Summary
Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l'utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l'invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell'integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.
Abstract
È ormai noto che il microambiente cellulare e tissutale sono regolatori critici che influenzano iniziazione e la progressione tumorale. Inoltre, la matrice extracellulare (ECM) è stato dimostrato per essere un regolatore critico del comportamento delle cellule in coltura e omeostasi in vivo. L'attuale approccio di coltura di cellule in bidimensionale (2D), superfici plastiche risultati del disturbo e perdita di complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente. Attraverso l'uso di tridimensionale (3D) saggi di coltura, sono stabilite le condizioni per l'interazione cellula-microambiente simile microambiente in vivo. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per far crescere le cellule del cancro al seno in una matrice 3D di proteine della membrana basale, esemplificando il potenziale della cultura 3D nella valutazione di invasione delle cellule nell'ambiente circostante. Inoltre, si discuterà di come questi test 3D hanno il potenziale per esaminare la perdita di segnalare molecduli che regolano la morfologia epiteliale da immunoistochimica procedure. Questi studi aiutano a identificare importanti dettagli meccanicistici nei processi che regolano l'invasione, necessarie per la diffusione del cancro al seno.
Introduction
Migrazione e l'invasione delle cellule individuali o collettivi sono due caratteristiche di cancro, e necessari per la diffusione metastatica delle cellule tumorali 1-4. La capacità delle cellule di cancro di avviare metastasi dipende dalla loro capacità di migrare e invadere nel tessuto limitrofo utilizzando invadopodia a degradare la membrana basale delle cellule. Invadopodia sono sporgenze degradazione matrice ricca di actina dinamiche che consentono la degradazione della matrice extracellulare attraverso il rilascio di proteasi matrice degradazione 5. Invasione cellula tumorale attraverso la degradazione della matrice e la migrazione delle cellule tumorali e questo è accompagnato da una riorganizzazione dell'ambiente matrice tridimensionale (3D) 2. Così, per penetrare attraverso la matrice, una cella deve trasformare la sua forma e interagire con la matrice extracellulare (ECM) 2.
Il mantenimento dell'integrità del tessuto mammario dipende strettamente controlled architettura tissutale da giunzioni cellula-ECM e cellula-cellula adesione influenzano l'espressione genica e la rottura della polarità epiteliale può provocare l'insorgenza del cancro 6-10. Tuttavia, la maggior vitro migrazione e l'invasione test in quali transwell saggi camera o saggi ferita-graffio sono bidimensionali (2D) e quindi queste trascurano le interazioni complesse tra le cellule e il loro ambiente adiacente 3,6,8,11-14. Diversità morfologiche e funzionali significativi, in particolare le variazioni di morfologia cellulare, differenziazione cellulare, adesioni cellula-matrice e modelli di espressione genica sono stati rilevati da coltura di cellule in colture 3D che sono comunemente carenti in 2D saggi 2,6,8,11. Così, utilizza delle analisi 3D sono significativamente utile ricapitolare in un più fisiologico in condizioni vivo, portando ad una migliore definizione di risultati innovativi nella ricerca di base alla clinica 6-10. Tuttavia, va notato, Nonostante i numerosi vantaggi ottenuti con l'uso di colture 3D, questo modello non può catturare tutte le complessità del microambiente tumorale in vivo che comprende vari tipi di cellule. Tuttavia, è possibile incorporare cellule stromali nei modelli 3D (ad esempio, fibroblasti, leucociti e macrofagi) studiare l'effetto delle interazioni tumore stromale sull'adesione cellula tumorale e invasione 15-17.
