Summary
توفر هذه المقالة منهجيات تفصيلية لاستخدام ثلاثية الأبعاد (3D) فحوصات لتحديد سرطان الثدي غزو الخلية. على وجه التحديد، ونحن مناقشة الإجراءات المطلوبة لانشاء مثل هذه المقايسات، الكمي، وتحليل البيانات، فضلا عن أساليب لدراسة فقدان النزاهة الغشاء الذي يحدث عندما تغزو الخلايا.
Abstract
بات معروفا أن المكروية الخلوية والأنسجة والمنظمين الحرجة التي تؤثر على بدء الورم والتقدم. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت المصفوفة خارج الخلية (ECM) ليكون منظم تنتقد سلوك الخلية في الثقافة والتوازن في الجسم الحي. النهج الحالي لزراعة الخلايا على ثنائي الأبعاد (2D)، والنتائج الأسطح البلاستيكية في اضطراب وفقدان التفاعلات المعقدة بين الخلايا والمكروية بهم. من خلال استخدام ثلاثية الأبعاد (3D) المقايسات والثقافة، وضعت شروط للتفاعل الخلايا المكروية تشبه المكروية في الجسم الحي. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لزراعة خلايا سرطان الثدي في مصفوفة 3D الطابق السفلي بروتين الغشاء، لاثبات القدرة الثقافة 3D في تقييم غزو الخلايا في البيئة المحيطة. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش كيف يكون لهذه المقايسات 3D القدرة على دراسة فقدان إشارة molecules التي تنظم مورفولوجيا الظهارية بواسطة المناعية الإجراءات. مساعدة هذه الدراسات لتحديد تفاصيل الآلية الهامة في عمليات تنظيم الغزو، اللازمة لانتشار سرطان الثدي.
Introduction
الهجرة وغزو الخلايا الفردية أو الجماعية نوعان من السمات المميزة لمرض السرطان، والمطلوبة للانتشار النقيلي خلايا سرطان 1-4. قدرة الخلايا السرطان لبدء ورم خبيث يعتمد على قدرتها على الهجرة وغزو الأنسجة المجاورة في استخدام invadopodia للحط من الغشاء القاعدي الخلايا. Invadopodia ديناميكية نتوءات تدهور المصفوفة الأكتين الغنية التي تمكن تدهور المصفوفة خارج الخلية من خلال إطلاق سراح-مهينة مصفوفة البروتياز 5. غزو الخلايا السرطانية ينطوي على تدهور المصفوفة تليها الهجرة من الخلايا السرطانية، وهذا يترافق مع إعادة تنظيم ثلاثية الأبعاد (3D) بيئة مصفوفة 2. وبالتالي، لاختراق من خلال مصفوفة، خلية يجب تحويل شكله والتفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) 2.
الحفاظ على سلامة أنسجة الثدي يعتمد على المراقب المالي بإحكامالعمارة الأنسجة د منذ تقاطعات خلية ECM وخلية خلية التصاق تؤثر التعبير الجيني وتعطيل قطبية الظهارية يمكن أن تؤدي إلى ظهور السرطان 6-10. ومع ذلك، فإن معظم في المختبر الهجرة والغزو المقايسات مثل transwell المقايسات غرفة أو المقايسات الجرح للخدش هي ثنائية الأبعاد (2D)، وبالتالي إهمال هذه التفاعلات المعقدة بين الخلايا والبيئة المجاورة لها 3،6،8،11-14. تم الكشف عن الاختلافات المورفولوجية والوظيفية كبيرة بما في ذلك الاختلافات في التشكل الخلوي، والتمايز الخلوي، التصاقات خلية مصفوفة وأنماط التعبير الجيني عن طريق زراعة الخلايا في الثقافات 3D التي تفتقر عادة في المقايسات 2D 2،6،8،11. وبالتالي، يستخدم من المقايسات 3D هي مفيدة بشكل كبير في تلخص أكثر الفسيولوجية في الجسم الحي حالة، مما أدى إلى ترجمة أفضل النتائج آفاقا جديدة في مجال البحوث الأساسية إلى العيادة 6-10. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى، على الرغم من العديد من المزايا المكتسبة من استخدام الثقافات 3D، وهذا النموذج لا يمكن القبض على جميع من تعقيدات في الجسم الحي الورم المكروية التي تضم مختلف أنواع الخلايا. ومع ذلك، فمن الممكن لدمج الخلايا اللحمية في نماذج 3D (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الكريات البيض، والضامة) لدراسة تأثير التفاعلات للورم اللحمية على التصاق الخلايا السرطانية والغزو 15-17.
