Summary
在体外培养系统已被证明不可缺少的，以我们的脊椎动物肌肉发育的理解。然而，还有许多尚待了解非哺乳动物骨骼肌肉的发育和成长，尤其是在基础类群。一个高效，健壮的协议用于分离该组织中，肌细胞前体细胞（MPC）中的成体干细胞，并维持它们的自我更新，增殖，并在原代培养物分化的设置允许的保守和发散调节机制的识别整个脊椎动物的谱系。
Abstract
由于固有的困难，并参与研究体内生肌程序时，从骨骼肌的居民的成体干细胞来源的原代培养系统，生肌前体细胞（MPC）中，已证明不可或缺到我们的哺乳动物骨骼肌发育的理解和增长。特别是脊椎动物的基部类群，但是，数据是有限的，描述控制的自我更新，增殖和MPC的分化的分子机制。特别令人感兴趣的是背后基底脊椎动物经受相当大的后期幼骨骼肌肌纤维增生（ 即硬骨鱼）和全再生的附属物损失（ 即 urodele两栖动物）的能力的潜在机制。此外，使用培养的成肌细胞可能有助于再生和生肌程序的总结和它们之间的差异的理解。至为此，我们详细描述了一个强大和高效的协议（和其中的变化），用于隔离和维护的MPC和他们的后代，成肌细胞和未成熟的肌管，在细胞培养作为理解生肌计划的发展平台，与更多的开始基底脊椎动物。凭借斑马鱼（ 斑马鱼 ）的模式生物的状态，我们报告这个协议的鲤科鱼类分支亚科的小鱼应用。在串联，这个协议可以被用来从墨西哥蝾螈（Ambystomamexicanum），甚至啮齿类实验动物隔离多用途储值卡，以实现更广泛的比较方法。该协议是目前广泛使用的几种鱼类物种，包括虹鳟，鲑鱼和鲷鱼1-4学习肌肉发育。
Introduction
哺乳动物肌肉发生的相当的了解已经通过这个过程的概括在这两个初级小鼠（ 小家鼠 ）的成肌细胞培养物和良好描述的小鼠衍生的细胞系中获得，C2C12 5。在20世纪50年代6起，这些文化都引发了很多进步的murinemyogenic程序的理解，并推而广之，肌肉发生在其他脊椎动物。此外，单细胞的肌纤维植技术已增加了相互作用的了解卫星细胞和周围的肌纤维7-9之间。细胞培养物对肌肉发育的研究特别有吸引力因短时间从前驱分化的细胞10，转染的相对容易的RNAi 11-14，转基因15,16和表达的研究14,17,18， 在体外扩增后回输体内 18-20，甚至排版埃里森生肌前体细胞及其调节剂等不同分类群21,22。而由于培养系统的人工环境的差异进行了说明5,23，这些体外系统已被证明是不可缺少的，以我们的管的多核形成错综复杂的程序的夹层，终末分化的单核myofibersfrom称为myosatellite增殖祖细胞细胞（MSCs）的哺乳动物之一。
类哺乳动物之外，然而，控制肌肉发育机制，保护和/或发散了解甚少，主要是由于来自不同类群培养生肌前体细胞（MPC）中和成肌细胞的难度。事实上，主要的成肌细胞培养只被三鸟24-26一爬行动物27，少数两栖动物28-30，和一些鱼类1,3,4,31-33描述。从已经连续肌细胞系rtebrates比鼠类34-36其它更是少见，唯一的非哺乳动物肌细胞系被来自日本鹌鹑（Cortunix粳稻 ）得出，QM7 37。尽管很多人试图在永生化，一个硬骨肌细胞系仍然是难以捉摸和协议，用于这些细胞的转染效率才公布，今年15。因此，非常需要从多种脊椎动物的培养主要的MPC和成肌细胞清楚和优化的协议，不仅进一步扩大我们的生肌程序的演变知识，而是采用比较生理学的力量取得突破的人骨骼肌疾病和病症的治疗。
虽然文献中的MPC /成肌细胞分离38-49很多报道，这是很常见的作家来描述简单，往往不完整，格式如隔离的协议。此外，最有启发性的协议回购RTED已经开发了用于小鼠50-53，并且其中的一些依赖于抗体的选择54,55或荧光的转基因56,57，使得这些协议不可用或通过肌肉生物学家使用不切实际的最深处非啮齿类动物物种。随着对鱼，两栖动物，爬行动物肌肉发育，详细和全面的协议，与视听的指导，并与远缘物种证明效率描述鲜为人知的，将是最有帮助的领域。
