Summary
Denne artikkel gir detaljerte metoder for anvendelse av tre-dimensjonale (3D) analyser for å kvantifisere brystkreft celle invasjon. Nærmere bestemt diskuteres de prosedyrer som kreves for å sette opp slike analyser, kvantifisering og data-analyse, så vel som fremgangsmåter for å undersøke tap av membranintegritet som oppstår når cellene invadere.
Abstract
Det er nå godt kjent at mobilnettet og vev mikromiljøet er kritiske regulatorer som påvirker startfasen og progresjon. Videre har den ekstracellulære matriks (ECM) blitt demonstrert å være en viktig regulator av celle oppførsel i kultur og homeostase in vivo. Den nåværende metode for dyrking av celler på to-dimensjonal (2D), plast-overflater resulterer i forstyrrelser og tap av komplekse interaksjoner mellom celler og deres mikromiljø. Ved bruk av tre-dimensjonale (3D) kulturanalyser, blir betingelsene for celle-mikromiljøet interaksjonen etablert ligner in vivo mikromiljøet. Denne artikkelen gir en detaljert metode for å dyrke brystkreft celler i en 3D basalmembran protein matrix, eksemplifiserer potensialet i 3D-kultur i vurderingen av celle invasjon i det omkringliggende miljøet. I tillegg diskuterer vi hvordan disse 3D-analyser har potensial til å undersøke tapet av signale Molecmodulene som regulerer epithelial morfologi ved farging prosedyrer. Disse studiene hjelpemiddel for å identifisere viktige mekanistiske detaljer i prosessene som regulerer invasjon, som kreves for spredning av brystkreft.
Introduction
Migrasjon og invasjon av individuelle eller kollektive celler er to kjennetegnene ved kreft, og kreves for metastatisk spredning av kreftceller 1-4. Muligheten av kreftceller til å initiere metastasering avhenger av deres evne til å migrere og invadere i den nærliggende vev ved hjelp av invadopodia å nedbryter basalmembranen til cellene. Invadopodia er dynamiske aktin rike matriksdegradering utstikkere som muliggjør nedbrytning av ekstracellulære matrise gjennom utgivelsen av matrix-nedverdigende proteaser fem. Cancer celle invasjon involverer nedbrytning av matriksen etterfulgt av vandring av kreftcellene, og dette er ledsaget av en omstilling av tre-dimensjonale (3D) miljø matrise 2.. Således, for å trenge gjennom grunnmassen, må en celle omdanne formen og samhandle med den ekstracellulære matriks (ECM) 2.
Vedlikeholdet av brystvev integritet avhenger av tett controlled vevsarkitektur siden celle-ECM og celle-celle adhesjon veikryss påvirke genuttrykk og forstyrrelse av epitel polaritet kan føre til utbruddet av kreft 6-10. Men de fleste in vitro migrasjon og invasjon analyser som Transwell kammer analyser eller sår-skrape analysene er to-dimensjonale (2D) og dermed disse forsømmer de intrikate samspillet mellom celler og deres tilstøtende miljø 3,6,8,11-14. Betydelige morfologiske og funksjonelle forskjeller inkludert variasjoner i mobilnettet morfologi, cellulær differensiering, celle-matrix voksninger og genutrykksmønster har blitt oppdaget ved dyrking celler i 3D kulturer som ofte mangler i 2D-analysene 2,6,8,11. Dermed bruker av 3D-analyser er betydelig gunstig i rekapitulere en mer fysiologisk in vivo tilstand, som fører til en bedre oversettelse av banebrytende funn i grunnforskning til klinikken 6-10. Imidlertid bør det bemerkes, Til tross for de mange fordeler oppnådd ved bruk av 3D-kulturer, kan denne modellen ikke fange opp alle av kompleksiteten av in vivo-tumormikromiljøet som inneholder forskjellige celletyper. Imidlertid er det mulig å innlemme stromale celler i 3D modellene (for eksempel fibroblaster, leukocytter og makrofager) for å studere virkningen av tumor-stromal interaksjoner på cancer celle adhesjon og invasjon 15-17.
