE så länge lysat inte är överhettad att undvika karbamylering 15.
- Lägg 1% (vikt / volym) av Amberlite och inkubera under försiktig blandning under 10 min vid rumstemperatur. Därefter filtrera på 0.22 um sprutfilter och slutligen lägga SDS till urea / tiourea lösning. Detta steg minskar mängden urinsyra och isocyansyra, vilka kommer i equilibrium med urea i lösning och underlätta dess nedbrytning.
- Kloroform / metanol proteinutfällning. Fällning mellan 100-150 pg av protein för 11 cm IPG Strips och 1-1,5 mg till 18 cm och kära (oberoende om det pH-område som valts för att utföra IEF).
- Utför alla stegen på is eller vid 4 ° C. Cool kloroform och metanol vid 4 ° C under 30 min före start av utfällning förfarandet.
- Lägg tre volymer metanol och en volym kloroform till en volym av UTS lysat. Skaka manuellt blandningen och tillsätt tre volymer av kallt vatten. Vortex under 1 min och pelletering av proteiner genom centrifugering vid 12000 x g under 30 min vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten med användning av en Pasteur-pipett och tillsätt tre volymer kall MeOH. Vortexa och centrifugera igen vid 12000 x g under 30 min vid 4 ° C. Slutligen kassera supernatanten och torka pelleten under N2.
- Beredning av proteiner för 2D-analys.Resuspendera den protein torkades pelleten i 2D-buffert (8 M urea, 2 M tiourea kompletterat med 4% CHAPS). Tvätta lösningen med Amberlite enligt ovan och försöka hålla den andel av 500 mikrogram protein per 200 l av 2D-buffert för 2D-DIGE. Anmärkning: 2D-buffert kan förvaras vid -80 ° C eller hölls vid 4 ° C under en vecka (för att förhindra karbamid nedbrytning).
- Sonikera och lagra proverna vid -80 ° C fram till att utföra följande steg. Anmärkningsvärt, kan detta protokoll användas efter myrsyra görande av proteinaggregat 10. Kortfattat, indunsta myrsyra under N2 och suspendera pelleten såsom beskrivits.
2. 2D-DIGE
- Prover testa kvaliteten. Dos prover igen med Bradford-metoden. Späd 15 | ig av proteiner i LDS provbuffert, värm vid 37 ° C 15 och lasta på 4-12% polyakrylamidgeler.
- Coomassie-färgning. Fläck polyakrylamidgel med 0,1% (vikt / volym) CoomassieBlue G-250, 50% EtOH och 10% (v / v) ättiksyra-lösning under minst 1 timme. Låt bakgrund Avfärga över natten i 7% ättiksyra och 10% (v / v) etanollösning.
- Pre-elektro märkning av prover. Innan du utför cyaninfärgämne märkning, kontrollera pH-värdet i provet, som bör vara grundläggande eller ens neutral, eftersom N-hydroxi-substitution är effektivare vid basiskt pH och ges för att vara optimal vid pH 8,6.
- Märk minimalt de två prover av studier med Cy3 eller Cy5 fluorescerande färger med ett förhållande på 50 mikrogram protein/400 pmol färgämne och hålla under 1 h vid 4 ° C i mörker för att underlätta NHS ester reaktiva gruppen av cyaniner med oprotonerad amin grupper av lysiner.
- Minska prov variationer gör en tvär märkning med Cy3-och Cy5-färgämnen, undvika en förmånlig koppling av ett prov till en viss cyanin. Lägg märke till att cyanin-färgämne minimal märkning kan anpassas för liten mängd proteiner med att hålla proportionen av 1 | j, g perotein per 8 pmol cyanin-färgämne. Om så är fallet, kan mini-2DE system användas i stället för den stora 2D-gel-system. Detta gör det möjligt för 2D-DIGE analys för en liten mängd hjärnvävnad.
- Märk en pool av båda proven med samma mängd protein (50 mikrogram totalt) med Cy2 fluorescerande färg och användes som intern standard. Använd samma förhållanden som tidigare angetts.
- Komplett till en total volym 350 | al med 2D-buffert innehållande 1,1% Destreak reagens, 1,2% av IPG-buffert och spår av bromfenolblått den totala 150 pg av märkta proteiner (50 ^ g av Cy2, 50 ^ g av Cy3 och 50 | ig av Cy2). Utför detta steg i fyra exemplar med hjälp av fyra oberoende remsor. Dessutom förbereder två ytterligare icke-märkta band (en för varje prov) med 350 till 450 | ig protein för preparativa geler.