首先由鲍威尔和他的同事在1989年58所述，下列协议最初是从鲑鱼（即，虹鳟， 虹鳟和大西洋鲑， 大西洋鲑 ）和一些较大的鲤科鱼类（ 如金鱼，Carassiusauratusauratus）隔离的MPC和成肌细胞。 2000年，Fauconneau和Paboeuf优化的主要成肌细胞培养虹鳟鱼59，minoroptimizations马去该协议利用的在亚科分支（斑马鱼， 斑马鱼 ，和巨人斑马，Devario aequipinnatus）32，由于可用于斑马鱼工作的许多遗传工具，因此，其近亲属的几个较小的小鱼。硬骨鱼是有吸引力的生物进行研究，由于其不同的发展战略（至少在大多数物种）。大鲑鱼，最喜欢的鱼类，生长不定，随着到期日由不受约束的渐近增长潜力，即使在年老60-62。与斑马鱼，大danionins如巨人斑马63和小胡子斑马显示增长潜力典型的硬骨鱼，使他们直接相拼理解一个理想的平台是否MPC细胞命运的选择对骨骼肌增生与肥大的作用。
同样地，我们已经证明，这个协议可与小鼠和蝾螈使用，具有相对高的细胞产量和VIABility指数。 Urodele蝾螈，如墨西哥蝾螈（Ambystomamexicanum），具备非凡的能力，再生组织，包括整个四肢和尾巴64-66。这一特点使得这些两栖动物有趣的骨骼肌萎缩和老化模型。使用下面描述的协议，类似的方法可以进行，这已在许多鱼种已经完成，为这类研究更广泛的比较方面。因为许多真正比较生物学家理解的，在基本的生物学和生物医学平移最有意义的进步可以当数据被最广泛的光谱范围内进行分析（在此，整个脊椎动物谱系）制成。
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Protocol
伦理声明：所有涉及本文所述脊椎动物实验是事先由阿拉巴马大学伯明翰分校的机构动物护理和使用委员会，并与实验动物福利，健康美国全国学院办公室既定准则卫生与人类服务部。
1，文化准备
- 制备基础培养基如下：9毫米的NaHCO 3（每2升1.51克），20mM的HEPES（每2升9.53克）的DMEM（13.48克/ L，每2升26.96克）。
- 确定pH值调整到7.40，用HCl或NaOH。
- 确定重量克分子渗透压浓度，并调整至约300毫渗透摩尔浓度用NaCl（如果需要）。
- 过滤消毒使用（2）避光长达2-3个月的1升真空灭菌系统和储存在4℃。
注：请参阅表1和表2为完整的试剂，工具，consum埃布尔斯和设备的信息。
- 通过在50ml的超纯无菌水溶解5毫克γ-照射的聚-L-赖氨酸（> 300,000 MW）制备多聚-L-赖氨酸处理过的平板上。轻轻混匀颠倒在室温下10分钟，确保赖氨酸聚合物充分溶解。
- 吸取的聚-L-赖氨酸溶液中的所需量在每孔中，根据盘的类型（ 表3）。让板站在层流罩5分钟。
- 接着，除去聚-L-赖氨酸溶液中，用无菌水洗涤两次。让板在空气中干燥在层流罩20分钟。
- 得到1毫克层粘连蛋白（Engelbreth-的Holm-群原点）和在50ml基本培养基中溶解至20微克/毫升的最终浓度。应用层粘连蛋白溶液，以聚-L-赖氨酸处理过的细胞培养板中以2微克/厘米2。 （请参阅表3为不同印版尺寸）
- 轻轻摇动的解决方案，以确保福LL很好的覆盖。密封板与实验室的磁带并将其放置在培养箱中培养24小时。孵化器应设置适当的温度下被使用的物种（ 见表7），并且没有额外的气体需要被添加到孵化器。
注：层粘连蛋白，必须允许坚持以板为种子细胞前24小时。如果不这样做会导致较差的无细胞的黏附。 - 如表4所示准备媒体。完整的媒体使用的当天最好的准备。
- 在筹备组织分离，收集下列项目和高压灭菌：300-500毫升烧杯（次）;玻璃培养皿;手术刀处理;镊子（粗，细）;解剖剪刀;和几张斥水高压釜纸。
注：对于每个人协助解剖过程中，（2）手术刀把手，（1）镊子（类型根据个人喜好），（1）解剖剪刀，和斥水高压灭菌纸（5-10）表是足够了。 - 除了以上的高压蒸汽灭菌的物品，组装70％乙醇的重量平衡，无菌的50ml锥形试管（数量取决于培养的大小），和冰。