Bryst epiteliale celler i kultur vokser mest effektivt når ECM-proteiner slik som laminin og kollagen er til stede. Med denne kjente, har et kommersielt tilgjengelig matriseblandingen er avledet fra Engelbreth-Holm-sverm (HMS) murine tumor og er kjent som Matrigel basalmembran matrise 2,8. Det er etablert en rekke teknikker for å vokse epitelceller som 3D-kolonier i kjelleren membran matrise 2,8. Den 3D basalmembran matrise modellen er effektivt for å etablere både ondartede og ikke-ondartede brystcellevekst, som likner det som forekommer i in vivo miljø 18,19. MCF10A celler er ikke-maligne mammary epitelceller. Når dyrket i basalmembran matrise, disse cellene utstillings in vivo egenskaper av normale brystceller og gjennomgår kontrollert celleproliferasjon, cellepolarisering, og apoptose for å etablere lumen plass 8,12,20. Videre utseendet på cellekjerner av MCF10A celler danner acini i 3D kulturer nærmere likne de av mammary epitelceller i vev enn de som dyrkes i monolayer 21. Studier av bissell og medarbeidere var de første til å vise at ondartede brystcellene kan skilles fra ikke-maligne bryst celler når de dyrkes i et laminin rike omgivelser, siden de ondartede cellene viser en svært uorganisert fenotype, økt proliferasjon, nedsatt celle-til- celleadhesjon, økt ekspresjon av mesenchymale markører og en økning i antall invasive struktur dannet 3,6,22.
Abnormiteter i cellemiljøet kan påvirke tumordannelse 20. Den 3D kulturmetode kan brukes for effektivt å studere kommunikasjon som oppstår mellom tumorceller og deres omkringliggende miljø, og bestemme hvor protein expression påvirkninger slik kommunikasjon 14,20,21,23. Denne artikkel gir en detaljert metode for å dyrke MDA-MB-231 bryst-kreftceller i 3D-kulturer for å analysere invasivitet og for å studere tap av epithelial morfologi ved hjelp av en epitelial markør laminin, en komponent av cellen basalmembran 18,19,24, 25. Den detaljerte fremgangsmåter gjør det mulig å nøyaktig og reproduserbart kvantifisere stel (invasiv) struktur dannelse av noen invasive kreftcelle, og er ikke begrenset til de vanlige brystcancercellelinjer (for eksempel MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, eller T47D ). Således kan denne analysen tjene som en plattform for å vurdere hvor protein ekspresjon i celler eller behandling med pro-og anti-invasive forbindelser regulere ekstracellulære matrise degradering, av én eller flere celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Tredimensjonal Culture av brystkreft celler i Basement Membrane Matrix (The Nedgraving Technique)
- Håndtering Matrigel basalmembran matrise: Tine på isen over natten ved 4 ° C. Basalmembran-matrisen er flytende ved lave temperaturer, men størkner ved romtemperatur. Hold kjelleren membran matrise på is (figur 1A-B).
- Dekk Confocal No.1 glassbunn tallerken med 50 pl basalmembran matrise ved hjelp av å spre matrisen ved hjelp av spissen på en P-200 Pipetman i et spiralmønster (figur 1C). Vær forsiktig når du sprer kjelleren membran matrise for å unngå dannelse av luftbobler. På samme måte, unngå å spre matrisen til nær grensen til glassbunn rett til å hindre menisk formasjon. Hvis uerfaren håndtering kjelleren membran matrise, deretter precooled fatet, P-200 Pipetman og pipetter kan være på isen (alternativt igjen over natten i kjøleskap ved 4 ° C). Dette trinnet tilbudytterligere tid til å spre basalmembran matrisen før størkning. Sett fatet (e) i en cellekulturinkubator (ved 37 ° C med 5% CO2) i minimum 30 min for å muliggjøre basalmembran matrisen til å størkne (fig. 1D).
- Når grunnmassen er under størkning, trypsinize en 70-80% sammenflytende 100 mm plate av celler. Når cellene har begynt å løfte bort fra platen, resuspendere dem i 10 ml RPMI 1640-medium inneholdende 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), for å inaktivere trypsin (figur 1E). Deretter overføres de resuspenderte celler til et 15 ml konisk rør (fig. 1F).