- Låt de sex laddade remsor täckta med mineralolja över natten för passiv rehydrering.
- Isoelectrofocusing. Utför lEF vid 206; C. För ett pH 3-11NL, 18 cm remsa protokollet är: max aktuella inställningen är 50 iA / band under åtta steg: 1) 150 V steg för 1 timme, 2) 200 V steg för 5 timmar, 3) 500 V lutning för 2 tim, 4) 1.000 V lutning för 2 timmar, 5) 2,000 V lutning för 2 timmar, 6) 4.000 V lutning för 2 timmar, 7) 8.000 V lutning i 2 timmar och 8) för totalt 24.000 V · hr steg . Efter lEF, sända överskottet av mineralolja under användning av kromatografi papper och förvara remsorna vid -20 ° C tills den andra dimensionen.
- IPG Strips jämvikt. Jämvikta remsor i 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6-buffert med 1% av DTT under 15 min och efter med 4,7% av jodacetamid i samma buffert men utan DTT.
- Second dimension eller SDS-PAGE-elektrofores. Gör de sex 12% SDS-PAGE geler (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% akrylamid / bisakrylamid, 0,1% (vikt / volym) SDS, 0,072% (vikt / volym) APS och 0,1% (vol / vol) TEMED ) på samma gång med hjälp av en stor 2D-system, med fyra låga fluorescens glasplattor för strips med fluorescens prover och två andra glasplattor med 1,5 mm tjocklek för förberedande geler för att skära proteinfläckar.
- Fyll på med sex IPG Remsor på toppen av gelerna och över skiktad med 0,5% (vikt / volym) av agaros. Rinnande buffert består av 25 mM Tris, 192 mM glycin och 0,1% (vikt / volym) SDS. Utför migration på 2,5 W / gel över natten med ett kylsystem inställd på 4 ° C 16,17.
- Fluorescens bilder och analys. Använd en Typhoon 9400 scanner för att få fluorescens geler bilder (12 bilder för ett experiment). Scan Cy2, Cy3 och Cy5 bilder för varje gel vid 488/520 nm, 532/580 nm och 630/670 nm excitation / emissionsvåglängder, respektive. Använd datoriserad mjukvara för att analysera bilderna. Data är representativa för de förändringar i spot volym i samband med fördelningen av signalen över de fyra geler mellan de två prov som studerats.
- Coomassie-färgning för stora geler. Fäst förberedande geler i 50% (volym / volym) EtOH och 3% (volym / volym) fosforsyralösning under minst 24 timmar. Sedan efter, tvätta två gånger med ultrarent vatten i 20 min. Utför färgning i 34% (vol / vol) MeOH, 17% (vikt / volym) ammoniumsulfat och 2% ortofosforsyra i 1 h före tillsats av 0,1% (vikt / volym) Coomassie Blue G-250. Håll gelerna i färg i minst 48 timmar och avfärgades i ultrarent vatten.
- Spots för MS identifiering. När fluorescens bilder analyseras, ger programmet en lista på ställen vars uttryck är statistiskt olika. Skära manuellt dessa fläckar från de förberedande geler. Denna procedur kräver övning och en del fingerfärdighet för att undvika keratin kontamination. Då proven kan förvaras i vatten vid -20 ° C fram till att sända till MS. Spot identifiering är helt kompatibel med Tandem-masspektrometri (MS / MS) och relevansen av protein identiteter bedöms utifrån sannolikheten baseras Mowse poäng beräknas med ett p-värde på 0,05 (p <0,05) 18. </ Ol>
3. Kvalitativ Mini-2DE-analys
- Resuspendera maximalt 100 | j, g proteinprov i 2D-buffert till dess att en slutlig volym av 200 | il för en 11 cm IPG strip. I händelse av överuttryck system eller renat protein kan utgångsbeloppet sänkas till 20 pg.
- Lägg till 1,1% (v / v) Destreak Reagent, 0,55% (vol / vol) IPG-buffert och spår av bromfenolblått till en slutvolym av 200 | il. Sedan, virvel, gör en snabb dragning och ladda i en IPG band för passiv rehydrering (för att föra bandet till sin ursprungliga tjocklek) över natten täckt med mineralolja. Anm: Andelen IPG buffert är densamma för alla intervallet pH önskas (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc.), men dess sammansättning varierar i funktion av pH-område som valts.