Cellule epiteliali mammarie in coltura crescono in modo più efficace quando le proteine ECM come laminina e collagene sono presenti. Con questa nota, una miscela di matrice disponibile in commercio è stata derivata da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumore murino ed è noto come matrice della membrana Matrigel seminterrato 2,8. Un certo numero di tecniche sono state stabilite a crescere cellule epiteliali come colonie 3D a matrice membrana basale 2,8. Il piano seminterrato modello a matrice membrana 3D è efficace per stabilire delle cellule del seno sia maligno e non malignocrescita, simile a quello che sta succedendo nell'ambiente in vivo 18,19. Cellule MCF10A sono cellule epiteliali mammarie non maligne. Quando coltivate in matrice membrana basale, queste cellule mostra a tratti vivo delle cellule normali del seno e sottoporsi controllata la proliferazione cellulare, la polarizzazione delle cellule, apoptosi e per stabilire lo spazio lume 8,12,20. Inoltre, la comparsa di nuclei di cellule di MCF10A formano acini in culture 3D avvicinano maggiormente a quelle delle cellule epiteliali mammarie in tessuto da quelle coltivate in monostrato 21. Gli studi di Bissell e colleghi sono stati i primi a rivelare che le cellule mammarie maligne possono essere differenziate da cellule della mammella non-maligne quando coltivate in un ambiente ricco di laminina, poiché le cellule maligne mostrano un fenotipo altamente disorganizzata, un aumento della proliferazione, diminuzione cellula- adesione cellulare, aumento dell'espressione di marcatori mesenchimali e un aumento del numero di struttura invasiva formano 3,6,22.
Anomalie del l'ambiente cellulare possono influenzare la formazione del tumore 20. Il metodo di coltura 3D può essere usato per studiare efficacemente la comunicazione che avviene tra le cellule tumorali e l'ambiente circostante e determinare come influenze espressione proteica tale 14,20,21,23 comunicazione. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per crescere MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in culture 3D per analizzare invasività, e per studiare la perdita di morfologia epiteliale utilizzando un marcatore epiteliale laminina, un componente della membrana basale cellulare 18,19,24, 25. Le procedure dettagliate consentono di quantificare con precisione e riproducibile stellato (invasive) formazione della struttura da qualsiasi cellula di cancro invasivo e non è limitante per le linee cellulari del cancro al seno comuni (come MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, o T47D ). Pertanto, questo test può servire come piattaforma per valutare come espressione della proteina in cellule o trattamento con pro o anti-composti invasive regolano la degradazione della matrice extracellulare, da cellule singole o multiple.
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Protocol
1. Cultura tridimensionale delle cellule del cancro al seno in membrana basale Matrix (La Tecnica Embedment)
- Manipolazione Matrigel matrice della membrana basale: Scongelare su ghiaccio notte a 4 ° C. Matrice membrana basale è liquido a bassa temperatura ma solidifica a temperatura ambiente. Mantenere matrice membrana basale su ghiaccio (Figure 1A-B).
- Coprire il piatto confocale No.1 fondo di vetro con 50 ml di matrice membrana basale mediante diffusione della matrice usando la punta di un Pipetman P-200 in un modello a spirale (Figura 1C). Prestare attenzione quando la diffusione della matrice membrana basale per evitare la formazione di bolle d'aria. Allo stesso modo, evitare di diffondere la matrice di chiudere i confini del piatto fondo di vetro per evitare la formazione di menisco. Se matrice membrana movimentazione inesperto scantinato, poi preraffreddato il piatto, P-200 Pipetman e pipette può essere di ghiaccio (in alternativa lasciato una notte in frigorifero a 4 ° C). Questo passo offertetempo supplementare per diffondere la matrice membrana basale prima della solidificazione. Porre la capsula (es) in un incubatore di coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO 2) per almeno 30 minuti per consentire la matrice membrana basale a solidificare (Figura 1D).
- Mentre la matrice è in fase di solidificazione, trypsinize un confluente 100 mm piastra 70-80% delle cellule. Una volta che le cellule hanno iniziato sollevamento fuori della piastra, risospendere in 10 ml di terreno RPMI 1640 contenente il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), per inattivare la tripsina (Figura 1E). Poi il trasferimento delle cellule risospese in un tubo da 15 ml (Figura 1F).
- Spin le cellule (presenti nel tubo conico) a 100 xg per 3 minuti in una coltura cellulare centrifuga dedicato (Figure 1G-H).
