Summary
מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.
Abstract
עכשיו זה ידוע היטב כי microenvironment הסלולרי ורקמות הם רגולטורים קריטיים המשפיעים על התחלה של גידול והתקדמות. יתר על כן, המטריצה תאית (ECM) הוכח להיות רגולטור קריטי של התנהגות תא בתרבות ובהומאוסטזיס בגוף חי. הגישה הנוכחית של תאי culturing על דו ממדים (2D), תוצאות משטחי פלסטיק בהפרעה והאובדן של אינטראקציות מורכבות בין תאים וmicroenvironment שלהם. באמצעות השימוש במבחני תרבות תלת ממדי (3D), את התנאים לאינטראקציה התא microenvironment מבוססים דומה microenvironment in vivo. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדל תאי סרטן השד במטריצת חלבון קרום במרתף 3D, הממחיש את הפוטנציאל של תרבות 3D בהערכת פלישת תא לסביבה. בנוסף, אנו דנים כיצד יש מבחני 3D אלה הפוטנציאל לבדיקת ההפסד של איתות Molecules המווסתים את מורפולוגיה אפיתל ידי immunostaining הליכים. מחקרים אלה יסייעו לזהות פרטים מכניסטית חשובים לתהליכי ויסות פלישה, הנדרשים להתפשטות סרטן השד.
Introduction
הגירה ופלישה של תאים בודדים או קולקטיביים הן שני סימני ההיכר של סרטן, ונדרשת להתפשטות הגרורה של תאי סרטן 1-4. היכולת של תאי סרטן ליזום גרורות תלויה ביכולתם להגר ולפלוש לרקמות השכנות באמצעות invadopodia כדי לבזות את הקרום במרתף של התאים. Invadopodia הם בליטות אקטין עשיר דינמיות השפלה מטריקס המאפשרות פירוק של המטריצה תאית באמצעות השחרור של פרוטאזות משפילות מטריצת 5. פלישת תאי הסרטן כרוכה בהשפלה של המטריצה ואחרי הנדידה של התאים הסרטניים וזה מלווה בארגון מחדש של סביבת המטריצה תלת ממדי (3D) 2. לכן, כדי לחדור דרך המטריצה, תא חייב לשנות את צורתו ואינטראקציה עם מטריקס תאי (ECM) 2.
השמירה על שלמות רקמת שד תלויה בחוזקה controlleארכיטקטורת רקמת ד מאז צמתים הידבקות התא-ECM ותאי תאים משפיעים על ביטוי גנים ושיבוש של קוטביות אפיתל יכולה להוביל להופעת הסרטן 6-10. עם זאת, רוב המבחנה הגירה ופלישת מבחני בכגון transwell מבחני לשכה או מבחני פצע שריטה הם דו ממדי (2D) ולכן אלה להזניח את האינטראקציות המורכבות בין תאים וסביבתם הסמוכות 3,6,8,11-14. הבדלים מורפולוגיים ותפקודיים ניכרים, כולל שינויים במורפולוגיה תאית, התמיינות תאים, הידבקויות של תאי המטריצה ודפוסי ביטוי גנים כבר זוהו על ידי תאי culturing בתרבויות 3D שחסרי בדרך כלל במבחני 2D 2,6,8,11. לכן, משתמש במבחני 3D הם מועילים באופן משמעותי במשחזר יותר פיסיולוגי במצב vivo, שמוביל לתרגום טוב יותר של ממצאי פורצי דרך במחקר בסיסי למרפאת 6-10. עם זאת, יש לצייןלמרות היתרונות רבים שנצברו בשימוש בתרבויות 3D, מודל זה לא יכול לתפוס את כל המורכבות של in vivo microenvironment הגידול הכולל סוגים שונים של תאים. עם זאת, ניתן לשלב את תאי סטרומה לתוך המודלים 3D (לדוגמא, fibroblasts, כדוריות דם לבנות, ומקרופאגים) כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות גידולים סטרומה בהידבקות תאים סרטניים ופלישה 15-17.
