Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51354
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

Summary

في الثقافة المختبر أثبتت أنظمة لا غنى عنها في فهمنا لتكون العضل الفقاريات. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن تنمية العضلات والهيكل العظمي nonmammalian والنمو، لا سيما في الأصناف القاعدية. بروتوكول كفاءة وقوية لعزل الخلايا الجذعية البالغة من هذا النسيج، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، والحفاظ على التجديد الذاتي، والانتشار، وتمايز في إطار الثقافة الأولية يسمح لتحديد آليات تنظيمية والحفظ في جميع أنحاء متباينة الأنساب الفقاريات.

Abstract

نظرا لصعوبة الكامنة والوقت الذي يتطلبه مع دراسة برنامج عضلي في الجسم الحي، ونظم الثقافة الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية البالغة من سكان العضلات والهيكل العظمي، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، وقد ثبت لا غنى عنها في فهمنا لتطوير الهيكل العظمي والعضلات في الثدييات و النمو. خاصة بين الأصناف القاعدية من الفقاريات، ولكن، من محدودية البيانات واصفا الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الذات، والانتشار، والتفريق بين البلدان المتوسطية الشريكة. ذات أهمية خاصة هي الآليات المحتملة التي تكمن وراء قدرة الفقاريات القاعدية للخضوع كبيرة postlarval الهيكل العظمي ليف عضلي تضخم (أي الأسماك مكتملة العظام) وتجديد كامل بعد فقدان أطرافهم (أي urodele البرمائيات). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام myoblasts مثقف مساعدة في فهم التجديد وخلاصة البرنامج عضلي والخلافات بينهما. إلىلهذه الغاية، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول قوية وفعالة (والاختلافات فيه) لعزل والمحافظة على البلدان المتوسطية الشريكة وذريتها، وmyoblasts myotubes غير ناضجة، في خلية ثقافة كمنصة لفهم تطور البرنامج عضلي، بدءا من أكثر الفقاريات القاعدية. الاستفادة من الوضع الكائن نموذج من الزرد (دانيو rerio)، ونحن تقريرا عن تطبيق هذا البروتوكول لأسماك صغيرة من كليد الكارب Danioninae. جنبا إلى جنب، وهذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحقيق المنهج المقارن أوسع من خلال عزل الدول المتوسطية الشريكة من قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum) وحتى القوارض المختبر. والآن تستخدم على نطاق واسع في دراسة هذا البروتوكول تكون العضل في العديد من أنواع الأسماك، بما في ذلك سمك السلمون المرقط قوس قزح، والسلمون، والشبوط 1-4.

Introduction

لقد تم الحصول على فهم كبير من الثدييات تكون العضل من خلال خلاصة هذه العملية في كل من الماوس الأساسي (المصحف العضلة) myoblast الثقافات وخط الخلية المستمدة من الماوس موصوفة وصفا جيدا، C2C12 5. بدأت في 1950s 6، وقد أدت هذه الثقافات إلى الكثير من التقدم في فهم البرنامج murinemyogenic، وبالتالي، تكون العضل في الفقاريات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، زادت خلية واحدة تقنيات ليف عضلي ازدراع من فهم التفاعلات بين الخلايا الأقمار الصناعية وmyofibers المحيطة 7-9. الثقافات الخليوي وجاذبية خاصة للتحقيقات من تكون العضل بسبب الوقت القصير من السلائف لخلايا متمايزة 10، السهولة النسبية لترنسفكأيشن لرني 11-14، 15،16 المعدلة وراثيا و overexpression الدراسات 14،17،18، التوسع في المختبر تليها زرع في الجسم الحي 18-20، وحتى شركاتاريسون الخلايا السلائف عضلي وكلاء ينظم لهم عبر الأصناف 21،22. بينما الاختلافات نظرا للبيئة اصطناعية للنظام الثقافة وقد وصفت 5،23، وقد أثبتت هذه النظم في المختبر ليكون لا غنى عنه لدينا تشريح برنامج معقدة تنظم تشكيل متعددة النوى، mononucleated myofibersfrom متباينة عضال الخلايا الاصلية التكاثري المعروفة باسم myosatellite الخلايا (اللجان الدائمة) بين الثدييات.

خارج من فئة الثدييات، ومع ذلك، فهم الحفظ و / أو اختلاف في آليات السيطرة تكون العضل سيئة، إلى حد كبير بسبب صعوبة في زراعة الخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) وmyoblasts من مختلف الأصناف. في الواقع، لقد فقط وصفت الثقافات myoblast الأولية في ثلاثة طيور 24-26، واحدة من الزواحف 27، عدد قليل من البرمائيات 28-30، وبعض الأسماك 1،3،4،31-33. خطوط الخلايا عضلي مستمر من هاءrtebrates غيرها من القوارض 34-36، بل هي أكثر نادرة، مع الخط فقط غير الثدييات عضلي خلية مشتق من السمان الياباني (Cortunix تفرضه اليابان)، QM7 37. على الرغم من العديد من المحاولات في تخليد، لا يزال خط خلية عضلي مكتملة العظام بعيد المنال، وبروتوكول للترنسفكأيشن كفاءة هذه الخلايا تم نشره فقط هذا العام 15. وبالتالي، فإن هناك حاجة بروتوكولات واضحة جدا وجيدا الأمثل لزراعة البلدان المتوسطية الشريكة الابتدائية وmyoblasts من مجموعة متنوعة من الفقاريات بكثير ليس فقط لتوسيع معرفتنا لتطور البرنامج عضلي، ولكن لتوظيف قوة علم وظائف الأعضاء المقارن لتحقيق اختراقات في علاج أمراض العضلات والهيكل العظمي البشري والاضطرابات.

في حين أن الأدب يحتوي على العديد من التقارير MPC / myoblast العزلة 38-49، فإنه من الشائع للكتاب لوصف بروتوكولات لمثل هذه العزلة في سطور، غالبا ما تكون ناقصة، والأشكال. علاوة على ذلك، معظم بروتوكولات المفيد الريبوrted تم تطويرها للفئران 50-53، وبعض هذه تعتمد على اختيار الأجسام المضادة 54،55 أو 56،57 الجينات المحورة مضان، مما يجعل هذه البروتوكولات غير صالحة للاستعمال أو الأنواع غير القوارض اعمق غير عملي يستخدمها علماء البيولوجيا العضلات. مع المعروفة قليلا عن السمكية، البرمائيات، والزواحف تكون العضل، بروتوكول مفصلة وشاملة، وصفت مع التوجيه السمعي البصري وبكفاءة تظاهروا في الأنواع بعيدة الصلة، ستكون مفيدة للغاية في الميدان.