- Mentre le cellule vengono centrifugati, un'aliquota di 50 ml di matrice in una provetta 1 ml (nota: ogni piatto fondo di vetro viene allocata una provetta, di conseguenza, sel'esperimento richiede 3 piatti, ne consegue che 3 provette da microcentrifuga sono necessari pure), e quindi la provetta in ghiaccio (Figura 1B).
- Aspirare il mezzo dal tubo conico dal punto 1.4, pur lasciando il pellet indisturbato (Figura 1I). Risospendere le cellule (che sono stati filati in giù) in 1 ml di FBS-integrato RPMI (Figura 1J).
- Una volta che le cellule sono contate con un emocitometro (Figura 1K), o un contatore di un'aliquota particella cella 2,5 x 10 4 cellule in provetta e ciliegina sulla torta con opportuno supporto in modo da ottenere il volume totale di 50 microlitri (Figura 1L).
- Mescolare le cellule dal punto 1.7 (25.000 cellule in 50 microlitri) con il tubo per microcentrifuga matrice contenente da passo 1,5 in rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 microlitri (Figura 1M).
- Piastra delicatamente 100 ml di matrice: miscela di cellule dal punto 1.8 sulla sPiatto olidified membrana basale matrice rivestita dal punto 1.2 (Figura 1N). Questo permette alle cellule di essere incorporati in matrice membrana basale.
- Trasferire il piatto (es) nell'incubatore coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO 2) e lasciare la matrice: miscela di cellule solidificare per almeno 30 min.
- Una volta che la matrice: miscela di cellule è solidificato, aggiungere 2 ml di media RPMI FBS-integrate per il piatto (Figura 1O) e prendere il piatto indietro l'incubatrice dove verrà conservato per il resto dell'esperimento (Figura 1P).
- Cambiare media ogni giorno per un periodo di 5 giorni (o secondo la richiesta per un saggio, la durata del saggio per MDA-MB-231 cellule è di 5 giorni di lunghezza).
- Utilizzando un microscopio ottico, prendere contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini delle MDA-MB-231 colonie sospese in matrice membrana basale (Figura 3A). Immagine 20 aree rappresentative a 10 volte più fine, una volta al giornoper cinque giorni per determinare colonia morfogenesi (Figura 3C).
- Analizzare le immagini ciecamente per determinare colonia di cellule stellate formazione (Figura 3B). Una colonia è considerata stellate se una o più sporgenze dal sferoide di cellule sono percepiti. Per determinare la percentuale di colonie stellate invasive, dividere il numero di colonie stellate per il numero totale di colonie di cellule per immagine acquisita, e poi la media delle colonie stellate percentuali delle 20 immagini per ogni giorno.
Figura 1. Cultura tridimensionale di MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in matrice membrana basale (la tecnica incastro). AB) Uno schema del setup sperimentale (eseguita nella cappa). C) Il pozzo del piatto fondo di vetro rivestitocon 50 ml di matrice membrana basale. D) Lavastoviglie (es) posto in un incubatore di coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO 2) per consentire la matrice a solidificare per almeno 30 min. state tripsinizzate E) Cellule. F ) Le cellule sono state risospese in una provetta conica da 15 ml. GH) Cells (presenti nel tubo conico) sono stati centrifugati a 100 xg per 3 minuti in un tessuto cultura centrifuga. I) pellet. J) Cells (che sono stati centrifugati) sono stati risospesi in 1 ml di FBS-integrata mezzo RPMI. K) Le cellule sono state contate con un emocitometro. L) 2,5 x 10 4 cellule aliquotati in provetta e condito con appropriati mezzi di comunicazione in modo da ottenere il volume totale di 50 microlitri. M ) Mescolare cellule dal punto 1.7 (25.000 cellule in 50 microlitri) con il tubo per microcentrifuga matrice contenente da passo 1,5 in rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 μ., L N) piastra delicatamente 100 ml di matrice: miscela di cellule dal punto 8 sul piatto matrice rivestite solidificato dal punto 1.2 O) Una volta che la matrice: miscela di cellule è solidificato, aggiungere 2 ml di mezzi di RPMI FBS-integrati a. il piatto. P) porre il recipiente in incubatrice dove sarà memorizzato per il resto dell'esperimento.