- Isoelectrofocalisation. Utför lEF vid 20 ° C. Den tid som programmet är beroende av pH-intervall som valts. Anmärkningsvärt, parametrar som elektroendosmos kan störa IEF-profil och i dessa fall,optimering i electrofocalisation tid krävs 19. Notera: det är inte nödvändigtvis en längre IEF som ger bättre resultat men förkorta tiden för IEF kan också förbättra upplösningen. Efter lEF kan IPG-remsorna lagras vid -20 ° C i flera månader.
- IPG remsor jämvikt. Jämvikta remsorna i en buffert innehållande 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glycerol, 5% SDS, 0,05% bromfenolblått. Gör tre jämvikt badar i 15 min med byte av buffertlösningen mellan varje bad.
- SDS-PAGE. Varva IPG strip på en prefabricerad gel (IPG en bra, 11 cm IPG band) med en andel av polyakrylamid väljs beroende på MW proteinet av intresse. Därefter, blot gelen på ett nitrocellulosa / PVDF membran vid 100 mV under 33 min.
- Inkubera över natten med erforderlig antikropp och visualisera med peroxidasaktivitet. Utför anpassningar av immunoblottar använda obesläktade polypeptider avslöjas av den sekundära antikroppen. Nå en halv quantittiva analys genom densitometri av volymen och intensiteten för spåren / fläckar med ImageJ programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteomics på hjärnvävnad fortfarande utmanande eftersom ingen idealisk buffert finns för att återvinna 100% av proteiner, speciellt membran-associerade eller cytoskeleton proteiner. Den första uppsättningen av experiment fokuserade på sökandet efter en lämplig lyseringsbuffert kompatibel med de två metoderna och som gör det möjligt att återvinna en stor panel av protein. Således var tre lys buffertar analyseras för att bestämma den mest lämpliga. För det första var det används den vanliga biokemiska och molekylärbiologi buffert Tris-HCl 20 vid 10 mM med 1% (w / v) SDS (Figur 1A). Vidare Tris-HCl har en robust ansökan som en elektroforesbuffert för polyakrylamid och agarosgeler. De andra två lys buffertar var UTS (Figur 1B) och 2DE en. Tris-SDS ge en dålig upplösning och antalet fläckar var betydligt sänkt (Figur 1B) i jämförelse med den profil som observerats med UTS, där en hög fläck separation, ingen distorsion och en far bättre återvinning av proteiner observerades (Figur 1B). Denna synpunkt stöds av det faktum att UTS extraktions utbyten nästan ingen resterande pellet, medan tris-HCl owes en tjock en efter bänk centrifugering. Mönstret visade i Figur 1B tydligt ger bevis på högre protein löslighet i UTS om andra buffertar såsom Tris-HCl. Notheworthy att även 2DE buffert testades också, var dess användning uteslutas eftersom trots pelleten varken observeras lipiderna inte upplöses och de förblev i det övre skiktet difficulting manipulation. I samförstånd med dessa uppgifter, rekommenderas användning av UTS buffert av flera skäl 1) sin neutrala chaotrop som denaturerar proteiner genom att störa nonconvalent och joniska bindningar mellan aminosyraresterna och undvika aktiviteten av proteaser som bryter ner cellproteiner 21 2) Dessutom tiokarbamid till urealösningen förbättrar drastiskt lösligheten av hydrofoba membranproteineroch proteiner som är utsatta för aggregat 22, 23 och 3) det adjunction av den anjoniska detergenten SDS bryter lipider binda proteiner via hydrofoba interaktioner, liksom ökar proteas och fosfatasaktivitet hämning 24,25. Vidare beslutades att lägga ett fällningssteg för att eliminera impureties som kan störa IEF. På detta sätt bestämmer som utfällningsmetoden lösligheten av proteinerna 26 och metanol har redan beskrivits som det mest lämpligt lösningsmedel för att avlägsna lipider som är rikligt förekommande i hjärnvävnad, tog det oss att välja den kloroform / metanol nederbörd 27. Utnyttjandet av de zwitterjoniska CHAPS tvättmedel (3 - [(3-kolamidopropyl) dimetylammonio]-1-propan-sulfonat) för resuspending proteinerna pellets i 2D bufferten beror på dess lämplighet för att underlätta protein entré i den första dimensionen steg 28.