وصف لأول مرة من قبل باول وزملاؤه في عام 1989 58، وقد وضعت البروتوكول التالية في البداية إلى عزل الدول المتوسطية الشريكة وmyoblasts من أسماك السلمون (وهي تراوت قوس قزح، هينوكس mykiss، وسمك السلمون الأطلسي، سالموسالار) وبعض الكارب أكبر (أي ذهبية، Carassiusauratusauratus) . في عام 2000، وFauconneau Paboeuf الأمثل ثقافة myoblast الأولية لتراوت قوس قزح 59، وminoroptimizations أماهدي هذا البروتوكول للاستعمال في عدة البلم أصغر من كليد Danioninae (الزرد، دانيو rerio، ودانيو العملاق، Devario aequipinnatus) 32 وذلك بسبب العديد من الأدوات الجينية المتاحة للعمل الزرد وبالتالي الأقارب المقربين. الأسماك مكتملة العظام هي كائنات جذابة للدراسة نظرا لاستراتيجيتهم النمو المتباينة (على الأقل في معظم الأنواع). السلمون كبيرة، مثل معظم الأسماك، وتنمو indeterminately، مع إمكانات النمو لا يعوقها على الخط المقارب عند الاستحقاق، حتى في سن الشيخوخة 60-62. خلافا الزرد، danionins كبيرة مثل دانيو العملاق 63 وإمكانات النمو العرض دانيو شاربان نموذجية من الأسماك مكتملة العظام، مما يجعل تجاور بهم مباشرة إلى منصة مثالية لفهم ما إذا كان اختيار مصير الخلية لجنة السياسة النقدية تلعب دورا في تضخم العضلات والهيكل العظمي مقابل تضخم.

وبالمثل، لقد أثبتنا أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الفئران وقنافذ البحر، مع العائد خلية عالية نسبيا وviabمؤشرات ility. السلمندر Urodele، مثل قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum)، وتمتلك قدرة ملحوظة على تجديد الأنسجة، بما في ذلك الأطراف وذيول 64-66 بأكمله. هذه الخاصية تجعل هذه البرمائيات نماذج مثيرة للاهتمام من تلف العضلات والهيكل العظمي والشيخوخة. باستخدام بروتوكول موضح أدناه، نهجا مماثلا يمكن القيام بها كما حدث في العديد من أنواع الأسماك، وتوفير سياق المقارنة أوسع لمثل هذه الدراسات. كما العديد من علماء الأحياء المقارن حقا نقدر، ويمكن إجراء التقدم الأكثر وضوحا في مجال البيولوجيا الأساسية ومتعدية الطب الحيوي عندما يتم تحليل البيانات ضمن أوسع نطاق (هنا، ونسب الفقاريات بأكمله).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات الفقارية الموصوفة هنا مقدما قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ألاباما في برمنغهام ويتسق مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها مكتب مختبر رعاية الحيوان والمعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة وزارة الصحة والخدمات البشرية.

1. إعداد للثقافة

  1. إعداد قاعدة المتوسطة على النحو التالي: 9 مم 3 NaHCO (1.51 غ لكل 2 لتر)، 20 ملي HEPES (9.53 غ لكل 2 لتر) في DMEM (13.48 جم / لتر؛ 26.96 غ لكل 2 لتر).
    1. تحديد درجة الحموضة والتكيف مع 7.40 مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو.
    2. تحديد وضبط الأسمولية إلى ~ 300 الميلي أسمول مع كلوريد الصوديوم (إذا لزم الأمر).
    3. فلتر تعقيم باستخدام (2) نظم التعقيم 1 L فراغ وتخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى 2-3 أشهر.
      ملاحظة: انظر الجدولين 1 و 2 للكاشف كاملة، والأدوات، والمستهلكونABLES، والمعلومات المعدات.
  2. تحضير-L-المعالجة يسين بولي لوحات عن طريق إذابة 5 ملغ من المشع-γ بولي-L-يسين (> 300،000 ميغاواط) في 50 مل من الماء المعقم عالى النقاء. المزيج بلطف بواسطة انقلاب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وضمان حل كامل للبوليمرات يسين.
  3. ماصة المبلغ اللازم من بولي-L يسين الحل في كل بئر، وفقا لنوع لوحة (الجدول 3). السماح لوحات للوقوف في تدفق الصفحي هود لمدة 5 دقائق.
  4. المقبل، وإزالة بولي-L يسين حل ويغسل مرتين مع الماء المعقم. السماح لوحات في الهواء الجاف في تدفق الصفحي هود لمدة 20 دقيقة.
  5. الحصول على 1 ملغ من laminin (Engelbreth-هولم-سرب المنشأ) وتذوب في 50 مل من قاعدة متوسطة إلى تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل. تطبيق حل laminin لوحات زراعة الخلايا المعالجة بولي-L-يسين في 2 ميكروغرام / سم 2. (انظر الجدول 3 لأحجام وحة مختلفة)
  6. دوامة بلطف الحل لضمان فوليرة لبنانية كذلك التغطية. ختم لوحات مع الشريط المختبر وضعها في الحاضنة لمدة 24 ساعة. يجب تعيين الحاضنة إلى درجة الحرارة المناسبة للأنواع المستخدمة (انظر الجدول 7)، وليس غازات إضافية بحاجة إلى أن تضاف إلى الحاضنة.
    ملاحظة: Laminin يجب أن يسمح للانضمام إلى لوحات للخلايا قبل البذر 24 ساعة. وعدم القيام بذلك يؤدي ذلك إلى ضعف إلى ما لا تمسك الخلية.
  7. إعداد وسائل الاعلام كما هو موضح في الجدول رقم 4. يتم إعداد وسائل الإعلام كاملة أفضل اليوم من الاستخدام.
  8. تمهيدا لعزل الأنسجة، وتجميع العناصر والأوتوكلاف التالية: 300-500 مل دورق (ق)؛ أطباق بتري الزجاج؛ مشرط مقابض؛ ملقط (الناعم والخشن)؛ مقص تشريح؛ وعدة أوراق من المياه طارد رقة الأوتوكلاف.
    ملاحظة: للحصول على كل شخص المساعدة في عملية التشريح، (2) مقابض مشرط، (1) ملقط (نوع اعتمادا على تفضيل شخصي)، (1) مقص تشريح، و (5-10) ورقة من الورق الأوتوكلاف المواد الطاردة للماء هيكافية.
  9. بالإضافة إلى العناصر تعقيمها أعلاه، تجميع الايثانول 70٪، والتوازن الوزن، عقيمة أنابيب مخروطية 50 مل (عدد يعتمد على حجم الثقافة)، والجليد.