2，组织解剖
- 在开始之前，请确保鱼了充足的库存可用。
注：要使用的鱼的年龄是至关重要的。而两种不同种类的鱼可能是类似的权重，一个物种一个年轻的鱼将拥有比其他种类的旧鱼更多的MPC。作为一般规则，年轻的鱼，用鲑工作时，特别是最好的。对于danionins，鱼一样古老，按一年可以得到最佳利用，而年龄4-6个月或更年轻（最多15克）鲑鱼是最优的。 - 每次5克组织被解剖，等分25毫升隔离介质的进入无菌50ml锥形管中。
- 称重，记录质量和数量管（S）。放置管置于冰上。
- 安乐死2-3鱼在同一时间通过浸渍在> 300毫克/升碳酸氢钠缓冲三卡因甲磺酸盐。允许鳃盖运动停止时间> 5分钟，然后在70％的乙醇（包含在无菌烧杯中），持续30秒浸没鱼。
- 从70％的乙醇除去鱼，并放置于斥水高压釜纸。直接背后的鳃盖，用手术刀做一个肤浅的，浅薄的切口。抓住皮肤在上述切口去除鳞屑和皮肤拉扯，鱼的尾巴。
- 下面的皮肤切除，切除epaxial，鱼从两侧快速糖酵解'白'肌肉（避免缓慢氧化“红色”肌肉位于侧线附近），并将其放置在分离培养基。所要求的机构丢弃鱼的其余部分。
注：虽然这是完全有可能的文化多用途储值卡从红肌原，几乎每一个使用硬骨鱼类的MPC出版以来，利用细胞从epaxial米隔离yotome。 - 直到获得肌肉足量，重复步骤2.4-2.6。在清扫，确保汇集肌肉组织仍然在冰上以保持细胞活力。
3，机械解离
- 倒入25毫升/5克肌肉组织中的一个管到玻璃培养皿。使用两个手术刀手柄附带＃10手术刀片，肉末组织的浆液或菜泥的一致性。拉动手术刀过去对方一个“背的往复”的运动效果最好。
注意：虽然组织匀浆可能看起来合适，活细胞的数目将被显着降低，如果不废除。 - 用25毫升血清吸管和血清学移液器，取出组织成浆，并替换原来的锥形管。
- 重复步骤3.1-3.2，直到所有的管子都组织已被机械分离。
- 离心机组织在300×g离心5分钟，10°C。
- 傅杰仕由于离心，弃去25毫升培养基上清液用25毫升血清吸管，真空吸引器，或通过仔细调迁。
- 加25毫升洗涤介质的每个管，重悬组织，并如上述recentrifuge。
- 用洗涤介质洗涤两次，每次除去上清液。
4，酶解
- 在步骤3.4中，通过合并将0.22g IV型胶原酶和44毫升基础培养基中（或足够数量的0.11 g/0.22毫升）准备胶原酶溶液。
- 在4℃下搅拌的烧杯中10-15分钟过滤消毒用50毫升的注射器和0.45μm的注射器过滤器。
注意：一个以上的注射器过滤器可根据需要，根据不同的胶原酶制备。从厂商比沃辛顿生化等获得胶原酶造成过滤时更加困难。胶原酶用于分离肽键在构成肌内膜胶原蛋白。这消化将移除肌纤维的保护屏障。 - 对于每个克肌肉组织，在0.2％胶原酶溶液重新悬浮组织。对于5克肌肉组织，加入10毫升胶原酶溶液和15毫升的基础培养基。
- 加入10微升的PSF每毫升胶原酶溶液/基础培养基（ 例如 250微升至25毫升）。确保组织很好暂停，因为这会影响酶消化的效率。
- 孵育肌肉组织中胶原酶60分钟，在18℃，温和的摇摆。取决于机械解离和物种的程度，胶原酶消化可以延长至90分钟，尽管这可能会影响细胞活力。
- 下面胶原酶消化，离心锥形管，在300×g离心5分钟，在12°C。丢弃在25ml洗涤介质的上清，重悬组织。
- Recentrifuge在300×g离心5分钟，在126，C。用洗涤介质重复第二次。
- 洗涤后的组织两次，重悬肌肉组织在25ml洗涤介质和磨碎的与10ml的血清吸液管，直到组织/培养基中匀浆通过在吸液管和出相对容易。 5-10 triturations通常是足够的。
- 重复用5毫升的血清吸液管，然后连接到一个注射器的16号金属套管。
- 离心机锥形管在300×g离心5分钟，在12°C。弃去上清液。
- 在上述5分钟离心，结合0.25克胰蛋白酶用5毫升基础培养基的制备胰酶消化解决方案。
- 搅拌，在4℃下进行10-15分钟，并过滤消毒用20毫升注射器和0.45微米注射器过滤器。
