Summary
Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.
Abstract
Şimdi de hücre ve doku mikro çevre tümör başlangıcı ve ilerlemesini etkileyen kritik düzenleyiciler olduğu bilinmektedir. Ayrıca, hücre dışı matris (ECM) in vivo kültür ve homeostazında hücre davranışını önemli bir düzenleyici olduğu gösterilmiştir. Iki boyutlu (2D) üzerindeki hücrelerin kültüre mevcut yaklaşım, hücreler ve bunların mikro arasındaki karmaşık etkileşimlerin rahatsızlık ve zarar plastik yüzeyler sonuçları. Üç boyutlu (3D) kültür tahlillerin kullanımı sayesinde, hücreye mikro-ortam etkileşimi için koşullar, in vivo benzer mikro kurulmuştur. Bu makalede, etrafındaki çevreye hücre istilası değerlendirilmesinde 3D kültür potansiyelini örnekleme, 3 boyutlu bir bazal membran protein matrisi içinde meme kanseri hücrelerinin büyümesini detaylı bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, bu deneyler, 3D molekül ağırlığına işaret kaybını incelemek için potansiyele sahip görüşmekprosedürleri immün epitel morfolojisi Modüller düzenler. Bu çalışmalar meme kanseri yayılması için gerekli istilasını düzenleyen işlemler, içine önemli mekanik bilgilerini tespit etmek yardım.
Introduction
Göç ve bireysel ya da kolektif hücrelerin işgali kanseri iki özellikleridir ve kanser hücrelerinin 1-4 metastatik yayılması için gereklidir. Metastaz başlatmak için kanser hücrelerinin yeteneği göç ve hücrelerin, temel zara inerek için invadopodia kullanarak komşu doku içine işgal etme yeteneğine bağlıdır. Invadopodia matris-bozucu proteazlar 5 salınmasıyla hücre dışı matrisin bozulmasını sağlayacak dinamik aktin zengin matris bozulması çıkıntılar bulunmaktadır. Kanser hücre istilası kanser hücrelerinin taşınması takip matrisin bozulmasını içerir ve bu, üç boyutlu (3D) matris ortamı 2 bir yeniden eşlik eder. Bu durumda, matris boyunca nüfuz bir hücre şekli dönüştürmek ve hücre dışı matrisin (ECM) 2 ile etkileşim gerekir.
Meme dokusu bütünlüğünün bakım sıkı controlle bağlıdırhücre-ECM ve hücre-hücre yapışma bağlantıları gen ekspresyonu ve epitel kutupluluğun bozulması etkilediğinden d, doku mimarisi, kanser 6-10 başlamasından yol açabilir. Ancak, bu tür transwell oda tahlillerde ya da yara tırmığı tahlilleri gibi çok in vitro göçü ve istila deneyleri, iki boyutlu (2B) ve bu nedenle, bu hücreleri ve bunların bitişik çevre 3,6,8,11-14 arasındaki karmaşık etkileşimler ihmal. Hücresel morfoloji varyasyonlar, hücre farklılaşması, hücre-matris adezyonlar ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere önemli morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar genel olarak 2,6,8,11 deneyleri, 2 boyutlu olarak eksik 3B kültürlerinde hücrelerin kültürlenmesi ile tespit edilmiştir. Böylece, kliniğe 6-10 temel araştırma çığır açan bulgularının daha iyi çeviri açan, 3D tahlillerin in vivo durumda bir daha fizyolojik yansıtan anlamlı yararlı edilir kullanır. Bununla birlikte, dikkat edilmelidir3D kültürlerin kullanımı ile kazanılan pek çok avantajı olmasına rağmen, bu model çeşitli hücre tiplerini içeren in vivo tümör mikro tüm karmaşıklığı yakalamak değildir. Ancak, bu 3 boyutlu modellere stromal hücreleri dahil etmek mümkündür (örneğin, fibroblastlar, lökositler ve makrofajlar) kanser hücre yapışması ve yayılması 15-17 tümör stromal etkileşimlerin etkilerini incelemek için.