- Spinn-celler (som er tilstede i konisk rør) ved 100 x g i 3 min i en dedikert cellekultur sentrifuge (figurene 1G-H).
- Mens cellene blir spunnet ned, delmengde 50 mL av matrisen inn en 1 ml mikro tube (merk: er hvert glass bunn fatet tildelt en mikrosentrifuge tube, derfor hviseksperimentet krever tre retter, så følger det at tre mikrosentrifugerør er nødvendig i tillegg), og deretter plassere røret på is (figur 1B).
- Aspirere mediet fra det koniske røret fra trinn 1.4, mens forlater pelleten uforstyrret (figur 1I). Resuspender celler (som er blitt spunnet ned) i 1 ml FBS-supplert RPMI medium (figur 1J).
- Når cellene telles ved bruk av et hemocytometer (figur 1K), eller en celle partikkelteller alikvot 2,5 x 10 4 celler inn i mikrosentrifugerør, og toppen av det hele ved hjelp av egnet medium slik at det oppnås totalt volum på 50 pl (Fig. 1L).
- Bland cellene fra trinn 1.7 (25 000 celler i 50 ul) med matrisen holdige mikrosentrifugerør fra trinn 1,5 i forholdet 1:1; sluttvolum vil være 100 ul (figur 1m).
- Forsiktig plate 100 ul av matriksen: celleblandingen fra trinn 1.8 på solidified kjelleren membran matrise-belagt fatet fra trinn 1.2 (Figur 1N). Dette gjør det mulig for cellene å bli innleiret i basalmembran matrise.
- Overfør fatet (e) inn i cellekulturinkubator (ved 37 ° C med 5% CO 2) og tillate at matrise: celleblanding å stivne i minst 30 min.
- Når matrisen: celleblanding er størknet, tilsett 2 ml FBS-supplert RPMI media til fatet (fig. 1O) og ta formen tilbake i inkubatoren, hvor den vil bli lagret for resten av eksperimentet (figur 1P).
- Endring media hver dag for en periode på 5 dager (eller som per som kreves for en analyse, varigheten av analysen for MDA-MB-231-celler 5 dager i lengde).
- Ved hjelp av et lysmikroskop, kan differensialinterferenskontrast (DIC) bilder av MDA-MB-231 kolonier suspendert i basalmembran matriks (figur 3A). Bilde 20 representative områder på 10X objektiv en gang om dageni fem dager for å bestemme koloni morfogenese (Figur 3C).
- Analysere bilder blindt å bestemme celle koloni stel formasjonen (Figur 3B). En koloni anses å være stel hvis en eller flere anslag fra spheroid av celler blir oppfattet. For å bestemme hvor stor prosentandel av invasive stel kolonier, dele antall stel kolonier av det totale antallet cellekolonier per kjøpte bildet, og deretter gjennomsnitt de stel kolonier prosenter av de 20 bildene for hver dag.
Figur 1. Tredimensjonal kulturen i MDA-MB-231 brystkreftceller i kjelleren membran matrise (embedment teknikk). AB) Et skjematisk av det eksperimentelle oppsettet (utføres i avtrekk). C) Brønnen av glass-bunn fatet belagtemed 50 ul av basalmembran-matrise. D) oppvask (e) er lagt inn i en cellekulturinkubator (ved 37 ° C med 5% CO2) for å tillate at matrisen til å størkne i minst 30 min. E) Cellene ble trypsinisert. K ) Celler ble på nytt oppslemmet i et 15 ml konisk rør. GH) celler (som er tilstede i konisk tube) ble spunnet ned ved 100 x g i 3 min i en vevskultur-sentrifuge. I) cellepellet. J) celler (som er blitt spunnet ned) ble resuspendert i 1 ml FBS-supplert RPMI medium. K) Cellene ble tellet ved bruk av et hemocytometer. L) 2,5 x 10 4 celler alikvotert inn i mikrosentrifugerør og toppet med et egnet medium slik at det oppnås totalt volum på 50 pl. M ) Bland celler fra trinn 1.7 (25 000 celler i 50 ul) med matrisen holdige mikrosentrifugerør fra trinn 1,5 i forholdet 1:1; sluttvolum vil være 100 μ., L N) forsiktig plate 100 ul av matriksen: celleblandingen fra trinn 8 på det størknede matriks-belagte fatet fra trinn 1.2 O) Når matrisen: celle blandingen er størknet, tilsett 2 ml FBS-supplert RPMI media til. fatet. P) Sett fatet i kuvøse hvor det vil bli lagret for resten av forsøket.