- 检索锥形管中并加入100μl的胰蛋白酶溶液和4.9毫升解离介质的每1克肌肉组织的每管中。对于EXA投影机的简易，加入500μl的胰蛋白酶溶液和24.5毫升分离培养基5克肌肉组织的。
注：胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，将分离生肌前体细胞从基底层。 - 在胰蛋白酶/解离重悬组织培养基好。孵育20分钟，在18°C。
- 继第一胰蛋白酶孵育，离心锥形管，在300×g离心1分钟，在12°C。
- 通过组合与分离培养基的上清液在1体积的上清液，以4倍体积的隔离介质的浓度中和胰蛋白酶。在4°C存储第二胰蛋白酶消化过程中。
- 到组织的剩余粒料，重复步骤4.12-4.15，合并上清液以下步骤4.15从第一胰蛋白酶消化上清液/隔离介质。
- 或者：胶原酶和胰蛋白酶消化可以被组合以最大化电池的产量。 <醇>
- 要做到这一点，磨碎的胶原酶消化使用连接到20ml的注射器的金属套管（6在长度和16号的效果最好），直至匀浆轻易地穿过套管。
- 到匀浆，加入500μl的胰蛋白酶溶液（步骤准备4.10）和孵化在18℃下20分钟。
- 在孵育，离心锥形管，在300×g离心1分钟，在12°C。
- 通过组合与分离培养基的上清液在1体积的上清液，以4倍体积的隔离介质的浓度中和胰蛋白酶。
- 在4°C存储第二胰蛋白酶消化过程中。
- 继续执行步骤4.18与标准协议。
5，计数，稀释和细胞种植
- 下面的步骤4.25最后离心，通过仔细的调迁或用血清学移液器取出上清液。重悬细胞沉淀在5ml完全培养基。
- 随着细胞充分悬浮，去除20微升将细胞悬浮液并置于1.5ml的微量离心管中;
- 加入5微升台盼蓝染色，并等待5分钟。使用血细胞计数器，测定存活细胞的数量。
- 一旦确定，稀释细胞至所需的浓度。硬骨鱼类的MPC最好是在每平方厘米2 150,000-200,000细胞接种。对于6孔镀策略，稀释细胞至1.5×10 6 -每毫升2.0×10 6支持足够的增殖和分化。
- 检索聚-L-赖氨酸处理过的，层粘连蛋白包被的板和种子细胞。 （ 见表5板专用稀释液和电镀卷。）注： 表6描述了细胞每克肌肉组织从不同的硬骨鱼类物种中分离的孤立的平均数。虹鳟鱼（O. mykiss）的表现出每克肌肉组织较少的多用途储值卡做比斑马鱼（ 斑马鱼 ），并将于从而需要更多的鱼进行适当的播种隔离。
- 密封板与实验室的磁带并将其放置在冷藏保温箱在适当的温度。此处列出（除小鼠）所有物种的MPC可能没有二氧化碳（CO 2）补充正常大气条件下进行培养。 （ 见表7）。
- 或者：一些实验室都采用了协议，要求允许多用途储值卡坚持以培养基质40分钟。
- 然后冲洗板用洗涤介质以除去任何松散地附着和非贴壁细胞。注意：此步骤是非常重要的，以避免其他细胞的“非特异性”的附着力（ 如成纤维细胞）的培养基质。
- 添加完整的媒体和地点的细胞在孵化器和照顾，详见下文。
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Representative Results
二十四小时后播种，生肌前体细胞（MPC）中应该是可见的附着于层粘连蛋白基质（参见图1a和 1d）。以下播种，细胞（MPC）中采用一个纺锤状的形状，表示该信元类型（ 图1），并MYOD1 +（ 图2）。在斑马品种，多用途储值卡显得更紧凑，更小的双极型工艺比执行从虹鳟和褐种多用途储值卡。然而，在四天的文化，所有鱼品种多用途储值卡检查采取类似的形态和外观明显像成肌细胞（ 图1b和图1E）。完整的媒体应该被删除，和MPC应该用洗涤介质洗涤两次。肌纤维母细胞会污染生肌文化和距离的MPC /成肌细胞由他们明星般的形态（相对于成肌细胞的纺锤形）容易区分。板的洗涤大大我mproves去除这样的成纤维细胞。