Örneğin laminin ve kolajen gibi ECM proteinlerinin mevcut olduğu zaman kültür meme epitel hücrelerinin en etkili şekilde büyür. Bu bilinen ile, ticari olarak temin edilebilir matris karışımı Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murin tümör elde edilmiştir ve Matrigel taban membran matrisi 2,8 olarak bilinir. Bir takım teknikler taban membran matrisi 2,8 3D koloniler olarak epitel hücreleri büyütmek için kurulmuştur. 3D bazal membran matrisi modeli habis ve habis olmayan meme hem hücre kurulması için etkilidirbüyümesi, in vivo ortamda 18,19 meydana ne benzer. MCF10A hücreleri habis olmayan meme epitel hücreleridir. Temel zar matris içinde yetiştirildiğinde, bu hücrelerin normal meme hücrelerinin in vivo özellikleri sergiler ve hücre proliferasyonu, hücre polarizasyon ve lümen alanı 8,12,20 kurmak için kontrol apoptoza uğrarlar. Ayrıca, 3D kültürlerde asinüsü oluşturan MCF10A hücrelerinin hücre çekirdeklerinin görünümünü daha yakından dokuda, meme epitelyal hücrelerinin kişilerce tek tabaka 21 içinde kültüre daha benzemektedir. Bissell'e ve arkadaşları tarafından yürütülen çalışmalar, habis hücreler, bir çok düzensiz fenotipi gösterdiğinden, bir laminin zengin bir ortamda yetiştirilen proliferasyon artan azaldığı habis meme hücreleri habis olmayan meme hücrelerinden ayırt edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır için ilk hücreden hücre yapışması, artan mezenkimal markerlerin ekspresyonu ve invazif yapının sayısında bir artış meydana 3,6,22.
Hücre ortamı anormallikleri tümör oluşumunu 20 etkileyebilir. 3D kültür yöntemi etkili tümör hücreleri ve bunların çevreleyen çevre arasında meydana iletişimi çalışma ve ne kadar protein sentezleme etkenler, iletişim 14,20,21,23 belirlemek için kullanılabilir. Bu makalede, analiz invaziv 3D kültürlerde MDA-MB-231 göğüs kanseri hücrelerinin büyümesini ve bir epitel işaretleyici laminin, hücre bazal membran 18,19,24 bir bileşenini kullanarak epitel morfolojisi kaybını incelemek için detaylı bir yöntem sağlar 25. Detaylı prosedürler, doğru ve tekrarlanabilir bir invazif kanser hücresi tarafından yıldız şeklinde (istilacı) yapısının oluşumunu ölçmek için ve bu MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 ya da T47D gibi ortak meme kanseri hücre hatları (sınırlayıcı değildir olanağı sağlar .) Bu nedenle, bu deney ile nasıl protein hücrelerde ekspresyonu ya da tedavi değerlendirmek için bir platform olarak hizmet edebilir pro-ya da anti-invazif bileşikler, bir ya da birden çok hücre tarafından, hücre dışı matris bozulması düzenler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bazal Membran Matrix Meme Kanseri Hücreleri 1. Üç boyutlu Kültür (gömme Tekniği)
- Taşıma Matrigel bazal membran matrisi: 4 ° C'de gece boyunca buz üzerinde Çözülme Taban membran matrisi düşük bir sıcaklıkta sıvı olan, ancak oda sıcaklığında katılaşır. Buz (Şekil 1A-B) ile ilgili bazal membran matrisi tutun.