2. تشريح الأنسجة

  1. قبل بداية، تأكد من أن مخزون كاف من الأسماك هو متاح.
    ملاحظة: عمر الأسماك لاستخدامها له أهمية حاسمة. بينما الأسماك اثنين من الأنواع المختلفة قد يكون من الأوزان مماثلة، فإن الأسماك الأصغر من نوع واحد من البلدان المتوسطية الشريكة تمتلك أكثر سمكة قديمة من نوع آخر. كقاعدة عامة، والأسماك الأصغر، وخاصة عند العمل مع السلمون، هي الأفضل. لdanionins والأسماك قديمة قدم سنة واحدة يمكن استخدامها على النحو الأمثل، في حين السلمون في سن 4-6 أشهر أو أقل (تصل إلى 15 غرام) هي الأمثل.
  2. لكل 5 غرام من الأنسجة إلى أن تشريح، قسامة 25 مل من العزلة المتوسطة في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي.
  3. وزن والكتلة قياسية، وعدد أنبوب (ق). وضع أنابيب على الجليد.
  4. الموت ببطء 2-3 الأسماكفي وقت عن طريق الغمر في> 300 ملغ / لتر الصوديوم بيكربونات مخزنة تريكين methanesulfonate. تسمح بالحركة وصادي إلى وقف ل> 5 دقائق ثم submerse الأسماك في الايثانول 70٪ (الواردة في الأكواب معقمة) لمدة 30 ثانية.
  5. إزالة الأسماك من 70٪ من الإيثانول ووضع على الورق الأوتوكلاف المواد الطاردة للماء. مباشرة وراء غطاء الخياشيم، واستخدام مشرط لجعل سطحية، شق الضحلة. إزالة القشور والجلد عن طريق استيعاب الجلد في شق السالفة الذكر وسحب نحو ذيل سمكة.
  6. بعد إزالة الجلد، استئصال فوق المحور، سريع، حال السكر العضلات "أبيض" من الأسماك من الجانبين (تجنب العضلات بطيئة الأكسدة "الحمراء" التي تقع بالقرب من الخط الجانبي) ووضعت في العزل المتوسط. تجاهل ما تبقى من الأسماك على النحو المطلوب من قبل المؤسسة.
    الخلايا في حين أنه من الممكن تماما لثقافة البلدان المتوسطية الشريكة القادمة من العضلات الحمراء، كل منشور تقريبا باستخدام مكتملة العظام البلدان المتوسطية الشريكة وقد استخدمت معزولة عن متر فوق المحور: ملاحظةyotome.
  7. كرر الخطوات من 2.4-2.6 حتى يتم الحصول على كمية كافية من العضلات. أثناء تشريح، وضمان أن الأنسجة العضلية المجمعة يبقى على الجليد للحفاظ على بقاء الخلية.

3. التفكك الميكانيكية

  1. صب أنبوب واحد من 25 مل / 5 غرام من الأنسجة العضلية في طبق بتري الزجاج. باستخدام اثنين من يتعامل مع مشرط المرفقة رقم 10 شفرات المشرط، اللحم المفروم الأنسجة إلى الطين أو بوريه الاتساق. A "ذهابا وإيابا" حركة سحب شفرات المشرط الماضية بعضها البعض يعمل على نحو أفضل.
    ملاحظة: على الرغم من التجانس الأنسجة قد يبدو مناسبا، وعدد من خلايا قابلة للحياة وسيتم خفض بشكل كبير، إن لم يكن إلغاؤها.
  2. باستخدام 25 مل ماصة المصلية وpipettor المصلية، وإزالة الأنسجة تلييس جوانبها واستبدال في أنبوب مخروطي الشكل الأصلي.
  3. كرر الخطوات من 3،1-3،2 حتى يتم فصلها عن الأنسجة في جميع أنابيب ميكانيكيا.
  4. الأنسجة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج و 10 درجة مئوية.
  5. الفلبسبب الطرد المركزي، وتجاهل طاف 25 مل من وسائل الإعلام مع 25 مل ماصة المصلية، فراغ الشافطة، أو عن طريق الصب حذرا.
  6. إضافة 25 مل من غسل المتوسطة إلى كل الأنسجة أنبوب، في resuspend، وrecentrifuge على النحو الوارد أعلاه.
  7. يغسل مرتين مع غسل المتوسطة، وإزالة طاف في كل مرة.