תאי אפיתל שד בתרבות לגדול בצורה היעילה ביותר כאשר חלבוני ECM כגון laminin וקולגן הם הווה. עם זה ידוע, תערובת מטריצה זמינה מסחרי כבר נגזרה Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) גידול עכברי והוא ידוע בתור מטריצת קרום במרתף Matrigel 2,8. מספר טכניקות הוקמו כדי לגדל תאי האפיתל כמושבות 3D במטריצת קרום במרתף 2,8. מודל מטריצת 3D מרתף הקרום הוא יעיל להקמת תא שד הן ממאיר ושאינו ממאירצמיחה, שמזכיר את מה שמתרחש בסביבה vivo 18,19. תאי MCF10A הם תאי אפיתל החלב שאינו ממאירים. כאשר גדלו במטריצת קרום במרתף, תערוכת תאים אלה בתכונות vivo של תאי שד נורמלים ועוברים בשליטת התפשטות תאים, קיטוב תא, ואפופטוזיס להקים מרחב הלום 8,12,20. יתר על כן, הופעתו של גרעין תא של תאי MCF10A להרכיב acini בתרבויות 3D דומה יותר לאלו של תאי אפיתל החלב ברקמה מאלה בתרבית monolayer 21. מחקרים על ידי יסל ועמיתיו היו הראשונים לחשוף שיכולים להיות מובחנים תאי שד ממאירים מתאי שד אינו ממאירים כאשר גדלו בסביבת laminin עשיר, שכן התאים הממאירים להציג פנוטיפ לא מאורגן מאוד, גדל בהתפשטות, ירידה בתא אל הידבקות תא, ביטוי מוגבר של סמני mesenchymal וגידול במספר של מבנה פולשנית נוצרו 3,6,22.
חריגות של סביבת התא יכולות להשפיע על היווצרות גידול 20. שיטת תרבות 3D יכול לשמש כדי לחקור ביעילות את התקשורת המתרחשת בין התאים הסרטניים וסביבתם ולקבוע כיצד 14,20,21,23 תקשורת כגון השפעות ביטוי חלבון. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדול מד"א-MB-231 תאי סרטן השד בתרביות 3D לנתח הפולשנות, וללמוד את האובדן של מורפולוגיה האפיתל באמצעות laminin סמן אפיתל, מרכיב של הקרום במרתף תא 18,19,24, 25. הנהלים מפורטים לספק את היכולת במדויק וreproducibly לכמת stellate היווצרות מבנה (פולשנית) על ידי כל תא סרטן פולשני ולא מגבילה לשורות תאי סרטן שד השכיח (כגון מד"א-MB-231, Hs578T, MCF-7, או T47D ). לפיכך, assay זה יכול לשמש כפלטפורמה להערכה איך ביטוי חלבון בתאים או בטיפול בפרו או אנטיתרכובות פולשנית להסדיר השפלה מטריצה תאית, על ידי תאים בודדים או מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות תלת ממדית של תאי סרטן השד בממברנה מטריקס מרתף (טכניקת Embedment)
- מטריצת קרום במרתף טיפול Matrigel: הפשירו על קרח לילה בשעה 4 ° C. מטריצת קרום במרתף היא נוזלית בטמפרטורה נמוכה, אבל מתמצקת בטמפרטורת חדר. שמור על מטריצת קרום במרתף על קרח (1A-B איורים).
- מכסה את צלחת Confocal מס '1 זכוכית תחתונה עם 50 μl של מטריצת קרום מרתף באמצעות הפצת המטריצה באמצעות קצה Pipetman P-200 בתבנית ספירלה (איור 1 ג). היזהר בעת הפצת מטריצת הקרום במרתף, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. כמו כן, להימנע מלהפיץ את המטריצה כדי לסגור את גבולותיה של צלחת הזכוכית תחתונה כדי למנוע היווצרות מניסקוס. אם מטריצת קרום במרתף טיפול חסר ניסיון, אז precooled הצלחת, P-200 Pipetman וטפטפות יכולה להיות על קרח (משמאל לחלופין הלילה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס). הצעות צעד זהזמן נוסף כדי להפיץ את מטריצת קרום במרתף לפני ההתמצקות. מניחים את הצלחת (ES) בתרבית תאי חממה (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) לפחות 30 דקות כדי לאפשר את מטריצת קרום במרתף כדי לחזק (1D איור).
- בעוד המטריצה עוברת מיצוק, trypsinize 70-80% צלחת 100 מ"מ מחוברות של תאים. ברגע שהתאים החלו מרימים את הצלחת, resuspend אותם ב10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני המכיל 10% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), כדי להשבית טריפסין (איור 1E). לאחר מכן להעביר את תאי resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר (איור 1F).
- ספין התאים (הנמצאים בצינור חרוטי) בשעה 3 דקות 100 XG בצנטריפוגה בתרבית תאים ייעודית (איורים 1G-H).