- Spiral bir desen (Şekil 1C) ve P-200 Pipetman ucunu kullanarak matris yayma vasıtasıyla taban membran matrisi 50 ul Konfokal No.1 cam alt çanak örtün. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için bazal membran matrisi yayılan dikkatli kullanın. Aynı şekilde, menisküs oluşmasını önlemek için, cam alt-çanak sınırlarına yakın matris yayılmasını önlemek. Deneyimsiz işleme bazal membran matris, daha sonra buz üzerinde olabilir çanak, P-200 Pipetman ve pipetler soğutulmuş halinde (alternatif olarak 4 ° C 'de bir buzdolabında gece boyunca bırakılmıştır.) Bu adım tekliflerkatılaşmadan önce bazal membran matrisi yaymak için ek süre. (Şekil 1D) katılaşması için temel zar matris sağlamak için en az 30 dakika boyunca (% 5 CO2 ile 37 ° C 'de) bir hücre kültürü inkübatöründe çanak (ler) yerleştirin.
- Matris katılaşma geçirmekte iken, hücre% 70-80 konfluent 100 mm plaka trypsinize. Hücreler, plakanın kapalı kaldırma bir kez başladıktan sonra, tripsin (Şekil 1 E) etkisiz hale getirmek için,% 10 (v / v) cenin sığır serumu (FBS) içeren RPMI 1640 ortamında 10 ml bunları tekrar süspansiyon. Daha sonra 15 ml konik bir tüp (Şekil 1F) içine yeniden süspansiyona hücreleri aktarın.
- Özel bir hücre kültürü santrifüj (Şekil 1G-H), 3 dakika boyunca 100 x g (konik bir tüp içinde mevcut olan) hücreleri dönerler.
- Hücreleri aşağı bükülmüş edilirken, bir 1 ml mikrosantrifüj tüp (not içine kısım matris 50 ul: Her cam dipli çanak bir mikrosantrifüj tüpü tahsis edilir, bu nedenle, eğerDeney, 3 yemekler gerektirir o) 3 mikrosantrifüj tüpleri de gerekli olduğu takip eder ve daha sonra buz (Şekil 1 B) tüpü yerleştirin.
- (Şekil 1 H) rahatsız pelet terk ederken, aşama 1.4 'dan konik tüp arasındaki orta aspire. Hücreler yeniden süspanse FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı (Şekil 1J) 1 ml (aşağı bükülmüş olması).
- Hücreler mikrosantrifüj tüpü içine, bir hemasitometre (Şekil 1 K), veya bir hücre partikül sayacı kısım 2.5 x 10 4 hücreleri kullanılarak sayılmıştır ve 50 ul (Şekil 1 L) toplam hacim elde etmek üzere, uygun ortam kullanılarak kapalı üst kez.
- 1:1 oranında 1.5 adım matris içeren mikrosantrifüj tüpü ile adım 1,7 (50 ul içinde 25,000 hücre) gelen hücreleri karıştırın; Nihai hacim 100 ul (Şekil 1 M) olacaktır.
- S üzerine aşama 1.8 'den hücre karışımı: yavaşça matrisin 100 ul plakaadım 1.2 (Şekil 1N) den olidified bazal membran matris kaplı çanak. Hücreler bazal membran matris içine gömülü olması için bu sağlar.
- (% 5 CO2 ile 37 ° C) hücre kültür inkübatörü içine çanak (ler) aktarın ve matris sağlar: Hücre karışımı en az 30 dakika boyunca katılaşmaya.
- Matris kez: hücre karışımı katılaşmış, çanak (Şekil 1O) için FBS-desteklenmiş RPMI medya 2 ml ekleyin ve deney (Şekil 1P) geri kalanı için saklanır inkübatör çanak geri almak.
- (Bir tahlil için gerekli başına ya da, MDA-MB-231 hücreleri için, tahlilin süresi uzunluğu 5 gündür), 5 gün süreyle her gün ortam kullanın.
- Bir ışık mikroskobu kullanılarak, diferansiyel girişim kontrast taban membran matrisi (Şekil 3A) içinde süspansiyon haline MDA-MB-231 koloni (DIC) görüntüleri alır. Görüntü 20 temsili alanlar 10X objektif seferde bir günBeş gün koloni morfolojilerinden (Şekil 3C) belirlemek için.