4. الأنزيمية التفكك

  1. خلال الخطوة 3.4، وإعداد حل كولاجيناز من خلال الجمع بين 0.22 غرام من النوع الرابع كولاجيناز و 44 مل من المتوسط ​​قاعدة (أو كمية كافية في g/0.22 0.11 مل).
  2. اثارة في كوب لمدة 10-15 دقيقة في 4 درجات مئوية. فلتر تعقيم مع حقنة 50 مل ومرشح حقنة 0.45 ميكرون.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من مرشح واحد حقنة، وهذا يتوقف على إعداد كولاجيناز. كولاجيناز الحصول عليها من الشركات الأخرى من الكيمياء الحيوية ورثينجتون يطرح أكثر صعوبة خلال الترشيح. يستخدم كولاجيناز لفصل السندات الببتيد الكولاجين في التي تشكل غمد الليف العضلي. هذاسوف الهضم إزالة هذا الحاجز واقية من myofibers.
  3. لكل غرام من النسيج العضلي، في resuspend الأنسجة في حل كولاجيناز 0.2٪. لمدة 5 غرام من الأنسجة العضلية، وإضافة 10 مل من محلول كولاجيناز و 15 مل من قاعدة المتوسطة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من قوات الأمن الفلسطينية في مل من كولاجيناز الحل / متوسطة قاعدة (على سبيل المثال 250 ميكرولتر إلى 25 مل). ضمان أن يتم تعليق الأنسجة بشكل جيد، وهذا سوف يؤثر على كفاءة عملية الهضم الأنزيمية.
  5. احتضان الأنسجة العضلية في كولاجيناز لمدة 60 دقيقة عند 18 درجة مئوية مع هزاز لطيف. اعتمادا على درجة من التفكك والأنواع الميكانيكية، ويجوز تمديد كولاجيناز الهضم إلى 90 دقيقة، على الرغم من أن هذا قد يؤثر على بقاء الخلية.
  6. التالية أنابيب كولاجيناز الهضم، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج المخروطية لمدة 5 دقائق في 12 درجة مئوية. تجاهل طاف والأنسجة resuspend في 25 مل من غسل المتوسطة.
  7. Recentrifuge في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 126؛ C. أكرر مع الغسيل المتوسطة للمرة الثانية.
  8. بعد غسل الأنسجة مرتين، الأنسجة العضلية resuspend في 25 مل من غسل المتوسطة ويسحن مع 10 مل ماصة المصلية حتى تمر الأنسجة / متوسطة جناسة داخل وخارج ماصة مع السهولة النسبية. 5-10 triturations وعادة ما يكفي.
    1. أكرر مع 5 مل ماصة المصلية ثم قنية المعادن قياس 16 تعلق على حقنة.
  9. أنابيب الطرد المركزي المخروطية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 12 درجة مئوية. صب طاف.
  10. خلال 5 دقائق أعلاه الطرد المركزي، وإعداد الحل التربسين الهضم من خلال الجمع بين 0.25 غرام من التربسين مع 5 مل من قاعدة المتوسطة.
  11. اثارة في 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة وتصفية تعقيم مع حقنة 20 مل و 0.45 ميكرون تصفية حقنة.
  12. استرداد أنابيب مخروطية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول التربسين و 4.9 مل من التفكك المتوسطة لكل 1 غرام من الأنسجة العضلية إلى كل أنبوب. لإكساءmple، إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين و 24.5 مل من التفكك المتوسطة إلى 5 غرام من الأنسجة العضلية.
    ملاحظة: التربسين هو الأنزيم البروتيني سيرين التي من شأنها فصل الخلايا السلائف عضلي من الصفيحة القاعدية.
  13. الأنسجة resuspend في التربسين / تفارق المتوسطة أيضا. احتضان لمدة 20 دقيقة في 18 درجة مئوية.
  14. بعد أول حضانة التربسين، أنابيب مخروطية أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة في 12 درجة مئوية.
  15. تحييد التربسين من خلال الجمع بين supernatants مع العزلة المتوسطة بتركيز 1 حجم طاف إلى 4 مجلدات من العزلة المتوسط. تخزينها في 4 درجات مئوية خلال عملية الهضم التربسين الثانية.
  16. لبيليه المتبقية من الأنسجة، وكرر الخطوات 4،12-4،15، والجمع بين طاف التالية الخطوة 4.15 مع المتوسطة طاف / بمعزل عن أول عملية الهضم التربسين.
  17. بدلا من ذلك: قد تكون مجتمعة والهضم كولاجيناز والتربسين لتعظيم عوائد الخلية. <رأ>
  18. للقيام بذلك، يسحن كولاجيناز هضم باستخدام قنية المعادن (6 في الطول و 16 مقياس يعمل بشكل أفضل) تعلق على حقنة 20 مل حتى جناسة يمر بسهولة من خلال قنية.
  19. إلى جناسة، إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين (المعد في الخطوة 4.10)، واحتضان عند 18 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  20. بعد أنابيب الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج المخروطية لمدة 1 دقيقة في 12 درجة مئوية.
  21. تحييد التربسين من خلال الجمع بين supernatants مع العزلة المتوسطة بتركيز 1 حجم طاف إلى 4 مجلدات من العزلة المتوسط.
  22. تخزينها في 4 درجات مئوية خلال عملية الهضم التربسين الثانية.
  23. المضي قدما في خطوة 4.18 كما هو الحال مع بروتوكول قياسي.
  • الاستغناء النهائي طاف / العزلة المتوسطة الخليط في 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 12 درجة مئوية.
  • إزالة supernatants مع الحرص على عدم تعكير صفو الخليةالكريات. ماصة 2 مل من المتوسط ​​كاملة في كل أنبوب، حل كل بيليه الخلية.
  • الجمع بين الخلايا علقت في المتوسط ​​كاملة في واحد 50 مل أنبوب مخروطي.
  • شطف كل أنبوب مع 1 مل من المتوسط ​​كاملة، مع الجمع بين مجموعة من الخلايا معلق سابقا.
  • يسحن مع قنية المعادن والمحاقن 5-10 مرات.
  • تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون، الشطف مع المتوسطة كاملة.
  • تحديد تعليق خلية خلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر.
  • إضافة المتوسطة كاملة كافية ل50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 15 درجة مئوية.