- בעוד שהתאים נמצאים הסתחררו למטה, aliquot 50 μl של מטריקס לתוך צינור מיליליטר 1 microcentrifuge (הערה: כל מנה עם רצפת זכוכית מוקצה צינור microcentrifuge אחד, ולכן, אםהניסוי דורש 3 מנות, אז המסקנה הוא ש3 צינורות microcentrifuge נחוצים גם כן), ולאחר מכן למקם את הצינור על קרח (איור 1).
- לשאוב את המדיום מצינור חרוטי משלב 1.4, תוך השארת גלולה ללא הפרעה (איור 1I). תאי resuspend (כי כבר הסתחררו למטה) ב 1 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת-FBS (איור 1J).
- ברגע שהתאים נספרים באמצעות hemocytometer (איור 1K), או aliquot חלקיקי דלפק תא 2.5 x 10 4 תאים לתוך צינור microcentrifuge והדיפו אותה באמצעות תקשורת המתאימה כדי להשיג נפח כולל של 50 μl (איור 1 ליטר).
- מערבבים את התאים מצעד 1.7 (25,000 תאים ב50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה מצעד 1.5 ביחס של 1:1; נפח סופי יהיה 100 μl (איור 1M).
- בעדינות צלחת של המטריצה 100 μl: תערובת תאים מצעד 1.8 על יםמנה olidified קרום במרתף מצופה מטריצה מהשלב 1.2 (איור 1N). זה מאפשר לתאים להיות משובצים במטריצת קרום במרתף.
- מעביר את הצלחת (es) לתוך חממת תרבות תא (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) ולאפשר למטריקס: תערובת תא כדי לחזק לפחות 30 דקות.
- ברגע שהמטריצה: תערובת תא הקרושה, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת-FBS לצלחת (איור 1o) ולקחת את הצלחת בחזרה החממה שבה יאוחסן לשארית של הניסוי (איור 1P).
- שינוי בתקשורת בכל יום לתקופה של 5 ימים (או כמו לכל נדרש לassay; משך assay למד"א-MB-231 תאים הוא 5 ימים באורך).
- באמצעות מיקרוסקופ אור, לקחת התערבות ההפרש לעומת זאת תמונות (DIC) של מושבות מד"א-MB-231 התלויות במטריצת קרום במרתף (איור 3 א). 20 אזורי נציג התמונה ב10X אובייקטיבי פעם ביוםבמשך חמישה ימים כדי לקבוע המורפוגנזה מושבה (איור 3 ג).
- ניתוח תמונות בצורה עיוורת כדי לקבוע היווצרות stellate מושבה תא (איור 3 ב). מושבה נחשבת להיות stellate אם תחזיות אחד או יותר מאליפטית של תאים נתפסות. כדי לקבוע את אחוז מושבות stellate פולשנית, יש לחלק את מספר מושבות stellate במספר הכולל של תא מושבות לכל תמונה שנרכשה, ולאחר מכן בממוצע אחוזי מושבות stellate של 20 תמונות עבור כל יום.
איור 1. תרבות תלת ממדית של מד"א-MB-231 תאי סרטן השד במטריצת קרום במרתף (טכניקת embedment). א.ב.) סכמטי של הגדרת הניסוי (שבוצעה במנדף). ג) גם של המנה עם תחתית הזכוכית המצופהעם 50 μl של מטריצת קרום במרתף נטוורק. ד) (ES) ממוקם בחממה תרבות תא (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) על מנת לאפשר את מטריקס לבסס לפחות 30 דקות תאים. ה) היו trypsinized. F ) תאים היו resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר תאים. GH) (כיום בצינור חרוטי) היו סובבים מטה ב100 XG במשך 3 דקות בצנטריפוגה בתרבית רקמה.) תא גלולה תאים. J) (כי כבר הסתחררו למטה) היו resuspended ב 1 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת-FBS. תאי K) נספרו באמצעות hemocytometer. L) 2.5 x 10 תאים 4 aliquoted לתוך צינור microcentrifuge ועקפו את השימוש במדיה מתאימים בכדי להשיג נפח כולל של 50 μl. M ) מערבבים תאים מצעד 1.7 (25,000 תאים ב50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה מצעד 1.5 ביחס של 1:1; נפח סופי יהיה 100 μ.; L N) בעדינות צלחת של המטריצה 100 μl: תערובת תאים משלב 8 על הצלחת מצופה מטריצה הקרושה משלב 1.2 O) ברגע שהמטריצה: תערובת תא הקרושה, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת-FBS ל. המנה. P) מניחים את הצלחת בחממה שבה תאוחסן לשארית של הניסוי.