- Hücre kolonisi Yıldızsı oluşumu (Şekil 3B) belirlemek için körü körüne görüntüleri analiz. A koloni hücrelerin sfero bir veya daha fazla çıkıntılar algılandığı takdirde yıldız şeklinde olduğu düşünülmektedir. Invazif stellate kolonilerin yüzdesini belirlemek elde edilen görüntünün başına hücre kolonilerinin toplam sayısına göre Stellate kolonilerin sayısını bölmek ve sonra her gün için 20 görüntülerin stellate kolonileri yüzdeleri ortalama için.
Şekil 1. Taban membran matrisi (gömme teknik), MDA-MB-231 göğüs kanseri hücrelerinin üç boyutlu bir kültür. AB) çeker ocak içinde gerçekleştirilen deney kurulumu () kaplanmış cam tabanlı bir çanak. ° C) iyi bir şematiktaban membran matrisi 50 ul, en az 30 dakika boyunca katılaşması için matris izin vermek üzere% 5 CO2) 37 ° C 'de (bir hücre kültür inkübatörü içine yerleştirildi. D) Çanak (lar) ı ile. E) Hücreler, tripsinize edilmiştir. F ) Hücreler konik bir tüp içinde mevcut. GH) Hücreler (), bir doku kültürü santrifüj içinde 3 dakika boyunca 100 x g hızında döndürüldü edildi, 15 ml konik bir tüp içine yeniden süspanse edildi. I) Hücre topağı, aşağı döndürülmüştür edilmiştir. J) Hücreler () FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı içinde, 1 ml olarak yeniden süspansiyon haline getirildi. K) Hücreler bir hemasitometre. L kullanılarak sayıldı) mikrosantrifüj tüpüne halinde bölünerek, 50 ul toplam hacim elde etmek üzere, uygun ortam kullanılarak tepesinde 2.5 x 10 4 hücreleri. M ), bir 1:1 oranında 1.5 adım matris içeren mikrosantrifüj tüpü ile adım 1.7 (50 ul içinde 25,000 hücre) hücreleri karıştırın; Nihai hacim 100 μ olacak.. Hücre karışımı katılaştırılır, hiç FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı 2 ml ekleyin: matris kez) aşama 1.2 'den katılaşmış matris ile kaplanmış yemek O üzerine adım 8 hücre karışımı:, l H) yavaşça, matrisin 100 ul plaka çanak. P) bu deneyin geri kalan saklanacak inkübatör çanak yerleştirin.
İmmünofloresan 3D Kültürleri morfojenık Özellikleri 2. Incelenmesi
- Çanak (ler) üzerinden geçmeden önce (Şekil 2A),% 80 metanol (tespit edici çözelti) ve% 3 sığır serum albümini (BSA bloke çözeltisi) bir buz kaseti, soğuk fosfat tamponlu çözelti (PBS),% 20 aseton ayarlama inkübatör.
- Buzluk ve aspire ortama çanak (ler) koyun, daha sonra soğuk PBS ve 2 ml (Şekil 2B) ile 3 kez yıkayın.
- Son yıkama PBS aspire edildikten sonra,% 20 aseton içinde 2 ml ekleyin: çanak (ler) (Şekil 2C halinde% 80 metanol çözeltisi (Şekil 2B) 'de 20 dakika boyunca hücreleri düzeltmek için.
- Fiksasyon 20 dakika sonra sona erer, oda sıcaklığında yemekleri geri getirmek fiksatif havalandırın, ve daha sonra 3 kez PBS ile yıkayın. Nihai yıkama PBS aspire edildikten sonra, oda sıcaklığında (Şekil 2E) en az 30 dakika boyunca bloke etmek üzere çanak (ler) için% 3 BSA 2 ml ekleyin.
- Bloke dönemde blokaj tamponu% 3 sığır serum albümini (BSA) içinde çözülmüş (uygun dilüsyonda) birincil (laminin V 1:100) ve ikincil antikor seyreltileri hazırlanır. Hücresi karışımı: 'BSA + primer antikor' çözüm ul 400-500 matrisi doğrudan eklenmesi gerektiğini unutmayın.