2. Esame delle caratteristiche morfogenetiche delle Culture 3D con immunofluorescenza
- Impostare un vassoio di ghiaccio, fosfato freddo soluzione tamponata (PBS), 20% di acetone: 80% di metanolo (soluzione fissativo), e il 3% albumina sierica bovina (BSA, soluzione bloccante) (Figura 2A) prima di prendere il piatto (es) dall'incubatore.
- Porre la capsula (es) sul vassoio ghiaccio e aspirare media, poi lavare 3x con 2 ml di PBS freddo (Figura 2B).
- Dopo l'ultimo lavaggio PBS viene aspirato, aggiungere 2 ml di 20% acetone: soluzione di metanolo 80% nel piatto (es) (Figura 2C (Figura 2D).
- Dopo il 20 min di fissazione è terminata, portare i piatti indietro a temperatura ambiente, aspirare il fissativo, e successivamente lavare 3x con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio PBS viene aspirato, aggiungere 2 ml di 3% BSA al piatto (es) per bloccare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 2E).
- Durante il periodo di blocco preparare diluizioni di primaria (laminina V 1:100) e anticorpi secondari (ad una diluizione appropriata) disciolti in 3% di siero albumina bovina (BSA) tampone di bloccaggio. Si prega di notare che 400-500 microlitri della soluzione 'BSA anticorpo primario +' deve essere aggiunto direttamente sulla matrice: miscela di cellule.
- Una volta che il blocco di 30 min scaduta, aggiungere l'anticorpo primario e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2F). Si prega di notare che non lavaggi PBS devono essere eseguiti seguendo la 30 min blockinperiodo di g.
- Al termine della fase 2.6, rimuovere la soluzione 'BSA + primario di anticorpi', e lavare 3x con PBS.
- Aggiungere l'anticorpo secondario disciolto in 3% BSA (ad una diluizione appropriata) direttamente sulla matrice: miscela di cellule, coprire i piatti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (figura 2G).
- Rimuovere la soluzione 'BSA + anticorpo secondario', e lavare 3x con PBS.
- Aggiungere 2 ml di Hoechst 33258 (1:10.000) disciolti in PBS per nuclei colorazione, e incubare per 5 min sotto un foglio di alluminio (o coprire con un contenitore opaco per limitare fotoscolorimento) (Figura 2H).
- Una volta che la 5 min di incubazione con Hoechst 33258t sono scaduti, lavare il piatto (es) 5x con PBS.
- Aggiungere mezzo di montaggio direttamente sulla matrice: miscela di cellule nel piatto confocale e coprire con coprioggetto vetro con cautela per evitare indurre eventuali interruzioni per l'integrità delle colonie nel matri membrana basalex: miscela di cellule (Figura 2I).
- Lasciare il piatto (es) per asciugare tutta la notte (o 24 ore) a temperatura ambiente (Figura 2I). Una volta asciutto, il piatto (es) può essere conservato a -20 ° C, ma si raccomanda che essi dovrebbero essere ripreso al più presto.
- Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza con opportune lunghezze d'onda laser di anticorpi utilizzati (Figure 3D-E).
Figura 2. Esame delle culture 3D mediante immunofluorescenza. . A) Uno schema del setup sperimentale B) Dish (es) posto sulla vaschetta del ghiaccio e dei media aspirato; Successivamente le cellule sono state lavate tre volte con 2 ml di PBS freddo C) 2 ml di 20% acetone:. soluzione di metanolo 80% aggiunto nel piatto (es) D) Fissare le cellule per.20 min a 4 ° C (sul ghiaccio, o in frigorifero). E) 2 ml di 3% BSA aggiunto al piatto (es) per bloccare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. F) Una volta che il 30 min di blocco sono scaduti, aggiungere gli anticorpi primari e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente G) anticorpi secondari disciolti in 3% BSA (ad una diluizione appropriata) sono stati aggiunti direttamente sulla matrice membrana basale:. miscela di cellule; . successivamente piatti coperti e incubate per 1 ora a temperatura ambiente H) 2 ml di Hoechst (1:10.000; disciolto in PBS) aggiunto alla dishe (i) e le cellule incubate per 5 minuti sotto un foglio di alluminio I) Soluzione di montaggio aggiunto direttamente. sulla matrice: miscela di cellule nel piatto confocale e il piatto è coperto con vetrino coprioggetti. Lavastoviglie (es) essicca per una notte (o 24 ore) a temperatura ambiente.