    • 5. الفرز، التخفيف، والبذر من الخلايا

    1. بعد الطرد المركزي في الخطوة النهائية 4.25، وإزالة طاف بواسطة الصب أو حذرا مع ماصة المصلية. resuspend الكرية خلية في 5 مل من المتوسط ​​كاملة.
    2. مع الخلايا معلق تماما، وإزالة 20 ميكرولتر؛ لتعليق الخلية ومكان في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    3. إضافة 5 ميكرولتر من التريبان صبغة زرقاء والانتظار مدة 5 دقائق. باستخدام عدادة الكريات، وتحديد عدد من خلايا قابلة للحياة.
    4. بناء على تقرير، وتمييع الخلايا إلى تركيز الحاجة. مكتملة العظام البلدان المتوسطية الشريكة وأفضل المصنف في 150،000-200،000 الخلايا لكل سم 2. لاستراتيجية الطلاء ستة جيدا، وتمييع الخلايا إلى 1.5 × 10 6-2،0 × 10 6 في مل يدعم الانتشار والتمايز كافية.
    5. استرداد-L-المعالجة يسين بولي، لوحات laminin المغلفة وخلايا البذور. (انظر الجدول رقم (5) لوحة التخفيفات محددة وكميات الطلاء.) ملاحظة: يصور الجدول 6 متوسط ​​عدد خلايا معزولة في كل غرام من الأنسجة العضلية المعزولة من الأنواع مكتملة العظام المختلفة. تراوت قوس قزح (O. mykiss) يحمل أقل البلدان المتوسطية الشريكة في كل غرام من الأنسجة العضلية من القيام الزرد (D. rerio) وبالتالي سوف تتطلب المزيد من السمك لعزل من المناسب للبذار.
    6. ختم لوحات مع الشريط المختبر وضعها في حاضنة تقشعر لها الأبدان في درجة حرارة مناسبة. قد حضنت الدول المتوسطية الشريكة من جميع الأنواع المذكورة هنا (باستثناء الفئران) تحت الظروف الجوية العادية دون ثاني اكسيد الكربون (CO 2) مكملات. (انظر الجدول 7).
    7. بدلا من ذلك: لقد اعتمدت بعض المختبرات البروتوكول الذي يدعو إلى السماح للدول المتوسطية الشريكة على الانضمام إلى الطبقات التحتية الثقافة لمدة 40 دقيقة.
      1. ثم شطف لوحات مع وسائل الاعلام الغسيل لإزالة أي خلايا فضفاضة يعلق وغير ملتصقة. تحذير: هذه الخطوة مهمة جدا لتجنب التصاق "غير محددة" الخلايا الأخرى (مثل الخلايا الليفية) إلى الطبقات التحتية الثقافة.
      2. إضافة وسائط كاملة وخلايا مكان في الحاضنة ورعاية كما هو مفصل أدناه.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    يجب أربع وعشرين ساعة بعد البذر، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) تكون مرئية تعلق على قوام laminin (انظر الأرقام 1a و 1D). بعد البذر، وخلايا (البلدان المتوسطية الشريكة) اعتماد مثل مغزل الشكل، مما يدل على هذا النوع من الخلايا (الشكل 1)، وهي MyoD1 + (الشكل 2). في الأنواع دانيو، تظهر البلدان المتوسطية الشريكة لتكون أكثر إحكاما مع العمليات القطبين أصغر من قيام الدول المتوسطية الشريكة من هينوكس وسلمون الأنواع. ومع ذلك، على مدى أربعة أيام من الثقافة، والدول المتوسطية الشريكة من جميع الأنواع السمكية درست اعتماد الأشكال التضاريسية مماثلة وتبدو بوضوح مثل myoblasts (أرقام 1B و1E). يجب إزالة وسائل الإعلام كاملة، ويجب غسلها مرتين مع البلدان المتوسطية الشريكة غسل المتوسطة. يمكن Myofibroblasts تلويث الثقافات عضلي ويمكن تمييزها بسهولة من البلدان المتوسطية الشريكة / myoblasts من قبل التشكل النجوم مثل (مقابل شكل المغزل من myoblast). غسل لوحات كبيرة طmproves إزالة هذه الخلايا الليفية.

    في الأنواع الموصوفة هنا (انظر الجدول 7)، والتغيرات وسائل الإعلام يوميا تنتج أفضل النتائج. يجب غسلها البلدان المتوسطية الشريكة وآله (myoblasts وmyotubes الوليدة) مرة أو مرتين قبل إضافة وسائل الإعلام كاملة جديدة. بدلا من ذلك، والتغيرات وسائل الإعلام يمكن أن تخفض إلى كل يوم بعد الخلايا قد وصلت إلى المرحلة النهائية myoblast (حوالي 4 يوم للثقافة). ينبغي أن تشكل Myotubes داخل 2-3 أيام (أرقام 1C و1F) وسيتم myogenin + (الشكل 2)، وخصوصا عندما مثقف في التمايز المتوسطة (انظر أدناه). في حين تم الإبلاغ عن فترات أسابيع إلى أشهر في العديد من أنواع الثدييات، والبلدان المتوسطية الشريكة السمكية myoblasts لا يبدو أن تتسامح مع مثل هذه الفترات من الزمن. الخلايا تتكاثر في الأيام الستة الأولى من ثقافة (الشكل 3)، مع التفريق بين اللاحقة أيام 7 و 9-11 من الثقافة. بعد ذلك، وخلايا الشيخوخة أو poptose.

    وقد تم تحديد طبيعة عضلي من البلدان المتوسطية الشريكة وذريتها معزولة باستخدام هذا البروتوكول 3،32،33 يعتمد على التعبير الجيني. خلافا لنظم الاستزراع الثدييات، وانتشار الدول المتوسطية الشريكة وmyoblast ذرية منخفضة نسبيا خلال الأيام الأولى للثقافة (بالمقارنة مع أنظمة استخدام الفئران myoblasts الأولية أو C2C12)، مع زيادات سريعة الكشف عن تشكيل خلايا غير ناضجة myotubes خلال أيام 6-9 للثقافة في دانيو الأنواع 32. وقد استخدمت تقارير من تراوت قوس قزح وسيلة تمايز (شائع في الثقافات myoblast الثدييات، ولكن ليس المطلوب في نظم السمكية) وتشير إلى أن انخفاض مؤشرات الانتشار كما هو متوقع مع myotube تشكيل 33. في أيدينا، يمكن أن تبقى myotubes الناتجة في الثقافة لمدة تصل إلى 9-11 أيام (الأنواع دانيو) و11-13 يوما (الأنواع هينوكس) قبل حدوث الشيخوخة الخلوية أو موت الخلايا المبرمج.

    = "0">
    كاشف شركة (المفضل ضد البديل) عدد التسويقي (المفضل ضد البديل) الكمية في الثقافة
    γ المشع بولي-L-يسين سيغما الدريخ (Biomedicals النائب) P5899 (ICN19454405) 5 ملغ
    DMEM (الجلوكوز عالية) سيغما الدريخ (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin العلوم البيولوجية دينار بحريني (سيغما الدريخ) CB-40232 (L2020) 1 ملغ
    بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3) فيشر العلمية (سيغما الدريخ) BP328-500 (S5761) 1.51 ز
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) فيشر العلمية (سيغما الدريخ) BP310-1 (H6147) 9.53 ز
    المضادات الحيوية / بمضادات الفطر الحرارية العلمية (SIGMA الدريخ) SV3007901 (A5955) 17-20 مل
    جنتاميسين سلفات ونزا (سيغما الدريخ) BW17-519Z (G1397) 2-3 مل
    المانحة فرسي سيرا الحرارية العلمية (سيغما الدريخ) SH3007403 (H1270) 75 مل
    الجنين البقري سيرا الحرارية العلمية (سيغما الدريخ) SH3007103 (F2442) 25 مل
    كولاجيناز (النوع الرابع) ورثينجتون (سيغما الدريخ) LS004189 (C9891) 0.44 ز
    التربسين (من البنكرياس) Biomedicals النائب (سيغما الدريخ) ICN15357125 (T5266) 1 ز

    الجدول 1. قائمة كاشف مفصل مع الشركة المصنعة المفضل ورقم الكتالوج.