- Tıkanması süresi 30 dakika sonra, birincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında (Şekil 2F) en az 1 saat boyunca inkübe edilir. Hiçbir PBS yıkar 30 dk Blockin aşağıdaki yapılması gerektiğini unutmayıng dönem.
- Aşama 2.6 tamamlanmasından sonra, 'BSA + birincil antikor "solüsyon çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.
- Doğrudan bir matris üzerine (uygun seyreltmede)% 3 BSA içinde çözülmüş ikincil antikor ekleyin: Hücre karışımı, yemekler kapak ve oda sıcaklığında (Şekil 2G) 1 saat boyunca inkübe edilir.
- 'BSA + ikincil antikor' çözüm çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayın.
- Çekirdekler boyama için PBS içinde çözüldü, Hoechst 33258 (1:10,000) 2 ml ilave edilir, ve alüminyum folyo altında 5 dakika boyunca inkübe (veya photobleaching sınırlamak amacıyla ışık geçirmeyen bir kap ile kapak) (Şekil 2H).
- Hoechst 33258t ile inkübasyon süresi 5 dakika sonra, PBS ile (ler) 5x çanak yıkayın.
- Doğrudan matris üzerine montaj orta ekleyin: konfokal çanak hücre karışımı ve bazal membran Matri içinde kolonilerin bütünlüğüne herhangi aksaklıkları uyaran önlemek için dikkatli bir şekilde cam lamel ile kaplayınx: hücre karışımı (Şekil 2I).
- Çanak (es) oda sıcaklığında (Şekil 2I) de gecede (veya 24 saat) kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, çanak (ler) -20 ° C'de muhafaza edilebilir, ancak bunlar oldukça kısa sürede görüntülü gerektiği tavsiye edilir.
- (Şekil 3B-E) kullanılan antikorların uygun lazer dalga boyları ile bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü kazanır.
Bağışıklık 3D kültürlerin Şekil 2.. Incelenmesi. . A) deney düzeneği şematik B) Çanak (es) buz tepsiye yerleştirilir ve medya aspire; . sonra hücreler soğuk PBS ve 2 ml C) 2 ml% 20 aseton ile üç kez yıkanmıştır:.% 80 metanol çözeltisi D) için, hücreler çanak (ler) ilave4 ° C'de (ya da buz üzerinde, ya da bir buzdolabı içinde) 20 dakika. E)% 3 BSA içinde 2 ml, oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloke etmek üzere çanak (ler) ilave edildi. F) 30 dakika sonra, bloke sona ermiş, birincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında en az 1 saat süreyle inkübe G) () uygun seyreltme ile% 3 BSA içinde çözülmüş ikincil antikorlar taban membran matrisi üzerine direkt olarak ilave edildi:. hücre karışımı; . ardından yemekler üzeri örtüldü ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya H) Hoechst 2 ml (1:10000, PBS içinde çözülmüş) alüminyum folyo altında 5 dakika boyunca inkübe diShe (leriyle) ve hücrelere eklendi I) montaj ortamı, doğrudan ilave edildi. bir matris üzerine: konfokal çanak ve tabak içinde hücre karışımı cam lamel ile kaplıdır. Çanak (ler), oda sıcaklığında bir gece boyunca (veya 24 saat) kurutulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3 boyutlu bir matris içinde işgal eden MDA-MB-231 hücrelerin bir örneği, Şekil 3C 'de gösterilmiştir. Hücreler, matris (Gün 1) gömülü ve 3. gün göre invaziv (yıldız biçimi) yapılar oluşturan başlar ve tam olarak 5. günde (Şekil 3C) ile matrise işgal edilir. Oluşan yıldız şeklinde kolonilerin sayısı sayılır ve (invaziv ve non-invazif) çanak başına koloni toplam sayısının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Ölçümler beş gün boyunca her gün yapılır beri Ayrıca, istila oranı da değerlendirilebilir.