2. בחינת תכונות morphogenic של תרבויות 3D עם Immunofluorescence
- הגדר את מגש קרח, פתרון שנאגרו פוספט הקר (PBS), אצטון 20%: מתנול 80% (פתרון מקבע), ו -3% אלבומין בסרום שור (BSA; חסימת פתרון) (איור 2 א) לפני שלקחת את המנה (ES) מן החממה.
- מניחים את הצלחת (ES) בתקשורת מגש הקרח ולשאוב, ולאחר מכן לשטוף 3x עם 2 מיליליטר של PBS הקר (איור 2).
- ברגע לשטוף PBS האחרון להישאף, להוסיף 2 מיליליטר של אצטון 20%: 80% פתרון מתנול לתוך הצלחת (es) (איור 2C (איור 2 ד).
- ברגע ש20 דקות קיבוע הוא הופסק, להביא את המנות בחזרה בטמפרטורת חדר, לשאוב מקבע, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS. ברגע לשטוף PBS הסופי להישאף, להוסיף 2 מיליליטר של BSA 3% למנה (es) לחסום לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר (2E איור).
- במהלך תקופת החסימה להכין דילולים של (V laminin 1:100) הראשוני ונוגדנים משני (בדילול מתאים) מומסים ב3% אלבומין בסרום שור (BSA) חסימת חיץ. אנא שים לב כי 400-500 μl הפתרון 'BSA + נוגדן ראשוני' יש להוסיף על גבי המטריצה ישירות: תערובת תא.
- לאחר דקות 30 של חסימה שפגו תוקפיו, מוסיף את הנוגדנים הראשוניים ודגירה במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר (איור 2F). שים לב שאין שוטף PBS צריך להתבצע הבא blockin 30 דקותתקופה גרם.
- עם השלמת השלב 2.6, להסיר את הפתרון 'BSA + עיקרי נוגדנים', ולשטוף 3x עם PBS.
- מוסיף את הנוגדנים משני מומסים בBSA 3% (בדילול מתאים) ישירות על גבי המטריצה: תערובת תא, מכסה את הכלים ודגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר (איור 2G).
- הסר את פתרון 'BSA + נוגדנים משני', ולשטוף 3x עם PBS.
- הוסף 2 מיליליטר של Hoechst 33258 (1:10,000) מומס PBS עבור מכתים גרעינים, ודגירה של 5 דקות בנייר אלומיניום (או מכסים במכל אטום להגביל photobleaching) (איור 2H).
- לאחר 5 דקות של דגירה עם 33258t Hoechst פקעו, לשטוף את הצלחת (es) 5x עם PBS.
- הוסף בינוני הרכבה ישירות על גבי מטריצה: תערובת תאים בצלחת confocal ולכסות עם coverslip זכוכית בזהירות כדי למנוע גרימת כל שיבושים ביושרה של המושבות במתרי קרום במרתףx: תערובת תא (איור 2 ט).
- לאפשר את הצלחת (ES) לייבוש למשך לילה (או 24hr) בטמפרטורת חדר (איור 2 ט). לאחר יבש, הצלחת (es) יכולה להיות מאוחסנת ב -20 מעלות צלזיוס, אבל זה מאוד מומלץ כי הם צריכים להיות צילמו במהירות אפשרית.
- לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אורכי גל לייזר מתאימים של נוגדנים המשמשים (איורים 3D-E).
איור 2. בחינה של תרבויות 3D על ידי immunofluorescence. .) סכמטי של הגדרת ניסוי כלים ב) (ES) שהונח על מגש הקרח ותקשורת להישאף; לאחר מכן תאים נשטפו שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של PBS הקר C) 2 מיליליטר של אצטון 20%:. 80% פתרון מתנול הוסיף למנה () es ד ') לתקן את התאים ל.20 דקות ב 4 ° C (או על קרח, או במקרר). E) 2 מיליליטר של BSA 3% הוסיפו למנה () es לחסום לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. F) לאחר דקות 30 של חסימה פקעה, מוסיף את הנוגדנים הראשוניים ודגירה במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר G) נוגדנים משניים מומסים בBSA 3% (בדילול מתאים) נוספו על גבי מטריצת הקרום במרתף ישירות:. תערובת תא; . לאחר מכן מנות מכוסות וטופחו במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר H) 2 מיליליטר של Hoechst (1:10,000; מומס PBS) הוסיף לdishe (ES) והתאים טופח במשך 5 דקות בנייר אלומיניום הבינוני) הרכבה הוסיף באופן ישיר. על גבי המטריצה: תערובת תאים בצלחת confocal והצלחת מכוסה בזכוכית coverslip. מנה (es) עזבה לייבוש למשך לילה (או 24hr) בטמפרטורת חדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמא של תאי מד"א-MB-231 הפולשים במטריקס 3D מתואר באיור 3 ג. התאים משובצים במטריצה (יום 1), ולהתחיל להרכיב מבנים פולשנית (stellate) על ידי יום 3, ולפלוש לחלוטין לתוך המטריצה ביום 5 (איור 3 ג). מספר מושבות stellate נוצרות נספרים, והביע כאחוז ממספר הכולל של מושבות בכל צלחת (חודרניות ולא פולשנית). בנוסף, מאז מדידות נעשות מדי יום במשך חמשת הימים, שיעור החדירה יכול גם להיות מוערך.