Profilen på den mänskliga och mus hjärna proteome genom 2D-DIGE visas i fig. 2A och 2B respektive. I figur 2A fusione fluorescerande bilder som kommer från mänsklig kontroll och kan observeras AD cortex prover, i figur 2B idem för möss prover från hippocampus av en modell av AD-liknande Tau patologi 29. Cy2, Cy3 och Cy5 är respektive illustreras för de mänskliga prov i figur 2C-2E. Båda fusione mönster (Figur 2A och 2B) presenterar en hög plats upplösning avspeglar en högkvalitativ IEF och andra dimensionen separation i samförstånd med den profil observeras i figur 1B. Den här platsen definition kvalitet tillsammans med det faktum att tvärbindningen utförs för att eliminera en eventuell preferens av proteinerna till en viss cyanin, göra dessa fluorescensbilder (figur 2C-2E) mycket lätt att anpassa hela analysprogram. Dessutom, de förberedande geler färgas med blå Coomassie bevis en berikad karta protein med rikliga fläckar över pH-intervallet används, tillåter en att skära fläckarna efter programvaruanalys och för deras bakre identifiering av MS / MS.
Den kvalitativa mini 2DE analys genom immunoblotting för ett protein som ger värdefull information om dess identifiering och ändringar, inte bara för post-translation dem men också för oligomerer och trunkeringar (fig. 3A och 3B). Den möjligheten att utföra denna teknik i mini 2DE ger snabba och exakta uppgifter om proteinet av intresse. Beträffande vävnad från en patient drabbats av Lewy Body demens (LBD), karakterisering av alfa-synuklein gör det möjligt att visualisera en väl definierad 4-7 pH-profil där det nativa proteinet är en pl på 4,67 och en MW 18 kDa, ändå med mini-2DE det kan ytterligare ses närvaron av dimerer (Figur 3A, asterisk) på samma pl än de inhemska former, men också att det finns ubiquitinated former som är mer grundläggande och med en högre MW när mer ubiquitineras de är (Figur 3A, pilar). Ett annat protein intimt kopplade till AD är amyloid-beta-peptiden, som genereras av den komplexa katabolism av amyloidprekursorproteinet (APP). I figur 3B det jämförs handlingen i en Sporadisk AD fallet med en familjär ett. I fallet med den välkända AD kan det observeras hur amyloid-beta 1-42 minskas avseende på sporadisk AD, och dessutom de isovariants amyloid-beta x-42 (4 kDa) är också nedregleras hela gapet under tiden de oligomerer finns på 8 kDa reflekterar att detta faktum inte beror på en lägre mängd av proteinet, eftersom fläckar intensitet är mer relevant i välbekant AD (Figur 3B).
Figur 1: 2DE prOFile efter 10 mM Tris, 1% SDS vikt / volym buffert utvinning (A) och det mönster som erhållits efter UTS utnyttjandet (B). I panel B kan det ses hur antalet fläckar, intensitet och upplösningen är mycket högre än en av panelen (A). Användningen av UTS tillåter en nästan total proteinutvinning som den återspeglas i 2DE Coomassie färgning. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2: 2D-DIGE profiler för människa (A) och möss (B) illustreras bilder (A) och (B) representerar de sammanslagna bilderna för de tre cyaniner i en 3-11 pH-område på 18 cm remsa.. På bilderna (C), (D) och (<strong> E) cyaniner utsätts självständigt (Cy2 i blått, Cy3 i grönt och Cy5 i rött). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3: I den övre panelen kan det konstateras mini-2DE profilen av proteinet alfa-synuklein i en LBD patienten Personen pl (4.4) och MW (18 kDa) förändring i funktion av dimeriseringen (asterisk) där MW. är den dubbla, och ubiquitinering som skiftar pl tills en mer grundläggande en (pilarna) (A). Den ner bilden visar profilen på en amyloid-beta-peptid antikropp i en sporadisk och genetisk fall av AD. 2DE mönster visar hur oligomerisering och nedbrytning ske på ett annat sätt beroende på etiologin av disease. Denna immunoblot pekar tydligt ut skillnaderna i APP katabolism mellan de två villkor. Å ena sidan finns det en ökning av katabola produkter inom i sporadisk AD avseende familjär en (pilar), medan de oligomerer verkar vara mindre markant (B). Dessa experiment har utförts på 11 cm remsor i en 4-7 pH lucka i en 12% Bis-Tris gel och i en 16,5% Tris-Tricine en respektive (A, B). Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Upptäcka patologiska uttrycket ändras av proteiner, söka efter biomarkörer och modulering av potentiella vägar för farmakologiska mål är bland målen för de neuroproteomics närmar sig 30. Mitt i de framväxande verktyg, det 2DE fältet lägger en lovande expectative. Icke desto mindre bör ett samförstånd nås för att minimera variabilitet och öka reproducerbarheten i experimenten. I linje med denna idé ett standardiserat protokoll för att utföra 2D-DIGE (figur 2) och den efterföljande 2DE immunoblotting (Figur 3) för människor och möss hjärnvävnad fullt kompatibel med mono-dimensionell immunoblotting häri beskrivs i detalj.