Morfogenetik olayların bir zaman çizelgesi oluşturulması bu deneylerde çok sayıda parametrelerini test etmek için bir temel sağlar. Örneğin, göğüs kanseri hücrelerinin hücre iskeleti yeniden düzenleme geliştirmek, anti-kanser ilaçları veya ilaçlar ile tedavi edilebilir ve invazyon bu ilaçların etkileri, uyarılmamış hücrelerde ve araç 24, kontrol ile karşılaştırıldığında, tespit edilebilir. Alternatif olarak, meme kapasitesi olabilirinvaziv uzantıların oluşturulması için CER hücreleri genetik olarak RNA girişimi (örneğin, shRNA gibi) 18,24,25 kullanarak potansiyel onkojeni veya azaltılmış gen ekspresyonunu ifade etmek için hücreler modifiye üzerinde ölçülebilir.
Deneysel bir araç olarak 3D hücre kültürleri kullanmanın önemli bir yararı hücre morfolojik değişimler sırasında önemli sinyal moleküllerinin mekansal ve zamansal özelliklerini incelemek için yetenektir. Imüno-boyama kullanılarak, bu moleküllerin ifadesi görsel olarak 3D kültür içinde tespit edilebilir. Şekil 3E olarak, membran bütünlüğü ve bazal membran protein laminin V 24 difüz lokalizasyonu kaybı gösteren MDA-MB-231 hücreleri için temsili invaziv (yıldız biçimi) kolonileri gösterir. Meme kanseri hücrelerinde gözlemlenen ile tezat olarak, laminin V tedavi edilmeyen habis olmayan MCF10A hücrelerin meme asinüsü (Şekil kaplayan bir dokunulmamış bazal zar tabakasının lokalize edilmiş3E) 24.
Şekil 3.. Görüntü edinimi ve temsili görüntü illüstrasyon. A) bir mikroskop ile çekilen görüntüler. B) Diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme mikroskop görüntülerini elde etmek için kullanılan ve sonradan görüntüleri (günde bir kez alınan için MDA-MB-231 hücrelerinin görüntü analiz yazılımı. C) Numune temsilcisi DIC görüntüleri kullanılarak analiz beş gün) gösterilmiştir. Tek yönlü ANOVA Dunnett çoklu karşılaştırma testi ardından: * P <0.05. Floresan mikroskop kullanılarak Ölçeği bar, 100 mikron. D) Görüntü edinimi. E) MDA-MB-231 laminindeki V lokalizasyonu (5 gün boyunca yetiştirilen) ve 12 gün boyunca yetiştirilen MCF10A hücreleri () tasvir Örnek immunofluorescent görüntüleri gösterilir. Ölçeği bar, 20 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D hücre kültürü teknikleri geliştirilmesi araştırmacılar bize dramatik morfolojik değişikliklere görselleştirmek için izin göğüs epitel hücrelerinin dönüşümünü incelemek için izin verdi. Hücre istilasını analiz Bunun yanı sıra, tek ya da çok-hücreli küreler, meme epitelyal hücre yapışması, proliferasyon, boyut ve bazal-apikal polariteli değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Hücreler ECM 8 ile kaplanmış olan daha önce bildirilen yöntemlere de, bizim sayısal yöntem için çok yönlü istila sağlar ECM 18,19,24, hücreleri gömer. Bu yenilikçi 3D kültür modeller araştırmacıların geleneksel transwell odasının işgali testleri kullanarak, tek tabaka hücrelerini inceleyerek mümkün değildir fenotipik değişiklikleri incelemek için izin verir. Hücre koloni konfokal immünofloresan analizi ile birlikte hem biyokimyasal ve farmakolojik stratejiler dahil sayesinde, 3 boyutlu modeller dikkatli yeteneği kolaylaştırmıştıry daha sofistike ve detaylar morfolojik değişiklikler analiz. Dolayısıyla, bu teknik kanserin başlamasını ve ilerlemesini etkileyen mekanizmaların anlayış furthered gelmiştir.