    الاستهلاكية أدوات معدات
    الثقافة خلية لوحات ملقط (الخشنة) Pipettor المصلية
    معقم 50 مل أنابيب مخروطية ملقط (الجميلة) الرقم الهيدروجيني متر
    الشريط المختبر مشرط مقابض تقشعر لها الأبدان حاضنة (Echotherm)
    0.2 نظم التعقيم ميكرون فراغ شفرات مشرط (# 10، # 11) الصفحي هود التدفق
    المياه طارد الأوتوكلاف ورق مقص جراحي فراغ المنوع
    الماصات المصلية أطباق بتري الزجاج Microosmolality متر
    12-16 G قنية مع يور أقفال

    الجدول 2. مستهلكات، والأدوات، والمعدات اللازمة لزراعة الخلايا.

    ز = "0">
    لوحة الحجم سم 2 لكل بئر بولي-L-يسين * Laminin **
    6 جيدا 9.5 1.6 مل 1
    24 كذلك 1.9 0.32 0.2
    48 كذلك 0.95 0.16 0.1
    96 كذلك 0.32 0.06 0.03
    * تركيز 0.1 ملغ / مل تركيز ** 0.020 ملغ / مل

    الجدول 3. محسن مجلدات لطلاء لوحات ثقافة الخلية مع بولي-L-يسين وlaminin.

    كاشف العزلة غسل تفكك كامل
    قاعدة متوسطة 419.25 مل 395.40 مل 297.00 مل 178.00 مل
    قوات الأمن الفلسطينية * 5.00 مل 4.00 مل 3.00 مل 2.00 مل
    جنتاميسين سلفات ** 0.75 مل 0.60 مل - -
    المانحة فرسي المصل 75.00 مل - - -
    مصل بقري جنيني *** - - - 20.00 مل
    * PSF: البنسلين / الستربتوميسين / fungizone كوكتيل (100X)؛ ** 50 ملغ / مل تركيز؛ تتميز ***

    الجدول 4. الاستعدادات وسائل الإعلام المختلفة لعزل وثقافة الخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة).

    <الدفتيريا> 9.5
    لوحة الحجم سم 2 لكل بئر تخفيف تصفيح حجم التداول
    6 جيدا 1،5-2،0 × 10 6 خلية / مل 1 مل
    24 كذلك 1.9 1،5-2،0 × 10 6 خلية / مل 250 ميكرولتر
    48 كذلك 0.95 1،5-2،0 × 10 6 خلية / مل 150 ميكرولتر
    96 كذلك 0.32 1،5-2،0 × 10 6 خلية / مل 50-100 ميكرولتر

    الجدول 5. يوصى التخفيفات وأحجام الطلاء بواسطة لوحة خلية ثقافة حجم جيد.

    نوع # متوسط ​​خلايا / ز الأنسجة
    دانيو rerio 6،400،000
    دانيو dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    هينوكس mykiss 66،800

    . الجدول 6 متوسط ​​عدد الخلايا السلائف عضلي معزولة عن 1 غرام من الأنسجة العضلية من الأنواع المختلفة مكتملة العظام: دانيو rerio (الزرد)، Daniodangila (moustacheddanio)، Devario aequipinnatus (دانيو العملاق)، وهينوكس mykiss (تراوت قوس قزح).

    نوع درجة الحرارة
    دانيو / Devario النيابة. 26 - 28 ° C
    هينوكس / سلمون النيابة. 10 * - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * انخفاض درجات الحرارة وانخفاض معدلات انتشار دعم.

    الجدول 7. الموصى بها درجات حرارة الحضانة لالسمكية ع عضلي البرمائياتخلايا recursor (البلدان المتوسطية الشريكة).

    الشكل 1
    الرقم 1. صور الممثل مشرق مجال المتوسطية الشريكة (أقصى اليسار)، myoblasts (وسط)، وmyotubes في وقت مبكر (أقصى اليمين) من نوعين، تراوت قوس قزح (Oncorhynchus mykiss، أعلى) والزرد (دانيو rerio، أسفل).

    الرقم 2
    الشكل 2. تلطيخ immunocytochemical ممثل الدول المتوسطية الشريكة (أ، ج) وmyotubes (ب، د) معزولة ومثقف من دانيو العملاق (Devario aequipinnatus، العلوي) وسمك السلمون المرقط قوس قزح (Oncorhynchus mykiss، أسفل). في الثقافة، myoblasts هي MyoD1 + الإيجابي (أ، ج)كما تصور باستخدام المتاحة تجاريا MyoD1 + الأجسام المضادة (دانيو: C-20، وسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية؛ سمك السلمون المرقط: NB100-80899، نوفوس البيولوجية). بالإضافة إلى ذلك، كما يفرق myoblasts، يعبرون عن myogenin (ب، د) كما تصور باستخدام الأجسام المضادة myogenin المتاحة تجاريا (دانيو: M-225؛ سمك السلمون المرقط: SC-567، وكلاهما من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية).

    الرقم 3
    الشكل 3. الممثل البيانات تكاثر الخلايا باستخدام BrdU لقياس معدلات تكاثر الخلايا مع مرور الوقت في الثقافة. البيانات التي تم الحصول عليها من الدول المتوسطية الشريكة معزولة ومثقف من دانيو العملاق 67.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    برنامج عضلي، في أيهما الأنواع التي تم فحصها، يمكن دراسة معظم بسهولة من خلال نظام في المختبر. في الواقع، بناء على العزلة، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) في الأسماك أو خلايا myosatellite (اللجان الدائمة) في الثدييات تدخل بسهولة هذه العملية تنطوي على درجة عالية من التنظيم والانتشار، دورة الخلية الانسحاب، والتمايز النهائي من myoblasts ودمج تلك myoblasts في myotubes الوليدة. النقص العام في سلالات مراسل الجين المعدل وراثيا من الأنواع السمكية (مع احتمال استثناء من الزرد 67 وتراوت قوس قزح 69) يقيد العمل في الجسم الحي من تفعيل MPC / MSC، والانتشار، والتمايز، وبالتالي فإن النظام في المختبر المعروضة هنا هي منصة جذابة للدراسات في أنواع الأسماك.