2. Undersøkelse av morphogenic Funksjoner av 3D kulturer med Immunfluorescens
- Sett opp en is skuffen, kaldt fosfat bufret løsning (PBS), 20% aceton: 80% metanol (fiksativ løsning), og 3% bovint serum albumin (BSA; blokkering løsning) (Figur 2A) før du tar ut fatet (es) fra inkubatoren.
- Sett fatet (es) på isen skuffen og aspirer media, vask deretter 3x med 2 ml kald PBS (figur 2B).
- Når den siste PBS vaske suges, tilsett 2 ml av 20% aceton: 80% metanol-løsning i formen (e) (Fig. 2C (figur 2D).
- Når 20 min for fiksering er avsluttet, bringer de retter tilbake ved romtemperatur, suge bindemiddel, og deretter vaskes 3 ganger med PBS. Når den endelige PBS vaske suges, tilsett 2 ml av 3% BSA i fatet (e) for å blokkere i minst 30 min ved romtemperatur (figur 2E).
- I løpet av den blokkerende for tilberede fortynninger av primær (laminin V 1:100) og sekundære antistoffer (i en egnet fortynning) oppløst i 3% bovint serumalbumin (BSA) blokkerende buffer. Vær oppmerksom på at 400-500 mL den "BSA + primær antistoff 'løsning bør legges direkte på matrisen: celleblandingen.
- Når 30 min av blokkering har utløpt, legger de primære antistoffer og inkuber i minst 1 time ved romtemperatur (figur 2F). Vær oppmerksom på at ingen PBS vasker bør utføres etter 30 min Blocking periode.
- Ved ferdigstillelse av trinn 2.6, fjerne 'BSA + primær antistoff' løsning, og vaske 3x med PBS.
- Til det sekundære antistoff ble oppløst i 3% BSA (ved passende fortynning) direkte på matriksen: celleblanding, dekke retter og inkuberes i 1 time ved romtemperatur (figur 2G).
- Fjern "BSA + sekundært antistoff"-løsning, og vaskes 3 ganger med PBS.
- Tilsett 2 ml av Hoechst 33258 (1:10.000) oppløst i PBS for atomkjerner flekker, og inkuber i 5 min etter aluminiumsfolie (eller dekk til med en ugjennomsiktig beholder for å begrense fotobleking) (figur 2 H).
- Når 5 min av inkubasjon med Hoechst 33258t har utløpt, vaske fatet (es) 5x med PBS.
- Legg montering medium direkte på matrisen: celle blandingen i confocal tallerken og dekk med glass dekkglass forsiktig for å unngå å fremkalle noen forstyrrelser for integriteten til koloniene i kjelleren membran Matrix: celle blanding (Figur 2I).
- Tillat fatet (e) å tørke over natten (eller 24 timer) ved romtemperatur (figur 2I). Når det er tørt, kan fatet (es) lagres ved -20 ° C, men det er sterkt anbefalt at de bør bli fotografert så raskt som mulig.
- Hente bilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med passende laser bølgelengder av antistoffer som brukes (Tall 3D-E).