خلايا الثدي الظهارية في الثقافة تنمو أكثر فعالية عندما البروتينات ECM مثل laminin والكولاجين موجودة. مع هذا معروف، وقد استمدت خليط مصفوفة المتاحة تجاريا من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) الورم الفئران وكما هو معروف غشاء الطابق السفلي مصفوفة Matrigel 2،8. وقد أنشئ عدد من التقنيات لزراعة الخلايا الظهارية كما المستعمرات 3D في الغشاء القاعدي مصفوفة 2،8. الطابق السفلي غشاء نموذج مصفوفة 3D فعالة لإنشاء خلايا الثدي الخبيثة على حد سواء وغير الخبيثةالنمو، تشبه ما يحدث في الجسم الحي في البيئة 18،19. الخلايا هي الخلايا الظهارية MCF10A الثديية غير الخبيثة. عندما نمت في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء، وهذه الخلايا في المعرض الصفات المجراة من خلايا الثدي العادية والخضوع لسيطرة تكاثر الخلايا، والاستقطاب الخلية، وموت الخلايا المبرمج لإنشاء مساحة التجويف 8،12،20. وعلاوة على ذلك، وظهور نواة خلية من خلايا MCF10A تشكيل عنيبات في الثقافات 3D أكثر شبها تلك الخلايا الظهارية الثديية في الأنسجة من تلك المستزرعة في أحادي الطبقة 21. وكانت الدراسات التي بيسيل وزملاؤه أول من كشف عن أن خلايا الثدي الخبيثة يمكن أن تكون متباينة من خلايا الثدي غير الخبيثة عندما نمت في محيط-laminin الغنية، منذ عرض الخلايا الخبيثة النمط الظاهري غير منظم للغاية، وزيادة الانتشار، وانخفضت الخلية الى التصاق الخلايا، وزيادة التعبير عن علامات الوسيطة وزيادة في عدد الغازية شكلت هيكل 3،6،22.
يمكن تشوهات البيئة خلية التأثير تشكيل الورم 20. طريقة الثقافة 3D يمكن استخدامها لدراسة فعالية الاتصال الذي يحدث بين الخلايا السرطانية والبيئة المحيطة بها وتحديد كيفية تعبير البروتين مثل هذه التأثيرات 14،20،21،23 الاتصالات. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لتنمو MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي في الثقافات 3D لتحليل الغازية، ودراسة فقدان مورفولوجيا الظهارية باستخدام laminin علامة الظهارية، وهو مكون من الغشاء القاعدي الخلايا 18،19،24، 25. توفير الإجراءات التفصيلية القدرة على تحديد بدقة وبتكاثر النجمية (الغازية) تشكيل هيكل من قبل أي الخلايا السرطانية الغازية وليس يحد إلى الثدي شيوعا خطوط الخلايا السرطانية (مثل MDA-MB-231، Hs578T، MCF-7، أو T47D ). وبالتالي، يمكن هذا الاختبار بمثابة منصة لتقييم كيفية التعبير البروتين في الخلايا أو العلاج مع الموالاة أو المضادة للمركبات الغازية تنظيم تدهور المصفوفة خارج الخلية، من قبل خلايا مفردة أو متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الثقافة ثلاثي الأبعاد للخلايا سرطان الثدي في الطابق السفلي غشاء مصفوفة (إن تقنية الغرز)
- التعامل مع Matrigel مصفوفة الغشاء القاعدي: ذوبان الجليد على الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الطابق السفلي هو مصفوفة غشاء السائل في درجة حرارة منخفضة ولكن يتصلب في درجة حرارة الغرفة. إبقاء الطابق السفلي مصفوفة الغشاء على الجليد (أرقام 1A-B).
- تغطية الجزء السفلي من الزجاج NO.1 طبق متحد البؤر مع 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق نشر مصفوفة باستخدام غيض من P-200 Pipetman بشكل لولبي (الشكل 1C). توخي الحذر عند نشر مصفوفة الغشاء القاعدي لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. وبالمثل، وتجنب نشر مصفوفة ليغلق على حدود طبق من الزجاج السفلي لمنع تشكيل الغضروف المفصلي. إذا التعامل مع عديم الخبرة الطابق السفلي مصفوفة الغشاء، ثم precooled الطبق، P-200 Pipetman وماصات يمكن أن يكون على الجليد (بدلا من ترك بين عشية وضحاها في الثلاجة على 4 درجات مئوية). هذه الخطوة العروضوقتا إضافيا لنشر مصفوفة الغشاء القاعدي قبل التصلب. وضع الطبق (الخانات) في حاضنة الثقافة الخلية (عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل لتمكين مصفوفة الغشاء القاعدي لترسيخ (1D الشكل).
- بينما المصفوفة يخضع التصلب، ويعرض للتريبسين 70-80٪ متموجة 100 ملم لوحة من الخلايا. مرة واحدة وقد بدأت الخلايا رفع الخروج من لوحة، في resuspend لهم في 10 مل من المتوسط 1640 RPMI تحتوي على 10٪ (V / V) مصل بقري جنيني (FBS)، لإبطال نشاط التربسين (الشكل 1E). ثم نقل الخلايا معلق في 15 مل المخروطية أنبوب (الشكل 1F).
- تدور الخلايا (موجودة في أنبوب مخروطي) في 100 x ج لمدة 3 دقائق في مكرسة ثقافة الخلية الطرد المركزي (أرقام 1G-H).
- بينما يجري نسج خلايا أسفل، قسامة 50 ميكرولتر من المصفوفة إلى أنبوب microcentrifuge 1 مل (ملاحظة: كل طبق القاع الزجاجي يتم تخصيص واحد أنبوب microcentrifuge، وبالتالي، إذايتطلب التجربة 3 أطباق، فإنه يترتب على ذلك 3 أنابيب microcentrifuge ضرورية كذلك)، ثم وضع أنبوب على الجليد (الشكل 1B).
- نضح المتوسطة من أنبوب مخروطي من الخطوة 1.4، في حين ترك بيليه دون عائق (الشكل 1I). Resuspend الخلايا (التي تم نسج أسفل) في 1 مل من FBS تستكمل-RPMI المتوسطة (الشكل 1J).
- مرة واحدة يتم عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (الشكل 1K)، أو الجسيمات الخلية مكافحة قسامة 2.5 × 10 4 خلايا في أنبوب microcentrifuge وأنها قبالة رأس باستخدام وسائل الإعلام المناسبة وذلك للحصول على الحجم الكلي لل50 ميكرولتر (الشكل 1L).
- مزج الخلايا من الخطوة 1.7 (25،000 الخلايا في 50 ميكرولتر) مع أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على مصفوفة من الخطوة 1.5 في نسبة 1:1؛ وسوف يكون الحجم النهائي 100 ميكرولتر (الشكل 1M).
- لوحة بلطف 100 ميكرولتر من المصفوفة: خليط الخلية من الخطوة 1.8 على قolidified الغشاء القاعدي طبق المغلفة مصفوفة من الخطوة 1.2 (الشكل 1N). وهذا يسمح للخلايا لتكون جزءا لا يتجزأ في مصفوفة الغشاء القاعدي.
- نقل الطبق (الخانات) في حاضنة الثقافة الخلية (عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2) وتسمح المصفوفة: خليط الخلية لترسيخ لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- مرة واحدة المصفوفة: يتم عزز خليط الخلية، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام RPMI FBS تستكمل إلى الطبق (الشكل 1O) واستعادة السيطرة على طبق الحاضنة حيث سيتم تخزينه للفترة المتبقية من التجربة (الشكل 1P).
- تغيير وسائل الاعلام كل يوم لمدة 5 أيام (أو حسب المطلوب للمقايسة، ومدة الفحص للMDA-MB-231 الخلايا هي 5 أيام في الطول).
- باستخدام المجهر الضوئي، واتخاذ المقابل تدخل الفرق (DIC) وصور من MDA-MB-231 المستعمرات معلقة في مصفوفة الغشاء القاعدي (الشكل 3A). صورة 20 ممثل في المناطق 10X الهدف مرة واحدة يوميالمدة خمسة أيام لتحديد مستعمرة التشكل (الشكل 3C).
- تحليل الصور عمياء لتحديد الخلايا النجمية تشكيل مستعمرة (الشكل 3B). ويعتبر مستعمرة لتكون النجمية إذا وينظر واحد أو أكثر من التوقعات كروي من الخلايا. لتحديد النسبة المئوية للمستعمرات النجمية الغازية، وتقسيم عدد من المستعمرات النجمية من العدد الكلي للمستعمرات الخلايا في صورة المكتسبة، ومن ثم متوسط النسب المئوية المستعمرات النجمية من 20 صورة عن كل يوم.
الشكل 1. الثقافة ثلاثي الأبعاد من MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي في مصفوفة الغشاء القاعدي (تقنية الغرز). AB) والتخطيطي من الإعداد التجريبية (التي أجريت في غطاء الدخان). C) وكذلك الطبق ذات قاع الزجاج المطليمع 50 ميكرولتر من الطابق السفلي مصفوفة الغشاء. D) صحن (الخانات) وضعت في حاضنة الثقافة الخلية (عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2) للسماح لترسيخ مصفوفة لمدة 30 دقيقة على الأقل كانت trypsinized. E) الخلايا. F ) ومعلق الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية ونسج. GH) خلايا (موجودة في أنبوب مخروطي) إلى أسفل في 100 x ج لمدة 3 دقائق في ثقافة الطرد المركزي الأنسجة. الأول) بيليه الخلية. J) خلايا (التي تم نسج أسفل) ومعلق في 1 مل من FBS تستكمل المتوسطة RPMI. احصي K) الخلايا باستخدام عدادة الكريات. L) 2.5 × 10 4 خلايا aliquoted في أنبوب microcentrifuge وتصدرت استخدام وسائل الإعلام المناسبة وذلك للحصول على الحجم الكلي لل50 ميكرولتر. M ) مزيج من الخلايا خطوة 1.7 (25،000 الخلايا في 50 ميكرولتر) مع أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على مصفوفة من الخطوة 1.5 في نسبة 1:1؛ وسوف يكون الحجم النهائي 100 μ؛ ل N) لوحة بلطف 100 ميكرولتر من المصفوفة: خليط الخلية من الخطوة 8 على طبق المغلفة مصفوفة طدت من الخطوة 1.2 O) مرة واحدة في مصفوفة: وطدت خليط الخلية، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام RPMI FBS تستكمل ل. الطبق. P) ضع الطبق في الحاضنة حيث سيتم تخزينه للفترة المتبقية من التجربة.
2. دراسة الميزات Morphogenic الثقافات 3D مع المناعي
- إنشاء علبة الجليد، الفوسفات الباردة حل مخزنة (PBS)، و 20٪ الأسيتون: 80٪ الميثانول (حل تثبيتي)، و 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA؛ عرقلة الحل) (الشكل 2A) قبل أخذ الطبق (وفاق) من الحاضنة.
- وضع الطبق (عناوين) على علبة الجليد ونضح وسائل الإعلام، ثم يغسل 3X مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة (الشكل 2B).
- مرة واحدة ويستنشق غسل PBS الماضي، إضافة 2 مل من 20٪ الأسيتون: 80٪ محلول الميثانول في طبق (الخانات) (الشكل 2C (الشكل 2D).
- مرة واحدة يتم إنهاء 20 دقيقة من التثبيت، وجلب الأطباق الظهر في درجة حرارة الغرفة، ونضح تثبيتي، وبعد ذلك يغسل 3X مع برنامج تلفزيوني. مرة واحدة ويستنشق غسل PBS النهائية، إضافة 2 مل من 3٪ BSA إلى الطبق (عناوين) لمنع لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2E).
- خلال فترة حظر إعداد التخفيفات من التعليم الابتدائي (laminin V 1:100) والأجسام المضادة الثانوية (في التخفيف الملائمة) المذاب في 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) عرقلة العازلة. يرجى ملاحظة أن 400-500 ميكرولتر الحل 'BSA + الأجسام المضادة الأولية "ينبغي أن تضاف مباشرة على مصفوفة: خليط الخلية.
- بمجرد انتهاء دقيقة 30 من الحجب، إضافة الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2F). يرجى ملاحظة أنه لا يغسل PBS ينبغي أن يقوم بعد blockin 30 دقيقةز الفترة.
- عند الانتهاء من الخطوة 2.6، وإزالة الحل 'BSA + الأجسام المضادة الأولية'، وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية الذائبة في 3٪ BSA (في التخفيف الملائمة) مباشرة على مصفوفة: خليط الخلية، وتغطي الأطباق واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2G).
- إزالة 'BSA + الضد الثانوية' الحل، وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من هويشت 33258 (1:10،000) المذاب في برنامج تلفزيوني لمدة نوى تلطيخ، واحتضان لمدة 5 دقائق تحت رقائق الألومنيوم (أو مع تغطية وعاء غير شفاف للحد من photobleaching من) (الشكل 2H).
- بمجرد انتهاء دقيقة 5 من الحضانة مع هويشت 33258t، وغسل الطبق (عناوين) 5X مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة تصاعد المتوسطة مباشرة على مصفوفة: خليط الخلية في طبق متحد البؤر، وتغطي مع الزجاج ساترة بعناية لمنع أي اضطرابات حمل لسلامة المستعمرات في ماتري الغشاء القاعديس: خليط الخلية (الشكل 2I).
- السماح للطبق (عناوين) لتجف بين عشية وضحاها (أو 24 ساعة) في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2I). الجاف مرة واحدة، وطبق (عناوين) يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية، ولكن ينصح بشدة أنه ينبغي تصويرها في أسرع وقت ممكن.
- الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت مع موجات الليزر المناسبة من الأجسام المضادة المستخدمة (أرقام 3D-E).
الشكل 2. دراسة الثقافات 3D بواسطة المناعي. ألف) والتخطيطي من الإعداد التجريبية B) صحن (عناوين) وضعت على علبة الجليد ويستنشق وسائل الإعلام؛ بعد ذلك تم غسلها الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة C) 2 مل من 20٪ الأسيتون:. أضاف 80٪ محلول الميثانول في طبق (عناوين) D) إصلاح الخلايا ل.20 دقيقة في 4 درجات مئوية (إما على الجليد، أو في الثلاجة). E) 2 مل من 3٪ BSA تضاف إلى الطبق (عناوين) لمنع لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. F) مرة واحدة في دقيقة 30 من وقد انتهت الحجب، إضافة الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة G) تم إضافة الأجسام المضادة الثانوية الذائبة في 3٪ BSA (في التخفيف الملائمة) مباشرة على مصفوفة الغشاء القاعدي: خليط الخلية؛ . لاحقا الأطباق المغطاة والمحتضنة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة H) 2 مل من هويشت (1:10،000؛ المنحل في برنامج تلفزيوني) يضاف إلى dishe (عناوين) والخلايا المحتضنة لمدة 5 دقائق تحت رقائق الألومنيوم I) تركيب المتوسطة إضافتها مباشرة. على مصفوفة: ويغطي الخليط خلية في طبق ومتحد البؤر الطبق مع الزجاج ساترة. (عناوين) طبق تترك لتجف بين عشية وضحاها (أو 24 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح مثال على الخلايا MDA-MB-231 في غزو 3D مصفوفة في الشكل 3C. هي جزء لا يتجزأ من الخلايا في المصفوفة (يوم 1)، والبدء في تشكيل الغازية (النجمية) هياكل من قبل يوم 3، وغزو تماما في مصفوفة من قبل يوم 5 (الشكل 3C). يتم حساب عدد المستعمرات النجمية شكلت، وكنسبة مئوية من مجموع عدد المستعمرات في الطبق (الغازية وغير الغازية). بالإضافة إلى ذلك، منذ تتم القياسات يوميا خلال خمسة أيام، ويمكن أيضا أن يتم تقييم معدل الغزو.
إنشاء جدول زمني للأحداث التخلق يوفر أساسا لاختبار العديد من المعلمات في هذه المقايسات. على سبيل المثال، خلايا سرطان الثدي يمكن علاجها بعقاقير مضادة للسرطان أو الأدوية التي قد تعزز هيكل الخلية إعادة ترتيب، وآثار هذه الأدوية على الغزو يمكن التأكد منه، مقارنة مع الخلايا unstimulated وتسيطر السيارة 24. بالتناوب، وقدرة الثدي يمكنيمكن قياس خلايا السرطان لتشكيل نتوءات الغازية على تعديل وراثيا الخلايا للتعبير عن الجين الورمي المحتملة أو خفض التعبير الجيني باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (مثل shRNA) 18،24،25.
وهناك فائدة كبيرة من استخدام الثقافات الخلية 3D كأداة تجريبية هو القدرة على دراسة الميزات المكانية والزمانية من الجزيئات يشير مهمة خلال خلية تغيرات شكلية. من خلال الاستفادة من تلطيخ المناعي، والتعبير عن هذه الجزيئات يمكن أن يتم الكشف عن بصريا داخل الثقافة 3D. في الشكل 3E، وتبين لنا ممثل الغازية (النجمية) مستعمرات الخلايا MDA-MB-231 عرض فقدان سلامة الغشاء والتعريب منتشر في الطابق السفلي البروتين غشاء laminin V 24. في تناقض صارخ مع ما لوحظ في خلايا سرطان الثدي، وكان مترجم laminin الخامس لطبقة الغشاء القاعدي سليمة إحاطة عنيبات الثديية الخلايا MCF10A غير الخبيثة غير المعالجة (الشكل3E) 24.
الرقم 3. اكتساب صورة والتوضيح من الصور التمثيلية. أ) تدخل الصور التي اتخذت مع المجهر. B) التفاضلية النقيض (DIC) المجهر التصوير المستخدمة للحصول على الصور والصور في وقت لاحق تحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور. C) ممثل عينة من الصور DIC MDA-MB-231 الخلايا (تؤخذ مرة واحدة في اليوم لمدة يتم عرض خمسة أيام). يليه في اتجاه واحد أنوفا بواسطة اختبار المقارنة متعددة DUNNETT في: *، P <0.05. وتظهر الصور التي تصور عينة مناعي laminin V التعريب في MDA-MB-231 (نمت لمدة 5 أيام) وخلايا MCF10A (نمت لمدة 12 يوما) شريط النطاق، و 100 ميكرومتر. D) اقتناء الصور باستخدام المجهر الفلورسنت. E). شريط النطاق، 20 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد سمح تطوير تقنيات زراعة الخلايا 3D الباحثين لدراسة تحويل خلايا الثدي الظهارية، مما يسمح لنا لتصور التغيرات المورفولوجية دراماتيكية. إلى جانب تحليل غزو الخلايا والأجسام الشبه الكروية الظهارية الثديية واحدة أو متعددة الخلايا يمكن استخدامها لتقييم التغيرات في التصاق الخلوية، والانتشار، وحجم، والقاعدية قمية قطبية. وعلى النقيض من منهجيات ذكرت سابقا حيث يتم مضافين الخلايا مع ECM 8، أسلوبنا يضمن الخلايا في ECM 18،19،24، والذي يسمح للغزو متعدد الاتجاهات ليكون كميا. هذه نماذج مبتكرة الثقافة 3D تسمح للباحثين لدراسة التغيرات المظهرية التي لا يمكن عند دراسة الخلايا في أحادي الطبقة، وذلك باستخدام المقايسات الغزو غرفة transwell التقليدية. من خلال إدماج استراتيجيات كلا البيوكيميائية والدوائية جنبا إلى جنب مع التحليل المناعي متحد البؤر من مستعمرات الخلايا، ونماذج 3D سهلت القدرة على متأنذ تحليل التغيرات المورفولوجية مع أكثر التطور والتفصيل. ولذلك هذه التقنية تعزز فهمنا للآليات التي تؤثر على بدء والنهوض السرطان.
وجدنا أن العدد الأمثل للتصفيح من MDA-MB-231 خلية لكل طبق متحد البؤر كانت مصممة على أن تكون 25،000 الخلايا. زيادة هذا العدد الخلية قد يؤدي يحتمل أن تكون في الطابق السفلي المفرط غشاء تدهور المصفوفة (المشار إليها باسم "ظاهرة تنعيم ')، وبالتالي، لن يكون الموصى بها. ومع ذلك، قد تعمل أعداد الخلايا أعلى إذا تم تعديل معايير أخرى، مثل مع زيادة مصاحبة في الغشاء القاعدي حجم المصفوفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الغشاء القاعدي مخاليط المصفوفة تختلف في تركيز من دفعة واحدة إلى أخرى. وبالتالي فإنه من المهم لاختبار البداية الخليط لقدرته على الحفاظ على التشكل الطبيعي للخلايا الظهارية الثديية غير الخبيثة في المقايسات 3D. عند التصوير الثقافات 3D، وفريدة من نوعها تنشأ المشاكل التيلا تقدم عند التصوير الثقافات التي تزرع في أحادي الطبقة. بالنظر إلى أن المستعمرات نمت في الطابق السفلي مصفوفة غشاء هي متعددة الأبعاد، قد يكون غاب هياكل بأكملها عند التصوير اذا كانت واقعة خارج الطائرة من التركيز. يتم التغلب على ذلك عن طريق التصوير باستخدام متحد البؤر Z-المداخن التي تمكن الصور التي يتعين اتخاذها في طائرات متعددة وبالتالي كل بنية الغازية الفردية للمستعمرة 3D يمكن تصويرها.
فقد قررنا أيضا أن 20٪ من الأسيتون: 80٪ محلول الميثانول هي الوكيل الأمثل لتحديد المستعمرات جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الغشاء القاعدي، مقارنة باستخدام وكلاء تثبيت أخرى مثل بارافورمالدهيد مع حل تريتون-X. وقد وجدنا أن الأسيتون: الميثانول تثبيتي يحسن immunolabeling ويميل للحد من تألق ذاتي الخلفية. ومع ذلك، لا بد من تحسين إجراءات تلطيخ في كل تجربة، من أجل تحديد التخفيفات الضد المثالية التي قد تختلف عن تلك المستخدمة عادة لأحادي الطبقة تلطيخ. معظم antibodiوفاق هذا العمل على الطبقات الوحيدة يمكن استخدامها ل3D المناعية. ومع ذلك، وطول فترة حضانة مع الأجسام المضادة قد تختلف، وهذا سوف تضطر إلى أن تحدد على أساس فردي.
يمكن تصوير الثقافات 3D للدراسات المناعي تشكل بعض التحديات 8. من أجل التغلب على مشكلة "التشويش / التحبب" نظرا لسماكة العينة، يمكن اتخاذ خطوات معينة لتحسين جودة الصور مثل الحصول Z أكوام من العينة أو زيادة وقت التعرض، وزيادة متوسط عدد الإطار . وهذا هو أيضا مفيدة للغاية للتمييز النجمية (الغازية) مقارنة مورفولوجيا كروي بدلا من الحصول على صورة في طائرة واحدة. يمكن أيضا كومة Z تصويرها تتم معالجتها لتقديم صورة 3D للعينة تبين المناعية. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام MDA-MB-231 أو خلية MCF10A خطوط، ونحن ناجحة المجاميع خلية شكلت على مدى الفترة الزمنية نمت. وهكذا، كنا قادرين على دراسة الموقعوالتغيرات في التعبير عن علامات قطبية الخلية في الثقافات 3D بواسطة المناعي. بالتناوب، المجاميع الخلوية يمكن تشكيلها مسبقا قبل أن يتم وضعها في مصفوفة الغشاء القاعدي وتوطين البروتينات من الفائدة ومن ثم يمكن تقييمها.
على أن تبرم، مجموعة متنوعة من التطبيقات الممكنة يجعل استخدام الثقافات 3D مقايسة الديناميكية التي يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من الخلايا، سواء المرضية و / أو العادي في الأصل السماح لتقييم التغيرات في التشكل الخلوية والغزو في عينات ثابتة أو في الوقت الحقيقي 18،19،24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