    ثقافة الناجح لMPC / اللجان الدائمة، بغض النظر عن الأنواع، تعتمد بشكل كبير على أ) اهتمام دقيق إلى حدوث العقم؛ ب) التفكك الميكانيكية شامل للر العضلات والهيكل العظميالمسألة؛ وج) تحسين الهضم الأنزيمية. خلال الخطوات الأولية من العزلة العضلات والأنسجة، ويجب أن تؤخذ بعناية كبيرة لضمان أن الكمية اللازمة من الأنسجة يتم استئصاله دون تلوث. فإنه من الأهمية بمكان أن الأسماك (أو أي حيوانات يجري استخدامها، لهذه المسألة) يتم تطهيرها بشكل صحيح في 70٪ من الإيثانول وقتا كافيا. في أيدينا، 30 ثانية يعمل على نحو أفضل؛ فترات أقصر من الوقت يمكن أن يؤدي إلى التلوث وأطول، وفقدان سلامة الأنسجة وبقاء الخلية. الإيثانول يمكن أن تستخدم تثبيتي، لذلك يجب الحرص على عدم يذوى الأسماك قبل تشريح. ويمكن أن يتم تشريح خارج ثقافة هود خلية تدفق الصفحي؛ ومع ذلك، فإننا نوصي بأن تتم هذه العملية داخل غطاء للحد من أي تلوث بكتيري أو فطري المحتملة.

    في حين أن تفارق الميكانيكية المذكورة أعلاه قد يبدو الخام و / أو مملة في البداية، فمن الأهمية بمكان أن الإجراء العزلة. اثنين من ريش مشرط كبير، في الماضي سحبتبعضها البعض في حركة انزلاق (كما هو مبين في بروتوكول الفيديو)، وتنتج أفضل النتائج. بعد الانتهاء، يجب أن يكون اتساق جناسة أن من الطين أو بوريه، والتي تم جمعها بسهولة مع المصلية ماصة واسعة الجوف (أي 25 مل). ببساطة، كان ذلك أفضل تفارق الميكانيكية، وارتفاع MPC / العائد MSC وأفضل ثقافة الناتجة عن ذلك. سوف الفقراء تفارق تعيق الهضم الأنزيمي وانخفاض العائد الخلية. على الرغم من أنه قد يكون مغريا للنظر، واستخدام المجانسة الأنسجة الكهربائية يخفض بشكل كبير بقاء الخلية على الرغم من الراحة واضحة، على الأقل مع البلدان المتوسطية الشريكة السمكية.

    كما هو الحال مع جميع البروتوكولات، والتحسين من الإجراءات المفصلة أعلاه غالبا ما يكون ضروريا. وقد ثبت هذا صحيح في عملنا مع العديد من الأنواع danionin. النتائج من مختبر لدينا تشير إلى أن danionins أصغر (مثل الزرد) تسفر عن مزيد من البلدان المتوسطية الشريكة في كل غرام من العضلات والهيكل العظمي مما تفعل الأنواع أكبر (على سبيل المثال غيدانيو النمل أو شاربان). ومع ذلك، ويتحقق هذا إلا إذا تم استخدام تركيز أعلى من كولاجيناز (0.3٪) مع الأنسجة من أصغر الأنواع. في أيدينا، وتركيز 0.2٪ من المناسب بالنسبة للأنواع السلمون (على سبيل المثال تراوت قوس قزح؛ سمك السلمون المرقط سفاح [Oncorhynchusclarki]، وسمك السلمون من طراز شينوك [Oncorhynchustschawytscha])، وdanionins أكبر، قنفذ البحر (Ambystomamexicanum) أطرافهم والذيل، وحتى الماوس العضلات والهيكل العظمي. وبالمثل، يجب توخي الحذر لتحديد كولاجيناز المناسبة. في تجربتنا، والنوع الرابع كولاجيناز يحافظ على بقاء الخلية أفضل بكثير من collagenases الموصى به لأنسجة ليفية مثل العظام والعضلات (أي نوع كولاجيناز الثاني) 70. بينما الهضم قد تكون أكثر اكتمالا في فترة زمنية أقصر، سلامة غشاء الخلية المستقبلة من المرجح خطر بسبب زيادة النشاط زيتية في هذه الاستعدادات. فيما يتعلق التربسين، مختبرنا وقد استخدمت دائما أغلظ التربسين إعداد بورified من البنكرياس الخنازير، بدلا من الاستعدادات "أنقى" المتاحة. في الأنشطة ثقافتنا مع مختلف الأنواع، لاحظنا تأثير مفيد قليلا من تركيزات متفاوتة التربسين.

    سحن أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. على حد سواء تنأى مصفوفة ليفية من الهيكل العظمي والعضلات ويزيد من مساحة السطح لعملية الهضم زيتية كل حين يعطل السلامة الهيكلية للmyofibers يدويا. عند تنفيذ triturations، تباعا باستخدام ماصات تتحمل أصغر وقنية هو أسهل بكثير من استخدام قنية وحقنة الفور. يمكن الشروع مباشرة إلى triturations مع قنية وقنية حقنة يؤدي إلى توصيل و / أو الضغط المفرط التي يجري تطبيقها على الخلايا. سوف تطبيق الهضم زيتية دون سحن كافية الحد بشكل كبير من عائدات الخليوي.

    مرة واحدة معزولة، عملية الثقافة واضحة تماما. وقد استخدمت معظم المنشورات حتى الآن على بروتوكول الطرافةح وسائل الإعلام واحد لكل من الانتشار والتمايز 33،71-75، بما في ذلك منطقتنا؛ ومع ذلك، فقد وصفها المزيد من مقالات كتبها مؤخرا العديد من المحققين الفرنسيين بروتوكول اثنين من وسائل الإعلام، مع وسائل الإعلام على أساس منفصل ومحتوى المصل لانتشار والتمايز 33. هذا البروتوكول "أحدث" يحاكي عن كثب تلك المستخدمة في ثقافة اللجان الدائمة الفئران وmyoblastsand يبدو لتعزيز انتشار myoblasts مرحلة مبكرة 33 وربما يكون من الأنسب للسيطرة على انتشار و / أو تمايز الخلايا. ومع ذلك، من دون توصيف واسعة من التعبير الجيني، فمن الصعب أن نستنتج ما إذا كان هذا 'انتشار' وسائل الإعلام أيضا تحافظ على 'مثل myoblast' الدولة أكثر مما يفعل منهجية وسائل الاعلام التقليدية. وذكرت المنشورات السابقة واصفا التعبير الجيني، سواء في النص أو مستوى البروتين باستخدام بروتوكول سائل الإعلام التقليدية واحدة 3. بدلا من ذلك، وسائل الإعلام واحدة (وصف DMEM هنا) يمكن أن تستكمل مع تركيزات مختلفة من مصل بقري جنيني (FBS): 10٪ للانتشار و 2٪ للتمايز.