在这里描述（ 见表7）的品种，每日介质的变化产生最好的结果。多用途储值卡和后代（成肌细胞和新生的肌管）应前加入新鲜的完全培养基一次或两次清洗。可替换地，媒体的变化可降低到每隔一天细胞已达到了最终的成肌细胞阶段（培养约4天）后。肌管，应在2-3天内形成（ 图1c和3420）和被肌细胞生成素+（ 图2），尤其是当在分化培养基中培养（参见下文）。而周的期间，以月已经报告了一些哺乳动物物种，鱼的MPC和成肌细胞似乎不容忍的时间等期间。细胞增殖的前六天文化（ 图3），与7天与文化9-11之间的后续分化。随后，细胞衰老或poptose。
已基于基因表达式确定的MPC及其后代使用此协议中分离的生肌性质3,32,33。不同于哺乳动物培养系统，的MPC和成肌细胞的后代的增殖是比较低的期间培养物的初始时期（时相比，利用原代鼠成肌细胞C2C12或系统），具有检测作为细胞内天培养的6-9形成未成熟的肌管迅速增加在斑马物种32。从虹鳟鱼报告已经利用一个分化培养基（常见于哺乳动物成肌细胞培养物，但不要求在鱼的系统），并表明，增殖指数降低预期与肌管形成33。在我们的手中，由此产生的肌管之前能细胞衰老或凋亡发生时留在文化长达9-11天（ 斑马种）和11-13日（ 钩吻种）。
| 试剂 | 公司（首选诉备用） | 目录号（首选诉备用） | 每个文化产品数量 |
| γ-照射的聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich公司（MP Biomedicals的） | P5899（ICN19454405） | 5毫克 |
| DMEM（高糖） | Sigma-Aldrich公司（的CellGro） | MT-50-003-PB（D7777） | 2升 |
| 层粘连蛋白 | BD公司（Sigma-Aldrich公司） | CB-40232（L2020） | 1毫克 |
| 小苏打（ 碳酸氢钠 ） | 飞世尔科技（Sigma-Aldrich公司） | BP328-500（S5761） | 1.51克 |
| HEPES（C 8 H 18 N 2 O 4 S） | 飞世尔科技（Sigma-Aldrich公司） | BP310-1（H6147） | 9.53克 |
| 抗生素/抗真菌素 | Thermo Scientific的（SIGMA-Aldrich公司） | SV3007901（A5955） | 17-20毫升 |
| 硫酸庆大霉素 | 龙沙（Sigma-Aldrich公司） | BW17-519Z（G1397） | 2-3毫升 |
| 供体马血清 | Thermo Scientific的（Sigma-Aldrich公司） | SH3007403（H1270） | 75毫升 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific的（Sigma-Aldrich公司） | SH3007103（F2442） | 25毫升 |
| 胶原酶（IV型） | 沃辛顿（Sigma-Aldrich公司） | LS004189（C9891） | 0.44克 |
| 胰蛋白酶（从胰腺） | MP Biomedicals的（Sigma-Aldrich公司） | ICN15357125（T5266） | 1克 |
表1。详细名单试剂与首选的制造商和产品目录号。
| 耗材 | 工具 | 设备 |
| 细胞培养板 | 镊子（粗） | 血清学移液器 |
| 无菌的50ml锥形管 | 钳（精细） | pH计 |
| 实验室胶带 | 手术刀把手 | 寒蝉孵化器（Echotherm） |
| 0.2微米真空灭菌系统 | 手术刀片（＃10，＃11） | 层流罩 |
| 斥水高压灭菌纸 | 手术剪刀 | 真空歧管 |
| 血清学移液器 | 玻璃培养皿 | Microosmolality仪表 |
| 12-16摹插管与鲁尔锁 |
表2。耗材，工具和设备所需的细胞培养。
| 板尺寸 | 2厘米，每孔 | 聚-L-赖氨酸* | 层粘连蛋白** |
| 6井 | 9.5 | 1.6毫升 | 1 |