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Representative Results
Un esempio dei MDA-MB-231 cellule invasione nel matrice 3D è illustrato in Figura 3C. Le celle sono incorporate in una matrice (giorno 1), e cominciano a formare invasive (stellate) strutture dal giorno 3, e completamente invadono nella matrice da 5 ° giorno (Figura 3C). Il numero di colonie formate stellate sono contati, ed espresso come percentuale del numero totale di colonie per piastra (invasive e non invasive). Inoltre, poiché le misurazioni vengono effettuate giornalmente per cinque giorni, il tasso di invasione può anche essere valutato.
Che stabilisce un calendario di eventi morfogenetici fornisce una base per testare numerosi parametri in questi saggi. Ad esempio, le cellule del cancro al seno possono essere trattati con farmaci anti-cancro o farmaci che possono promuovere citoscheletro ri-arrangiamento, e gli effetti di questi farmaci sulla invasione possono essere accertate, rispetto alle cellule non stimolate e veicolo controlla 24. In alternativa, la capacità del seno puòcellule CER per formare sporgenze invasive possono essere quantificati al momento modificare geneticamente le cellule per esprimere un potenziale oncogene o espressione genica ridotto utilizzando RNA interference (come shRNA) 18,24,25.
Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di colture cellulari 3D come strumento sperimentale è la capacità di analizzare le caratteristiche spaziali e temporali di molecole di segnalazione importanti durante cellulari cambiamenti morfologici. Utilizzando immunofluorescenza, l'espressione di queste molecole può essere rilevata visivamente all'interno della cultura 3D. In Figura 3E, mostriamo rappresentativi invasivi (stellate) colonie dei MDA-MB-231 cellule che mostrano una perdita di integrità della membrana e localizzazione diffusa della proteina membrana basale laminina V 24. In netto contrasto con quanto si osserva nelle cellule di cancro al seno, la laminina V è stato localizzato ad una cantina strato di membrana intatta che racchiude la acini mammaria di cellule MCF10A non-maligne non trattate (Figura3E) 24.
Figura 3. Acquisizione di immagini e illustrazione di immagini rappresentative. A) contrasto interferenziale immagini scattate con un microscopio. B) differenziale (DIC) microscopio di imaging utilizzato per acquisire le immagini e successivamente le immagini analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini. C) campione rappresentativo immagini DIC di MDA-MB-231 cellule (assunto una volta al giorno per cinque giorni) sono mostrati. One-way ANOVA seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett: *, P <0.05. Barra della scala, 100 micron. D) acquisizione delle immagini con microscopio a fluorescenza. E) sono mostrate le immagini del campione di immunofluorescenza raffiguranti V localizzazione laminina in MDA-MB-231 (coltivato per 5 giorni) e le cellule MCF10A (coltivate per 12 giorni). Barra della scala, 20 micron.
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Discussion
Lo sviluppo delle tecniche di coltura cellulare 3D ha permesso ai ricercatori di studiare la trasformazione di cellule epiteliali mammarie, che ci permette di visualizzare i drammatici cambiamenti morfologici. Oltre ad analizzare invasione cellulare, sferoidi epiteliali mammarie singole o multicellulari possono essere usate per valutare i cambiamenti nella adesione cellulare, la proliferazione, la dimensione e basale-apicale polarità. In contrasto con metodologie precedentemente riportati in cui le cellule vengono sovrapposte con ECM 8, il nostro metodo incorpora le celle ECM 18,19,24, che consente di invasione multidirezionale da quantificare. Questi innovativi modelli di coltura 3D permettono ai ricercatori di studiare i cambiamenti fenotipici che non sono possibili quando si studia le cellule in monostrato, con i tradizionali saggi di invasione camera transwell. Attraverso l'integrazione di entrambe le strategie biochimiche e farmacologiche insieme con l'analisi di immunofluorescenza confocale di colonie di cellule, i modelli 3D hanno facilitato la capacità di attenzioney analizzare alterazioni morfologiche con più raffinatezza e dettaglio. Questa tecnica ha quindi favorito la nostra comprensione dei meccanismi che influenzano l'avvio e l'avanzamento del cancro.