הקמת ציר זמן של אירועי morphogenetic מספקת בסיס לבדיקת מספר רב של פרמטרים במבחנים אלה. לדוגמא, ניתן לטפל בתאי סרטן השד עם תרופות נגד סרטן או תרופות שעשויות לקדם מחדש את סדר cytoskeletal, ואת ההשפעות של תרופות אלה על פלישה ניתן ללמוד, בהשוואה לתאי unstimulated ורכב שולט 24. לחלופין, יכולה הקיבולת של שדתאי CER כדי ליצור בליטות פולשנית ניתן לכמת על שינוי גנטי של התאים לבטא אונקוגן פוטנציאלי או ביטוי גנים מופחת באמצעות התערבות RNA (כגון shRNA) 18,24,25.
יתרון עיקרי של שימוש בתרביות תאי 3D ככלי ניסויי הוא היכולת לבחון את תכונות מרחב ובזמן של מולקולות איתות חשובות בשינויים מורפולוגיים תא. על ידי ניצול מכתים immunofluorescence, הביטוי של המולקולות הללו ניתן לאתר באופן חזותי בתרבות 3D. באיור 3E, אנו מראים מושבות נציג פולשנית (stellate) של תאי מד"א-MB-231 מוצגות אובדן שלמות הממברנה ולוקליזציה מפוזרת של V laminin חלבון קרום במרתף 24. בניגוד מוחלט למה שרואה בתאי סרטן השד, V laminin היה מקומי לשכבת קרום במרתף ללא פגע מצרפת acini החלב של תאי MCF10A שאינו ממאיר שלא טופלו (איור3E) 24.
איור 3. רכישת תמונה ואיור של תמונות מייצגות. א) התערבות הפרש לעומת זאת תמונות שצולמו במיקרוסקופ. ב) (דסק"ש) מיקרוסקופ ההדמיה שימש לרכישת תמונות ולאחר מכן תמונות נותחו באמצעות מדגם מייצג תוכנת ניתוח תמונה. C) תמונות DIC של מד"א-MB-231 תאים (נלקח פעם ביום למשך חמישה ימים) מוצגים. כיוון אחד ANOVA ואחריו מבחן ההשוואה מרובה של Dunnett: *, P <0.05. תמונת רכישת בר סולם, 100 מיקרומטר. ד ') באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. E) תמונות immunofluorescent לדוגמא המתארות לוקליזציה laminin V במד"א-MB-231 (גדל במשך 5 ימים) ותאי MCF10A (גדלו ל12 ימים) מוצגות. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיתוח של טכניקות תרבית תאי 3D אפשר לחוקרים ללמוד את השינוי של תאי אפיתל שד, ומאפשר לנו לחזות את השינויים מורפולוגיים הדרמטיים. חוץ מניתוח פלישת תא, יכולים לשמש הספרואידים אפיתל החלב היחיד או רב תאיים כדי להעריך את השינויים בהידבקות הסלולר, התפשטות, גודל, וקוטביות הבזליים-apical. בניגוד לשיטות שדווחו בעבר שבו התאים הם כיסו עם ECM 8, השיטה שלנו מטביעה את התאים בECM 18,19,24, המאפשר לפלישת multidirectional לכימות. מודלים אלה התרבות החדשניים 3D לאפשר לחוקרים ללמוד שינויי פנוטיפי שאינם אפשריים כאשר לומדים תאים בmonolayer, באמצעות מבחני קאמריים transwell פלישה מסורתיים. באמצעות השילוב של שני אסטרטגיות ביוכימי והתרופתיות יחד עם ניתוח immunofluorescence confocal של מושבות תאים, מודלים 3D הקלו את יכולת carefully לנתח שינויים מורפולוגיים עם יותר תחכום ופירוט. טכניקה זו ולכן יש קדמה את ההבנות של המנגנונים המשפיעים על הייזום וקידום של הסרטן שלנו.