Figur 2. Undersøkelse av 3D-kulturer ved immunfluorescens. . A) En skjematisk av det eksperimentelle oppsettet B) Dish (es) plassert på isen skuffen og media aspirert; deretter ble cellene vasket tre ganger med 2 ml kald PBS C) 2 ml av 20% aceton:. 80% metanol-løsning tilsatt i formen (e) D) løser cellene for.20 min ved 4 ° C (enten på is, eller i kjøleskap). E) 2 ml av 3% BSA tilsatt til fatet (e) for å blokkere i minst 30 min ved romtemperatur F.) Når 30 min blokkering har utløpt, tilsett de primære antistoffer og inkuberes i minst 1 time ved romtemperatur G) Sekundære antistoffer som er oppløst i 3% BSA (i en egnet fortynning) ble tilsatt direkte på basalmembranen matrise:. celleblanding; . deretter retter dekket og inkubert i 1 time ved romtemperatur H) 2 ml av Hoechst (1:10.000, oppløst i PBS) tilsatt til dishe (e) og cellene inkubert i 5 min i henhold til aluminiumfolie I) Monterings medium tilsatt direkte. på matrisen: celle blandingen i confocal fatet og parabolen er dekket med glass dekkglass. Antenne (r) igjen for å tørke over natten (eller 24 timer) ved romtemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på MDA-MB-231-celler invaderende i 3D matrisen er illustrert i figur 3C. Cellene blir innleiret i matrisen (dag 1), og begynner å danne invasive (stel) strukturer ved dag 3, og helt invadere i matrisen ved dag 5 (figur 3C). Antallet stel kolonier dannet telles, og uttrykt som en prosentandel av totalt antall kolonier per fatet (invasive og ikke-invasive). I tillegg, siden målingene blir utført daglig i fem dager, frekvensen av invasjonen kan også bli vurdert.
Etablering av en tidslinje over morphogenetic hendelser gir et grunnlag for å teste en rekke parametre i disse analysene. For eksempel kan brystkreft celler behandles med anti-kreftlegemidler eller legemidler som kan fremme cytoskeletal re-arrangement, og effektene av disse legemidler på invasjon kan fastslås, sammenlignet med ustimulerte celler og kjøretøyet kontroller 24. Alternativt, kapasiteten til bryst kanCER-celler for å danne invasive fremspring kan kvantifiseres ved genetisk å modifisere celler for å uttrykke en potensiell onkogen eller redusert genekspresjon ved hjelp av RNA-interferens (slik som shRNA) 18,24,25.
En stor fordel med å bruke 3D-cellekulturer som et eksperimentelt verktøy er evnen til å undersøke de romlige og tidsmessige funksjoner av viktige signalmolekyler under celle morfologiske endringer. Ved å benytte immunfluorescens beising, kan ekspresjonen av disse molekylene bli visuelt oppdaget i 3D-kultur. I figur 3E, viser vi representative invasive (stel) kolonier av MDA-MB-231 celler som viser et tap av membranintegritet og diffus lokalisering av kjelleren membran protein laminin V 24. I sterk motsetning til det som er observert i bryst-kreftceller, ble laminin V lokalisert til et intakt basalmembran sjikt omslutter mammary acini ubehandlede ikke-maligne MCF10A celler (figur3E) 24.
Figur 3. Bilde oppkjøp og illustrasjon av representative bilder. A) kontrast Bilder tatt med et mikroskop. B) Differensiert forstyrrelser (DIC) bildebehandling mikroskop brukes til å hente bilder og senere bilder analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare. C) Prøve representative DIC bilder av MDA-MB-231 celler (tas en gang om dagen for fem dager) er vist. Én-veis ANOVA, etterfulgt av Dunnetts multiple sammenligningstest: * p <0,05. Scale bar, 100 mikrometer. D) Bilde innsamlingen med fluorescerende mikroskop. E) Prøve Immunofluorescent bilder som viser laminin V lokalisering i MDA-MB-231 (dyrket for fem dager) og MCF10A celler (dyrket i 12 dager) er vist. Scale bar, 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av 3D cellekultur teknikker har tillatt forskere å studere transformasjonen av bryst epitelceller, slik at vi kan visualisere dramatiske morfologiske endringer. Foruten å analysere celle invasjon, kan de enkelt-eller flercellede mammary epiteliale sfæroider brukes til å vurdere endringer i cellulær adhesjon, spredning, størrelse, og basal-apikal polaritet. I motsetning til tidligere rapporterte metoder hvor cellene er kledde med ECM 8, bygger vår metode cellene i ECM 18,19,24, noe som gjør det mulig for flerveis invasjon som skal kvantifiseres. Disse innovative 3D kultur modeller tillate forskere å studere fenotypiske endringer som ikke er mulig når en skal studere celler i monolayer, ved hjelp av tradisjonelle Transwell kammer invasjon analyser. Ved inkorporering av både biokjemiske og farmakologiske strategier sammen med konfokal immunfluorescens-analyse av cellekolonier, har 3D-modeller lettet evnen til å forsiktigy analysere morfologiske endringer med mer raffinement og detaljer. Denne teknikken har derfor fremmet vår forståelse av de mekanismene som påvirker initiering og utvikling av kreft.