En av de största dilemman inom proteomik är solubiliseringsbuffert valet. För att öka reproducerbarheten mellan olika synsätt, var UTS valdes eftersom det är helt kompatibel med IEF. Dessutom ger UTS extraktionsbuffert nej pellet eller en riktigt liten en efter centrifugering vid 12.000 xg (blanda inte ihop med SDS fällning vid 4 ° C). Detta är en avgörande punkt ta hänsyn till att många neurodegenerativa sjukdomar som före proteiner aggregering, inklusive AD. Det faktum att det inte finns någon pellet förenklar utförandet och tolkning av data, eftersom inga oberoende studier bör göras för lösliga och icke-lösliga fraktionen.
Oavsett 2D-DIGE eller mini-2D metoder kommer att genomföras, det finns vissa begränsningar som bör anges. För det första de kemiska egenskaperna hos UTS buffert, denna lösning får inte överhettas eller karbamylering sker på primära aminer och kan därför påverka både cyaninfärgämne koppling och 2D-profil, försämring fläckar upplösning genom att försämra IEF 15. För det andra, de tillgängliga pH-områden, numera det bredaste pH-intervallet är mellan 3 till 11, denna faktor förenad med sannolikheten att inte alla proteiner inträde på IPG-remsa kan Explain de staplade proteiner band i de båda sidorna av gelerna efter färgning. Denna begränsning skulle kunna förklara varför inte hela proteomet kan studeras av 2D. En annan viktig begränsning är den kontrovers användning av utfällningen. Å en sidan är det mycket rekommendabelt att göra utfällningssteget med kloroform / metanol som möjliggör att effektivt reducera lipidhalten 27, salter, nukleinsyror och laddade detergenter som kan störa IEF parametrar och påverka upplösning och / eller reproducerbarhet 2D. Dessutom är å andra sidan kan det inte uteslutas att vissa proteiner starkt fästa till membranet kan gå förlorade. Icke desto mindre, i det fall att andra utvinning buffertar används i stället för UTS, antingen med eller utan tillsats av proteaser eller fosfataser hämmare, användning av fällningssteget rekommenderas starkt till alla fallgropar under IEF. Slutligen är det värt att notera att 2D-DIGE bilder analysen presenterar de olägenheter som överlappade fluorescensfläckar kan leda till en förlust av information, eftersom till programvaruanalys inte anser detta som en betydande variation.
Det nya i detta kombinerade förfarande ligger i deras reproducerbarhet, mångsidighet och proteiner karakterisering. Endast en extraktionsbuffert gör att man kan utföra två kompletterande tekniker. 2D-DIGE ger kvantitativ information om proteiner uttrycket ändras och efterföljande identifiering av MS / MS. Emellertid är det möjligt att isoformer, isovariants, zymogener, post-translationella modifieringar och kataboliska produkter som inte kunde identifieras, eftersom den överlappade fluorescens med andra proteiner. För att övervinna denna begränsning föreslås parallellt användningen av mini-2DE. Faktum är att vi vet en av de viktigaste fallgrop som kan begås är att ta monodimension immunoblotting som en fullständig validering av 2D-Dige resultat, eller ens tänka på att någon proteomik ändring är inte nödvändigt att bekräfta. Furthermore, tekniska fördelarna med mini 2DE är 1) möjligheten att använda små SDS-PAGE-system, 2) den relativt låga materiella behov, 3) de breda sortiment av pH tillgängliga, 4) den immunblot sensibilitet och 5) den enkla uppskattning av förändringar. De kräsna aspekterna av mini 2DE teknik är kvantifiering, trots mini 2DE inte kan anses vara en kvantitativ metod, efter fläckar eller tomter anpassning är det möjligt att etablera ett förhållande mellan sura och basiska delen eller tvärtom, inredning på detta sätt en pålitlig uppskattning av förändringarna observerade 9.