Abbiamo trovato che il numero ottimale per la placcatura di MDA-MB-231 cellule per piatto confocale è stato determinato in 25.000 cellule. L'aumento di questo numero di cellulare potrebbe potenzialmente portare ad una eccessiva seminterrato degradazione della matrice della membrana (denominato 'il fenomeno smerigliatura'), e, quindi, non sarebbe consigliato. Tuttavia, il numero di cellule superiori possono funzionare se altri parametri sono regolati, come ad esempio con un conseguente aumento di volume matrice membrana basale. Inoltre, miscele matrice della membrana basale possono variare in concentrazione da un lotto all'altro. Quindi è importante per testare inizialmente la miscela per la sua capacità di sostenere normale morfogenesi di cellule epiteliali mammarie non maligne in saggi 3D. Quando l'imaging 3D culture, sorgono problemi unici che sonoNon presente quando l'imaging culture coltivate in monostrato. Dato che le colonie coltivate in matrice membrana basale sono multi-dimensionale, intere strutture possono perdere quando l'imaging se si trova al di fuori del piano di messa a fuoco. Questo è superata di imaging utilizzando confocale Z-stack che permettono immagini da adottare piani multipli e quindi ogni singola struttura invasiva della colonia 3D può essere ripreso.
Abbiamo anche determinato che la acetone 20%: soluzione di metanolo 80% è l'agente ottimale per il fissaggio colonie incorporati nella matrice membrana basale, rispetto all'utilizzo di altri fissativi, come paraformaldeide con soluzione di Triton-X. Abbiamo scoperto che l'acetone: metanolo fissativo migliora immunomarcatura e tende a ridurre sfondo autofluorescenza. Tuttavia, l'ottimizzazione della procedura di colorazione è necessario in ogni esperimento, al fine di determinare le diluizioni anticorpali ideali che siano diversi da quelli tipicamente impiegati per la colorazione monostrato. La maggior parte Antibodies che opera su monostrati può essere utilizzato per immunostaining 3D. Tuttavia, la lunghezza del tempo di incubazione con l'anticorpo può variare, e questo dovrà essere determinata su base individuale.
Imaging culture 3D per studi di immunofluorescenza può comportare qualche sfida 8. Per superare il problema di 'sfocatura / granulosità' a causa dello spessore del provino, alcuni passaggi possono essere adottate per migliorare la qualità di immagine, quale l'acquisizione Z-stack del campione o aumentando il tempo di esposizione, e aumentando il numero telaio medio . Questo è estremamente utile per distinguere stellate (invasivo) rispetto alla morfologia sferoidale piuttosto che acquisire un'immagine in un piano. La Z-stack ripreso può anche essere trattato per rendere una immagine 3D del campione che mostrano il immunocolorazione. Inoltre, utilizzando le linee MDA-MB-231 o cellule MCF10A, noi di successo aggregati di cellule formate nel periodo di tempo coltivate. Così, siamo stati in grado di esaminare la posizionee le variazioni di espressione di marcatori di polarità delle cellule nelle colture 3D mediante immunofluorescenza. In alternativa, aggregati cellulari possono essere pre-formate prima di essere immessi nella matrice membrana basale e la localizzazione di proteine di interesse possono essere valutati.
Per concludere, la varietà di possibili applicazioni rende l'uso di colture 3D un test dinamico che può essere utilizzato con un ampio spettro di cellule, sia patologica e / o normale in origine per consentire la valutazione delle variazioni di morfologia e invasione cellulare in campioni fissati o in tempo reale 18,19,24.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
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