Bu eş odaklı tabak başına MDA-MB-231 hücrelerinin kaplanması için en elverişli sayı 25,000 hücre olduğu belirlenmiştir bulundu. Bu hücre sayısını arttırmak potansiyel ('kabartılması fenomeni "olarak adlandırılır), aşırı taban membran matrisi bozulması ile sonuçlanabilir ve böylece tavsiye edilmez. Diğer parametreler ayarlanır, ancak, daha yüksek hücre sayısı gibi temel zar matris hacminde bir artış eşlik gibi çalışabilir. Buna ek olarak, bazal membran matris bunların karışımları, bir partiden diğerine konsantrasyonda değişebilir. Bu nedenle, ilk olarak 3D deneylerde habis olmayan meme epitelyal hücrelerin normal morfolojilerinden sürdürme kabiliyeti için karışımın test edilmesi önemlidir. 3D kültürleri görüntüleme, benzersiz bir problem olduğu ortaya çıkartek tabaka yetiştirilen kültürler görüntüleme zaman mevcut değildir. Odak düzlemi dışında bulunan görüntülerken, belirli taban membran matrisi yetişen koloniler, çok-boyutlu olduğu göz önüne alındığında, tüm yapılar atlanabilir. Bu, birden uçaklar alınacak ve böylece 3D koloninin her invaziv yapısı görüntülü olabilir görüntüler sağlamak konfokal Z-yığınlarını kullanarak görüntüleme ile aşılır.
% 80 metanol çözeltisi, Triton-X çözeltisi ile paraformaldehid gibi diğer sabitleme maddeleri ile karşılaştırıldığında, bazal membran matris içine gömülü koloniler sabitlenmesi için uygun bir maddedir: Ayrıca% 20 aseton olduğunu tespit ettik. Metanol sabitleyici immün artırır ve arka plan otoflüoresanı azaltma eğilimi: Biz aseton bulduk. Bununla birlikte, boyama işleminin optimizasyonu, tipik olarak tek-tabakalı boyanması için kullanılan göre farklılık ideal bir antikor seyreltmeleri belirlemek amacıyla, her bir deney gereklidir. En antibodies tek tabakaları üzerinde bu işin 3D immün için kullanılabilir. Bununla birlikte, antikor ile inkübasyon süresi uzunluğu değişebilir, ve bu bireysel olarak tespit edilmesi gerekir.
Immünfloresans çalışmaları için 3D görüntüleme kültürleri bazı meydan 8. oluşturabilir. Nedeniyle numunenin kalınlığına 'bulanıklık / taneciklenme' sorununu aşmak için belirli aşamalar, bu numunenin Z-yığınları edinme veya maruz kalma süresi artmaktadır ve çerçeve numarası, ortalama artırmak olarak görüntü kalitesini artırmak için alınabilir . Bu oldukça bir düzlemde bir görüntü edinme daha küresel morfolojiye göre de (invaziv) stellat ayırt etmek son derece yararlıdır. Görüntülenmiş Z-yığını ayrıca, immun boyama gösteren örnek bir 3 boyutlu bir görüntü oluşturmak için işlenebilir. Ayrıca, MDA-MB-231 ya da MCF10A hücre çizgileri kullanılarak, bir zaman periyodu boyunca başarılı oluşan hücre agrega büyütülür. Böylece, biz konumunu incelemek için başardıkve immünofloresan 3D kültürlerde hücre polariteli markerlerin ifadesi değişir. Alternatif olarak, hücre agregatları temel zar matris içine yerleştirilmeden önce ön oluşturulabilir ve ilgi konusu olan proteinlerin lokalizasyonu daha sonra değerlendirilebilir.
Sonuç olarak, mümkün olan uygulamalarının çeşitli yapar 3B kültürlerinin kullanımı hücrelerin geniş bir spektrumu ile kullanılabilecek bir deney, dinamik olsun, sabit örneklerde hücre morfolojisi ve istilasında değişikliklerin değerlendirilmesi için izin kökenli patolojik ve / veya normal ya da gerçek zamanlı olarak 18,19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al.
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