Flera uppgifter i litteraturen korrekt användning mini-2DE att åstadkomma proteinkarakterisering, såsom överuttryckt proteiner med och utan post-translationell modifiering 31, oligomeriserings och nedbrytningsvägar som beskrivits för Lewykroppsdemens 32,33 och i figur 3A för en AD patienten. Ett annat exempel på den information som m ini 2DE är trunkering av beta-amyloid arter som utförs i icke-dementa och AD fall som ett potentiellt mål för vaccination strategi 34. Närvaron av oligomerer och dess differentiellt nedbrytning visas också i figur 3B beroende på ett sporadiskt eller välbekant AD patient. Dessutom öppnar mini 2DE synsätt en bred och praktiskt fönster av möjligheter eftersom olika behandlingar kan utföras. Till exempel när det gäller AD, kan fosfatasinhibitorer sättas och avslöja deras inverkan i Tau fosforylering. Även den farmakologiska droger effekten på proteolys vägar, med tanke på att pl och MW identifiering av de trunkerade former kan ge klyvningsstället enligt antikroppens epitop 34. Intressant nog har den senaste statistiken belysas med hjälp av mini-2DE anslutningen av livsstil och läkemedelsbehandling med kognitiva försämringar i musmodeller, samt den biokemiska profilen för en ny Tau mutation 35-37.
ntent "> Utveckling av en metod som gör det möjligt för 2D-DIGE av hjärnvävnad få från människa eller mus ursprung samt validering med hjälp av mini-2DE bakom, kan sprida ljus i upptäcka nya farmakologiska mål och biomarkörer för studiet av neurologiska sjukdomar. Det faktum att dessa sjukdomar har sitt ursprung i hjärnan, tvinga att studera detta organ som en idealisk informationskälla. Men mänskliga prov begränsade, så användningen av djurmodeller blir nödvändigt för att uppnå detta mål. Häri vikten av att använda metoder i parallellt för båda typerna av prov och validera resultaten. Det är önskvärt att inom en snar framtid pålitliga kandidater kommer att hittas och testas i kroppsvätskor såsom plasma och cerebrospinalvätska för att etablera en tidig diagnos, utvärdering av sjukdomsutveckling och så småningom utvärderingen av de rimliga behandlingar.Kritiska steg i protokollet måste beaktas för sin suitable ansökan. I fallet med 2D-DIGE, är proverna prov kvalitet en avgörande punkt. Det här testet kan att veta proteiner profil och validera den verkliga mängden protein extrakt som finns i 2D bufferten efter fällning. Missfärgade profiler ge oss information om kvaliteten och homogenitet mellan prover. Endast prover med liknande mönster måste användas för 2D-Dige studier, annars 2D-DIGE kan leda till dålig färgning och dålig upplösning av proteinprofilen. Skillnader i dessa prover mönster är vanligare hos människa än hos mus hjärnvävnad, eftersom den mänskliga hjärnan prover för forskning handlar om många obekvämt 38,39. Dessutom har identifiering av proteindegradering pga obduktion intervall redan rapporterats av 2D-DIGE 40,41. Kontroll av pH före cyaninfärgämne märkning måste detta steg försämra all posterior förfarandet. Cyaninfärgämne märkning och SDS-PAGE-elektrofores bör göras i mörker sommycket som möjligt för att inte påverka fluorescensmärkning. Slutligen måste polyakrylamidgeler vara så homogen som möjligt bland dem, i syfte att eliminera inter variabilitet under elektro migration och för att underlätta mönster lappar och bakre analys 42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Inserm, universitetet i Lille 2, MEDIALZ, Labex (excellens laboratorium, program investera för framtiden) och DISTALZ (Utveckling av innovativa strategier för en tvärvetenskaplig syn på Alzheimers sjukdom). FJ.FG är idag en mottagare gemenskap ANR (franska nationella forskningsinstitut / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), men detta arbete var också under stöd av ett bidrag från JCCM (Spanien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