מצאנו שהמספר האופטימלי לציפוי של מד"א-MB-231 תאים לכל צלחת confocal היה נחוש להיות 25,000 תאים. הגדלת מספר תא זה פוטנציאלי עלולה לגרום להשפלה מוגזמת מרתף קרום מטריצה (המכונה 'התופעה התפיחה'), ובכך, לא יהיה מומלצת. עם זאת, מספרים סלולריים גבוהים יותר עשויים לעבוד אם פרמטרים אחרים מותאמים, כגון עם עלייה נלווית בקרום במרתף מטריצת נפח. בנוסף, תערובות מטריצת קרום במרתף יכולות להשתנות בריכוז מצרור אחד למשנו. לכן חשוב בתחילה לבדוק את התערובת ביכולתה לקיים המורפוגנזה הנורמלית של תאי אפיתל החלב שאינו ממאירים במבחני 3D. כאשר ההדמיה תרבויות 3D, בעיות ייחודיות להתעורר כי הםלא נמצא כאשר ההדמיה תרבויות גדלו בשכבה. בהתחשב בכך שהמושבות גדלו במטריצת קרום במרתף הן רב ממדים, כל מבנים עשויים לפספס כאשר הדמיה אם נמצא מחוץ למטוס של מוקד. זה להתגבר על ידי הדמיה באמצעות Z-ערימות confocal המאפשרות תמונות שיש לנקוט במספר מטוסים ובכך כל מבנה פולשני היחיד של המושבה 3D יכול להיות צילם.
יש לנו גם קבע כי אצטון 20%: 80% פתרון מתנול הוא הסוכן האופטימלי לתיקון מושבות משובצות במטריצת קרום במרתף, בהשוואה לשימוש בסוכני תיקון אחרים כגון paraformaldehyde עם פתרון Triton-X. מצאנו כי אצטון: מקבע מתנול משפר immunolabeling ונוטה לצמצם autofluorescence רקע. עם זאת, אופטימיזציה של ההליך מכתים נדרשת בכל ניסוי, על מנת לקבוע את דילולים נוגדן אידיאליים שעשויות להיות שונה מאלו שבדרך כלל מועסקים לצביעת שכבה. רוב antibodies שעבודה על המשטחים יכול לשמש לimmunostaining 3D. עם זאת, משך זמן דגירה עם הנוגדנים עשוי להשתנות, וזה צריך להיקבע על בסיס פרטני.
הדמיה תרבויות 3D ללימודי immunofluorescence יכול להוות חלק מהאתגר 8. כדי להתגבר על הבעיה של 'טשטוש / גרעיניות "בשל העובי של הדגימה, ניתן לנקוט בצעדים מסוימים כדי לשפר את איכות התמונה כגון רכישת Z-ערימות של הדגימה או הגדלת זמן חשיפה, והגדלת ממוצע מספר מסגרת . זה גם מאוד מועיל להבחין stellate (פולשנית) בהשוואה למורפולוגיה spheroidal ולא רכישת תמונה במישור אחד. Z-המחסנית צילמה גם יכולה להיות מעובד כדי להבהיר תמונת 3D של הדגימה מראה immunostaining. יתר על כן, באמצעות מד"א-MB-231 או תא MCF10A הקווים, אנחנו אגרגטים תא נוצרו מוצלחים על פני תקופת הזמן גדלו. לפיכך, היינו יכול לבחון את המיקוםושינויים בביטוי של סמני קוטביות תא בתרבויות 3D על ידי immunofluorescence. לחלופין, יכולים להיווצר מראש אגרגטים הסלולר לפני שיוצבו לתוך מטריצת הקרום במרתף והלוקליזציה של חלבונים של עניין ואז ניתן להעריך.
לסיכום, מגוון רחב של יישומים אפשריים הופך את השימוש בתרבויות 3D assay דינמי שיכול להיות בשימוש עם מגוון רחב של תאים, בין אם פתולוגי ו / או נורמלי במקור מאפשר ההערכה של שינויים במורפולוגיה ופלישה סלולריות בדגימות קבועות או בזמן אמת 18,19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