    بينما المحققين توظيف نظم زراعة الخلايا الثديية يمكن تأقلم على الاجواء باستخدام ثاني أكسيد الكربون لزراعة هذه الخلايا، والاختلافات الجوهرية بين الدعوة تبادل الغازات الأرضية والمائية لاتباع نهج مختلف عندما زراعة السمكية أو خلايا urodele-يقتصر المياه، بما في ذلك البلدان المتوسطية الشريكة. يتم تخزينها مؤقتا وسائل الاعلام بالتفصيل هنا مع المستمدة بيبرازين، ثنائي الشحنة وهو مركب عضوي [HEPES: 4 - حمض (2 هيدروكسي إيثيل) بيبرازين-1-ethanesulfonic] وبيكربونات الصوديوم (NaHCO 3). وبالتالي، ليست هناك حاجة حاضنة مع حقن الغاز أو المطلوبة لثقافة هذه الخلايا. الأهم من ذلك، ينبغي لمثل هذا حاضنات تمتلك القدرة على تهدئة بدلا من الحرارة، حيث أن درجات الحرارة اللازمة لثقافة السمكي وتتراوح بين البلدان المتوسطية الشريكة urodele 18-26 درجة مئوية. علاوة على ذلك، يمكن أن تكون الدول المتوسطية الشريكة السلمون جultured في درجات حرارة منخفضة إذا لزم الأمر، كذلك تسليط الضوء على الحاجة إلى وجود حاضنة التبريد. بالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا (كما لديها محققين آخرين، كما أعلن سابقا) الذي ختم لوحات الثقافة أمر ضروري للحفاظ على سلامة الخلوية. ببساطة التفاف واجهة بين الغطاء والثقافة وحة مع الشريط المختبر هو معيار كاف لتحقيق هذا الهدف.

    في حين الركض من المرحلتين الابتدائية البلدان المتوسطية الشريكة / اللجان الدائمة / myoblasts هو شائع في الثقافة خلايا الثدييات، فإنه لا يبدو أن يكون ممكنا مع الخلايا السمكية، على الأقل قبل أواخر المرحلة ميجا بايت (حوالي يوم 6 من الثقافة). وبالتالي، يجب أن يكون المصنف العدد المناسب من الخلايا كافية لدعم الانتشار والوصول إلى أهداف التجربة في الشروع في الثقافة. علاوة على ذلك، إذا تم الحصول على أقل من المتوقع عائدات الخليوي، وأنه ليس من الممكن لنشر خلايا ثم replate ذرية في وقت لاحق. لقد عزا هذه الخاصية إلى زيادة الاعتماد على extracelمصفوفة lular (ECM) من السمكي MPC / myoblasts. بدلا من ذلك، فمن الممكن أن هذا هو قطعة أثرية من الركيزة laminin وبالتالي مزيد التجريبية تحديد مكونات ECM اللازمة لالسمكي MPC / ميغابايت انتشار وهناك ما يبرر التمايز. نحن لا نلاحظ، مع ذلك، أن أزالت العديد من المتعاونين لدينا بنجاح myoblasts وقت متأخر من مرحلة (~ يوم 6 الثقافة) من قوام الثقافة وreplated هذه الخلايا (JM FROEHLICH والعلاقات العامة بيغا، اتصال شخصي).

    باستخدام هذا البروتوكول أو واحد مشابه له، التي تنطوي على التجريب RT-PCR 3،71-74،76-78، لطخة غربية 32،79-81، كيمياء سيتولوجية مناعية 32،33، 32،33،59 المقايسات الانتشار، ترنسفكأيشن الجين 15، كيمونسيجيا وقد تم ذلك، وتحليل 78، وعلم السموم الفرز 82، ومناعي لونين (JM FROEHLICH والعلاقات العامة بيغا، نتائج غير منشورة الشذرة). ومع ذلك، المزيد من أوصاف إضافية في فيتامينبروتوكولات ريال عماني، أي تلك التي تنطوي على الركض ونشر نسيلي، هناك حاجة ماسة جدا. في الواقع، أدلى المختبر رودجرز 15 التطورات الهامة في ثقافة السمكية المتوسطية الشريكة / myoblasts عن طريق الاستفادة المثلى بروتوكول لإحداث ترنسفكأيشن من قوس قزح myoblasts سمك السلمون المرقط. استنادا إلى هذه المنهجية، التي تنطوي على مزيد من التحقيقات رني أو overexpression من أهداف محددة العضلات والهيكل العظمي، وخصوصا تلك افترض أن تشارك مع مسارات النمو مدى الحياة من الأسماك مكتملة العظام، ليست فقط ممكنة، ولكن قد يؤدي إلى التقدم الكبير في مجالات الطب الحيوي وتربية الأحياء المائية العلم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    ليس هناك شيء في الكشف عنها.

    Acknowledgments

    فإن الكتاب أود أن أعرب العديد بفضل الدكاترة. جوسيب بلاناس وخوان كاستيو للخبرات المهنية في تطوير وتطبيق هذا البروتوكول إلى ثقافة الأسماك الصغيرة والبرمائيات. الشكر أيضا نظرا لعدد لا يحصى من الأفراد الذين ساعدوا بلا كلل مع تشريح والتفكك من الأنسجة العضلية من العديد من الأسماك (سواء في الأنواع والعدد)، بما في ذلك الشحن ماثيو، Delci كريستنسن، زاكاري فاولر، بروك فرانزين، ناثان FROEHLICH، كيرا مارشال، بن ماير، إيثان Remily، وSinibaldo روميرو. وأيد هذا العمل من قبل جامعة ألاباما في برمنغهام قسم البيولوجيا الأموال البدء، مركز البحوث البروتياز المعاهد الوطنية للصحة منح # 2P20 RR015566، المعاهد الوطنية للصحة NIAMS غرانت # R03AR055350، وNDSU تقدم إلى الأمام جبهة الخلاص الوطني جرانت # HRD-0811239 لPRB. وقدم الدعم أيضا من قبل مركز بحوث السمنة UAB التغذية الجائزة # P30DK056336، المعاهد الوطنية للصحة NIDDK. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين والقيام ليس بالضرورةتمثل وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345 (2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    Tags

    بروتوكول الأساسية، العدد 86، تكون العضل، الزرد، myoblast، زراعة الخلايا، دانيو العملاق، دانيو شاربان، myotubes، والانتشار، والتمايز، Danioninae، قنفذ البحر
    إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Froehlich, J. M., Seiliez, I.,… More

    Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter