Summary
Den här artikeln innehåller detaljerade metoder för användning av tredimensionella (3D) analyser för att kvantifiera bröstcancercellinvasion. Specifikt diskuterar vi de förfaranden som krävs för att upprätta sådana analyser, kvantifiering och analys av data, samt metoder för att undersöka förlusten av membranintegritet som uppstår när celler invaderar.
Abstract
Det är nu väl känt att den cell-och vävnadsmikromiljö är viktiga regulatorer som påverkar tumör initiering och progression. Dessutom har den extracellulära matrisen (ECM) visat sig vara en kritisk regulator av cellbeteende i kultur och homeostas in vivo. Den nuvarande strategin för att odla celler på tvådimensionell (2D), plastytor leder till störningar och förlust av komplexa interaktioner mellan celler och deras mikromiljö. Genom att använda tredimensionella (3D) kulturanalyser, är villkoren för cell-mikromiljö interaktion etablerat liknar in vivo mikromiljö. Denna artikel ger en detaljerad metod för att odla bröstcancerceller, i en 3D-basalmembran proteinmatris, som exemplifierar potentialen av 3D-kultur i bedömningen av cellinvasion in i den omgivande miljön. Dessutom diskuterar vi hur dessa 3D-analyser har potential att undersöka förlusten av signal molecmoduler som reglerar epitelial morfologi genom immunfärgning förfaranden. Dessa studier stöd för att identifiera viktiga mekanistiska detaljerna i de processer som reglerar invasion, som krävs för spridningen av bröstcancer.
Introduction
Migration och invasion av individuella eller kollektiva celler är två kännetecken för cancer, och som krävs för metastatisk spridning av cancerceller 1-4. Förmågan hos cancerceller för att initiera metastas beror på deras förmåga att migrera och invadera in i angränsande vävnad med hjälp invadopodia att degradera basalmembranet hos cellerna. Invadopodia är dynamiska aktin rika matrisnedbrytning utsprång som möjliggör nedbrytning av den extracellulära matrisen genom frisättning av matrixnedbrytande proteaser 5. Cancer cellinvasion innebär nedbrytningen av matrisen följt av migrationen av cancerceller och detta åtföljs av en omorganisation av den tredimensionella (3D) matris miljö 2. Således, för att tränga in genom matrisen måste en cell transformera dess form och interagerar med den extracellulära matrisen (ECM) 2.
Underhållet av bröstvävnad integritet är beroende av tätt controlled vävnadsarkitektur eftersom cell-ECM-och cell-cellvidhäftnings korsningar påverka genuttryck och söndring av epitelial polaritet kan leda till uppkomsten av cancer 6-10. Men de flesta vitro migration och invasion analyser i t.ex. Transwell kammar analyser eller sår-skrap analyser är tvådimensionell (2D) och därmed dessa försummar de intrikata samspelet mellan celler och deras intilliggande miljö 3,6,8,11-14. Betydande morfologiska och funktionella skillnader inklusive variationer i cellulär morfologi, celldifferentiering, cell-matrix sammanväxningar och genexpressionsmönster har upptäckts genom att odla celler i 3D kulturer som ofta saknas i 2D-analyser 2,6,8,11. Således använder 3D-analyser är betydligt nytta i rekapitulera ett mer fysiologiskt in vivo tillstånd, vilket leder till en bättre översättning av banbrytande rön inom grundforskning till kliniken 6-10. Emellertid bör det noteras, Trots de många fördelar som uppnås med hjälp av 3D-kulturer, kan denna modell inte fångar alla de komplexa in vivo tumörmikromiljö som inkluderar olika celltyper. Emellertid är det möjligt att inkorporera stromaceller in i 3D-modeller (t.ex. fibroblaster, leukocyter och makrofager) för att studera effekten av tumör-stroma interaktioner på cancer cell adhesion och invasion 15-17.
Bröst epitelceller i kultur växer mest effektivt när ECM-proteiner såsom laminin och kollagen är närvarande. Med denna kända, har ett kommersiellt tillgängligt matrisblandning härletts från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus tumör och är känd som Matrigel basalmembranmatris 2,8. Ett antal tekniker har inrättats för att odla epitelceller som 3D-kolonier i basalmembran matris 2,8. 3D basalmembranet matrismodellen är effektiv för att fastställa både maligna och icke-maligna bröstcelltillväxt, som liknar det som förekommer i miljön in vivo 18,19. MCF10A cellerna är icke-maligna bröstepitelceller. När den odlas i basalmembranet matris, dessa celler uppvisar in vivo egenskaper hos normala bröstceller och genomgå kontrollerad cellproliferation, cell polarisation, och apoptos för att upprätta lumen utrymme 8,12,20. Dessutom uppkomsten av cellkärnor i MCF10A celler som bildar acini i 3D kulturer mer liknar de av bröst epitelceller i vävnad än de som odlas i monolager 21. Studier av Bissell och kollegor var de första att avslöja att elakartade bröstceller kan skiljas från icke-maligna bröstceller när de odlas i ett laminin rika omgivning, eftersom de maligna celler visar en mycket oorganiserad fenotyp, ökad spridning, minskad cell-till- cellvidhäftning, ökad expression av mesenkymala markörer och en ökning av antalet invasiva struktur bildad 3,6,22.
Avvikelser i cellmiljön kan påverka tumörbildning 20. 3D odlingsmetoden kan användas för att effektivt studera den kommunikation som sker mellan tumörceller och den omgivande miljön och bestämma hur proteinuttrycks influenser kommunikation 14,20,21,23. Den här artikeln innehåller en detaljerad metod för att växa MDA-MB-231 bröstcancerceller i 3D-kulturer för att analysera invasiv, och att studera förlusten av epitelial morfologi med hjälp av en epitelial markör laminin, en komponent i cellbasalmembranet 18,19,24, 25. De detaljerade förfarandena ger möjlighet att exakt och reproducerbart kvantifiera stellate (invasiv) strukturbildning av någon invasiv cancer cell och är inte begränsande till de vanligaste bröstcancercellinjer (t.ex. MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, eller T47D ). Sålunda kan denna analys användas som en plattform för att utvärdera hur proteinuttryck i celler eller behandling med pro-eller anti-invasiva föreningar reglerar extracellulärmatrix nedbrytning, genom en eller flera celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tredimensionell Kultur av bröstcancerceller i basalmembran Matrix (ingjutning Technique)
- Hantering Matrigel basalmembran matris: Tina på is över natten vid 4 ° C. Basalmembran matris är flytande vid låga temperaturer men stelnar vid rumstemperatur. Håll basalmembran matris på is (fig. 1A-B).
- Täck Confocal No.1 glasbottnad skål med 50 | il av basalmembranmatrisen med hjälp av spridningsmatris hjälp av spetsen på en P-200 Pipetman i ett spiralmönster (Figur 1C). Försiktig när spridningsbasalmembranmatrisen för att undvika bildandet av luftbubblor. Likaså undvika att sprida matrisen för nära gränserna för glas nedre skålen för att förhindra menisk bildas. Om oerfaren hantering basalmembranmatrisen, sedan förkyld skålen, P-200 Pipetman och pipetter kan vara på is (alternativt lämnas över natten i ett kylskåp vid 4 ° C). Detta steg erbjudandenytterligare tid för att sprida basalmembranet matrisen före stelning. Placera skålen (er) i en cellkultur inkubator (vid 37 ° C med 5% CO2) under minst 30 minuter för att göra det möjligt för basalmembranmatrisen stelna (figur 1D).
- Medan matrisen genomgår stelning, trypsinize en 70 till 80% sammanflytande 100 mm platta med celler. När cellerna har börjat lyfta bort av plattan, och återsuspendera dem i 10 ml av RPMI 1640-medium innehållande 10% (vol / vol) fetalt bovint serum (FBS), för att inaktivera trypsin (figur 1E). Överför sedan de suspenderade celler i ett 15 ml koniskt rör (Figur 1F).
- Snurra cellerna (som finns i koniskt rör) vid 100 xg under 3 min i en särskild cellkultur centrifug (figur 1G-H).
- Medan cellerna som snurrade ner, alikvot 50 pl matris i en 1 ml mikrocentrifugrör (notera: varje glasbottnad skål delas en mikrocentrifugrör, varför, omexperimentet kräver 3 rätter, då det följer att 3 mikrorör behövs också), och sedan placera röret på is (Figur 1B).
- Sug mediet från den koniska röret från steg 1.4, samtidigt som pelleten ostört (figur 1I). Återsuspendera cellerna (som har spunnits ner) i en ml av FBS-kompletterat RPMI-medium (figur 1J).
- När cellerna räknas med hjälp av en hemocytometer (figur 1K), eller en cellpartikelräknare alikvot 2,5 x 10 4 celler i mikroröret och grädde på moset med hjälp av lämpliga medier för att få total volym på 50 l (figur 1L).
- Blanda cellerna från steg 1,7 (25.000 celler i 50 | il) med matrisen innehållande mikrocentrifugrör från steg 1,5 i ett förhållande av 1:1; slutvolymen blir 100 l (figur 1M).
- Försiktigt plattan 100 | il av matrisen: cellblandningen från steg 1,8 till solidified basalmembranet matris belagda maträtt från steg 1.2 (figur 1N). Detta gör det möjligt för celler att vara inbäddad i basalmembranmatrisen.
- Överför skålen (er) i cellkultur inkubator (vid 37 ° C med 5% CO2) och tillåta matrisen: cellblandningen stelna i minst 30 min.
- När matrisen: cellen blandningen stelnat, tillsätt 2 ml FBS-kompletterat RPMI media till skålen (figur 1O) och ta skålen tillbaka inkubatorn där den kommer att förvaras under återstoden av experimentet (figur 1P).
- Ändra media varje dag under en period av 5 dagar (eller per som krävs för en analys; varaktigheten av analysen för MDA-MB-231-celler är 5 dagar i längd).
- Med hjälp av ett ljusmikroskop, tar differentialinterferenskontrast (DIC) bilder av MDA-MB-231-kolonier som är suspenderade i basalmembranmatrisen (figur 3A). Bild 20 representativa områden vid 10X mål en gång om dageni fem dagar för att bestämma koloni morfogenes (figur 3C).
- Analysera bilder blint för att bestämma cellkolonistellate bildning (figur 3B). En koloni anses vara stellate, om en eller flera projektioner från sfäroiden av celler uppfattas. För att bestämma andelen invasiva stellatceller kolonier, dividera antalet stel kolonier med det totala antalet cellkolonier per förvärvad bild, och sedan i genomsnitt de stel kolonierna procent av de 20 bilder för varje dag.
Figur 1. Tredimensionellt kultur av MDA-MB-231-bröstcancerceller i basalmembranmatris (ingjutning tekniken). AB) En schematisk av experimentuppställning (utförs i dragskåp). C) Brunnen av glasbottnad skål belagdmed 50 pl av basalmembranmatrisen. D) skål (es) placerades i en cellodlingsinkubator (vid 37 ° C med 5% CO2) för att tillåta matrisen att stelna i minst 30 min. E) Celler trypsinerades. F ) Celler återsuspenderades i en 15 ml koniska rör. GH) Celler (närvarande i koniska rör) centrifugerades ned vid 100 x g under 3 min i en vävnadskultur-centrifug. I) cellpelleten. J) Celler (som har spunnits ner) återsuspenderades i 1 ml av FBS-kompletterat RPMI-medium. K) Cellerna räknades med användning av en hemocytometer. L) 2,5 x 10 4 celler i alikvoter i mikrocentrifugrör och toppade med användning av lämpliga medier för att erhålla total volym av 50 | il. M ) Blanda celler från steg 1,7 (25.000 celler i 50 | il) med matrisen innehållande mikrocentrifugrör från steg 1,5 i ett förhållande av 1:1; slutvolym blir 100 μ., L N) plattan försiktigt 100 pl av matrisen: cell blandningen från steg 8 på den stelnade matrisen belagda maträtt från steg 1,2 O) När matrisen: cellen blandningen stelnat, tillsätt 2 ml FBS-kompletterat RPMI media till. skålen. P) Ställ in skålen i inkubatorn, där den kommer att lagras för återstoden av experimentet.
2. Undersökning av morphogenic Dragen av 3D-kulturer med immunofluorescens
- Sätt upp en is bricka, kall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), 20% aceton: 80% metanol (fixeringslösning) och 3% bovint serumalbumin (BSA; blockeringslösning) (figur 2A) innan du tar ut skålen (er) från inkubatorn.
- Placera skålen (er) på isen facket och aspirera media, sedan tvätta 3x med 2 ml kall PBS (Figur 2B).
- När den sista PBS-tvätt aspireras, tillsätt 2 ml av 20% aceton: 80% metanollösning i skålen (er) (Figur 2C (Figur 2D).
- När 20 min för fixering upphör, bringa skålarna igen vid rumstemperatur, aspirera fixativ och därefter tvätta 3x med PBS. När det slutliga PBS-tvätt aspireras, tillsätt 2 ml av 3% BSA till skålen (er) för att blockera under minst 30 min vid rumstemperatur (figur 2E).
- Under blockeringsperioden bereda spädningar av primär (laminin V 1:100) och sekundära antikroppar (vid lämplig utspädning) upplösta i 3% bovint serumalbumin (BSA) blockeringsbuffert. Observera att 400-500 mikroliter skall "BSA + primär antikropp lösning bör läggas direkt på matrisen: cellblandning.
- När 30 min av blockering har löpt ut, tillsätt de primära antikropparna och inkubera under åtminstone 1 h vid rumstemperatur (figur 2F). Observera att inga PBS tvättar skall utföras efter 30 min blocksg perioden.
- Efter avslutad steg 2.6, ta bort "BSA + primär antikropp lösning, och tvätta 3x med PBS.
- Lägg till den sekundära antikroppen löstes i 3% BSA (i lämplig spädning) direkt på matrisen: cellblandningen, omfattar de rätter och inkubera under 1 h vid rumstemperatur (figur 2G).
- Ta bort "BSA + sekundär antikropp lösning, och tvätta 3x med PBS.
- Tillsätt 2 ml Hoechst 33258 (1:10,000) löst i PBS under kärnor färgning, och inkubera under 5 min under aluminiumfolie (eller täcka med en ogenomskinlig behållare för att begränsa fotoblekning) (Figur 2H).
- När 5 min av inkubation med Hoechst 33258t har gått ut, tvätta skålen (er) 5x med PBS.
- Lägg monteringsmedel direkt på matrisen: cellblandningen i konfokala skålen och täck med glas täckglas försiktigt så att förmå eventuella störningar till integritet kolonierna i basalmembranet Matrix: cellblandning (Figur 2I).
- Låt skålen (er) för att torka över natten (eller 24 timmar) vid rumstemperatur (fig 2i). När torr, kan skålen (er) förvaras vid -20 ° C, men det rekommenderas starkt att de ska avbildas så snabbt som möjligt.
- Förvärva bilder med hjälp av en fluorescerande mikroskop med lämpliga laser våglängder av antikroppar som används (figur 3D-E).
Figur 2. Granskning av 3D-kulturer genom immunofluorescens. . A) En schematisk av experimentuppställning B) Dish (er) placeras på isen facket och media aspire; Därefter tvättades cellerna tre gånger med 2 ml kall PBS-C) 2 ml av 20% aceton:. 80% metanollösning sattes till skålen (er) D) fixera cellerna efter.20 min vid 4 ° C (endera på is eller i kylskåp). E) 2 ml av 3% BSA sattes till skålen (er) för att blockera under minst 30 min vid rumstemperatur. F) När 30 min av blockering har löpt ut, tillsätt de primära antikropparna och inkubera under åtminstone 1 h vid rumstemperatur G) Sekundära antikroppar upplösta i 3% BSA (i lämplig spädning) tillsattes direkt på basalmembranmatrisen. cellblandningen; . därefter rätter täcks och inkuberas under 1 h vid rumstemperatur H) 2 ml av Hoechst (1:10,000; löst i PBS) sattes till dishe (er) och cellerna inkuberades under 5 min under aluminiumfolie I) Monteringsmedium tillsättas direkt. på matrisen: cellblandningen i konfokala skålen och skålen täcks med täckglas. Skålen (er) lämnas att torka över natten (eller 24 timmar) vid rumstemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på MDA-MB-231-celler som invaderar i 3D-matris visas i fig. 3C. Cellerna är inbäddade i matrisen (Dag 1) och börja bilda invasiva (stellate) strukturer vid dag 3, och helt invadera in i matrisen vid dag 5 (figur 3C). Antalet stel kolonier bildade räknas, och uttryckt i procent av det totala antalet kolonier per fat (invasiva och icke-invasiva). Dessutom, eftersom mätningar görs dagligen under de fem dagar, kan också utvärderas graden av invasion.
Etablera en tidslinje av morfogenetiska händelser ger en grund för att testa ett flertal parametrar i dessa analyser. Till exempel, kan bröstcancerceller behandlas med cytostatika eller läkemedel som kan främja cytoskeletal nytt arrangemang, och effekterna av dessa läkemedel på invasion kan fastställas, jämfört med ostimulerade celler och fordonskontroller 24. Alternativt kan kapaciteten hos bröst kancer celler att bilda invasiva utsprång kan kvantifieras på genetiskt modifiera cellerna att uttrycka en potentiell onkogen eller minskat genuttryck med hjälp av RNA-interferens (t.ex. shRNA) 18,24,25.
En stor fördel med att använda 3D-cellkulturer som en experimentell verktyg är möjligheten att undersöka den rumsliga och tidsmässiga drag av viktiga signalmolekyler under cell morfologiska förändringar. Genom att utnyttja immunofluorescensfärgning kan uttrycket av dessa molekyler visuellt detekteras inom 3D-kultur. I fig. 3E visar vi representativa invasiva (stellate) kolonier av MDA-MB-231 celler som uppvisar en förlust av membranintegritet och diffus lokalisering av basalmembranet protein laminin V 24. I skarp kontrast till vad som observerats i bröstcancerceller, var laminin V lokaliserad till ett intakt basalmembran lager omsluter bröst acini av obehandlade icke-maligna MCF10A celler (Figur3E) 24.
Figur 3. Bild förvärv och illustration av representativa bilder. A) Bilder tagna med mikroskop. B) differential interferens kontrast (DIC) imaging mikroskop som används för att få bilder och därefter bilderna analyseras med hjälp av bildanalys programvara. C) Prov representativa DIC bilder av MDA-MB-231-celler (tas en gång om dagen för fem dagar) visas. One-way ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest: *, P <0,05. Skala bar, 100 nm. D) Bild förvärv med hjälp av fluorescensmikroskop. E) Prov immunofluorescerande bilder som skildrar laminin V lokalisering i MDA-MB-231 (som odlas i 5 dagar) och MCF10A celler (odlade i 12 dagar) visas. Scale bar, 20 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av 3D cellodlingsteknik har gjort det möjligt för forskare att studera omvandlingen av bröst epitelceller, vilket tillåter oss att visualisera de dramatiska morfologiska förändringar. Förutom att analysera cellinvasion, kan de enskilda eller flercelliga bröstepitelialceller spheroids användas för att bedöma förändringar i cellulär adhesion, proliferation, storlek, och basal-apikala polaritet. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder där cellerna med ECM 8, bäddar in vår metod cellerna i ECM 18,19,24, vilket möjliggör flera riktningar invasion som ska kvantifieras. Dessa innovativa 3D odlingsmodeller tillåter forskare att studera fenotypiska förändringar som inte är möjligt när man studerar celler i monolager, med traditionella transwell kammarinvasionsanalyser. Genom införlivandet av både biokemiska och farmakologiska strategier tillsammans med konfokal immunofluorescens-analys av cellkolonier har 3D-modeller underlättas förmågan att carey analysera morfologiska förändringar med mer sofistikerade och detaljer. Denna teknik har därför främjat vår förståelse av de mekanismer som påverkar initiering och utveckling av cancer.
Vi fann att det optimala antalet för plätering av MDA-MB-231 celler per konfokala skål bestämdes till 25.000 celler. Att öka denna cell nummer kan potentiellt leda till överdriven basalmembran matrisnedbrytning (kallad den fluff fenomen "), och därmed inte kan rekommenderas. Emellertid kan högre cellantal fungera om andra parametrar justeras, såsom med en åtföljande ökning av basalmembranmatrisvolym. Dessutom kan basalmembranmatrisblandningar varierar i koncentration från en sats till en annan. Det är således viktigt att initialt testa blandningen för sin förmåga att upprätthålla normal morfogenes av icke-maligna bröstepitelceller i 3D-analyser. När avbildning 3D kulturer, uppstår unika problem som ärinte är närvarande när avbildning kulturer odlade i monolager. Med tanke på att kolonier odlade i basalmembran matris är flerdimensionell, kan hela konstruktioner missa när imaging om ligger utanför plan fokus. Detta övervinns genom avbildning med konfokala Z-stackar som gör bilder som ska vidtas i flera plan och således varje enskilt invasiv struktur 3D koloni kan avbildas.
Vi har även fastställt att 20% aceton: 80% metanollösning är det optimala medlet för fixering kolonier inbäddade i basalmembranmatrisen, jämfört med att använda andra fästmedel, såsom paraformaldehyd med Triton-X-lösning. Vi har funnit att den aceton: metanol fixativ förbättrar immunmärkning och tenderar att minska bakgrunds autofluorescens. Emellertid är optimering av färgningsproceduren krävs i varje experiment för att bestämma de ideala antikroppsspädningar som kan skilja sig från de som typiskt används för monoskikt färgning. De flesta antibodies att arbetet med monolager kan användas för 3D-immunfärgning. Emellertid kan längden av inkubationstiden med antikroppen att variera, och detta kommer att behöva bestämmas på en individuell basis.
Imaging 3D-kulturer för immunfluorescensstudier kan utgöra en del utmaning 8. För att lösa problemet med "suddighet / kornighet" på grund av tjockleken på provet, kan vissa åtgärder vidtas för att förbättra kvaliteten på bilden, som förvärv av Z-stackar av provet eller öka exponeringstiden, och ökande ramnummer genomsnitt . Detta är också mycket fördelaktigt att skilja stellate (invasiv) jämfört med sfäriska morfologi snarare än att skaffa en bild i ett plan. Z-stack avbildas kan också bearbetas för att göra en 3D-bild av provet som visar immunfärgning. Dessutom, med hjälp av MDA-MB-231 eller MCF10A cellinjer, vi framgångsrika bildade cellaggregat under den tidsperiod ökat. Därmed kunde vi undersöka platsenoch förändringar i uttryck av cell polaritet markörer i 3D kulturer genom immunofluorescens. Alternativt cellulära aggregat kan vara förformade innan de släpps in i basalmembranmatrisen och lokalisering av proteiner av intresse kan sedan utvärderas.
Avslutningsvis, gör olika möjliga tillämpningar användningen av 3D-kulturer en dynamisk analys som kan användas med ett brett spektrum av celler, oavsett om patologisk och / eller normal ursprung gör det möjligt att utvärdera förändringar i cellulär morfologi och invasion i fasta prover eller i realtid 18,19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al.
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