Vi fant ut at det optimale antallet for plating av MDA-MB-231 celler per confocal fatet var fast bestemt på å være 25 000 celler. Økende denne celle nummer kan potensielt føre til overdreven basalmembran matriksdegradering (referert til som "den Oppfluffingen fenomenet '), og dermed ville ikke anbefales. Imidlertid kan høyere celleantall virke hvis andre parametre blir justert, for eksempel med en medfølgende økning i basalmembran matrisevolum. I tillegg kan basalmembran matriseblandinger varierer i konsentrasjon fra ett parti til et annet. Således er det viktig å først teste blandingen for sin evne til å opprettholde normal morphogenesis av ikke-maligne mammary epitelceller i 3D-assays. Når bildebehandling 3D kulturer, oppstår unike problemer som erikke tilstede da bildebehandling kulturer dyrkes i monolayer. Gitt at kolonier dyrket i kjelleren membran matrise er multi-dimensjonale, kan hele strukturer bli savnet når imaging hvis ligger utenfor fokusplanet. Dette er overvunnet ved hjelp av avbildning confocal Z-stabler som muliggjør bilder for å bli tatt i flere plan, og således hver individuell invasiv struktur av 3D-koloni kan avbildes.
Vi har også fastslått at 20% aceton: 80% metanol-løsning er den optimale middel for fiksering av kolonier innebygd i basalmembran matriks, sammenlignet med bruk av andre festemidler, slik som paraformaldehyd med Triton-X-løsning. Vi har funnet at aceton: metanol bindemiddel forbedrer immunolabeling og har en tendens til å redusere bakgrunns autofluorescens. Imidlertid optimalisering av fargeprosedyre kreves i hvert forsøk, for å bestemme de ideelle antistoff-fortynninger som kan være forskjellige fra dem som vanligvis anvendes for farging monolag. De fleste antibodies at arbeidet med monolag kan benyttes for 3D-farging. Imidlertid kan lengden av inkubasjonstid med antistoffet variere, og dette vil ha til å bli bestemt på en individuell basis.
Imaging 3D kulturer for immunofluorescence studier kan utgjøre noen utfordring åtte. For å overvinne problemet med "uskarphet / kornethet" på grunn av tykkelsen av prøven, kan visse forholdsregler tas for å forbedre kvaliteten av bildet som for eksempel å skaffe Z-stabler av prøven eller ved å øke eksponeringstiden, og økende ramme antallsmidlere . Dette er også meget fordelaktig å skille stel (invasiv) i forhold til kule morfologi i stedet for å skaffe et bilde i ett plan. Den Z-stabel avbildes kan også behandles for å gjengi et 3D-bilde av prøven som viser farging. Videre, ved hjelp av MDA-MB-231-eller MCF10A cellelinjer, har vi lykkes dannede celleaggregatene enn tidsperioden dyrkes. Dermed var vi i stand til å undersøke plasseringenog endringer i uttrykk av celle polaritet markører i 3D kulturer ved immunfluorescens. Alternativt kan cellulære aggregater kan være forformet før den ble plassert i basalmembranen matrisen og lokalisering av proteiner av interesse kan deretter bli evaluert.
For å konkludere, gjør variasjonen av mulige applikasjoner ved bruk av 3D-kulturer en dynamisk test som kan benyttes med et vidt spektrum av celler, enten patologiske og / eller normal opprinnelse slik at for evaluering av endringer i cellulær morfologi og invasjon i faste prøver eller i sanntid 18,19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al.
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