| 24孔 | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48以及 | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96孔 | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| * 0.1毫克/毫升的浓度 | ** 0.020毫克/毫升的浓度 |
表3。优化卷涂覆细胞培养板用聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白。
| 试剂 | 隔离 | 洗 | 解离 | 完整 |
| 基础培养基 | 419.25毫升 | 395.40毫升 | 297.00毫升 | 178.00毫升 |
| PSF * | 5.00毫升 | 4.00毫升 | 3.00毫升 | 2.00毫升 |
| 硫酸庆大霉素** | 0.75毫升 | 0.60毫升 | - | - |
| 供体马血清 | 75.00毫升 | - | - | - |
| 胎牛血清*** | - | - | - | 20.00毫升 |
| * PSF：青霉素/链霉素/两性霉素B的鸡尾酒（100X）; * 50毫克/毫升的浓度;特点*** |
表4。不同的媒体准备的隔离生肌前体细胞（MPC）中和文化。
| 板尺寸 | 2厘米，每孔 | 稀释 | 电镀音量 |
| 6井 | <TD> 9.51.5 - 2.0×10 6个细胞/毫升 | 1毫升 | |
| 24孔 | 1.9 | 1.5 - 2.0×10 6个细胞/毫升 | 250微升 |
| 48以及 | 0.95 | 1.5 - 2.0×10 6个细胞/毫升 | 150微升 |
| 96孔 | 0.32 | 1.5 - 2.0×10 6个细胞/毫升 | 50-100微升 |
表5。推荐的稀释和电镀量由细胞培养板以及大小。
| 种类 | 平均＃细胞/ g组织 |
| 斑马鱼 | 6,400,000 |
| 斑马dangila | 1,783,000 |
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 |
| 虹鳟 | 66,800 |
。生肌前体细胞从1克各种硬骨鱼类物种的肌肉组织中分离出表6平均次数： 斑马鱼 （斑马鱼），Daniodangila（moustacheddanio），Devario aequipinnatus（巨人斑马）和虹鳟 （虹鳟鱼）。
| 种类 | 温度 |
| 斑马/ Devario属。 | 26 - 28°C |
| 银钩/褐属。 | 10 * - 18°C |
| 钝口螈属mexicanum | 18°C |
| *较低的温度支持较低的增殖率。 |
表7。推荐的孵化温度对鱼和两栖类生肌precursor细胞（MPC）中。
图1。多用途储值卡（最左边）的代表亮场图像，成肌细胞（中），和早期肌管从两个品种，虹鳟鱼（ 虹鳟 ，上图）和斑马鱼（ 斑马鱼 ，下）（最右边）。
图2。多用途储值卡的代表免疫细胞化学染色（A，C）和肌管（B，D）分离，并从巨人斑马（Devario aequipinnatus，上图）和虹鳟鱼（ 虹鳟 ，底部）培养。在文化方面，成肌细胞是MYOD1 +阳性（A，C）如使用市售MYOD1 +可视化的抗体（斑马：C-20，Santa Cruz公司;鳟鱼：NB100-80899，诺伟司生物制品）。此外，由于成肌细胞分化，他们表达肌细胞生成素（B，D）为使用市售肌细胞生成素抗体可视化（斑马：M-225;鳟鱼：SC-567，无论是从Santa Cruz公司）。
图3。使用的BrdU随着时间的推移在文化来衡量细胞增殖率代表细胞增殖的数据。从多用途储值卡分离，培养从巨人斑马67得到的数据。
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Discussion
生肌方案，在任何检查的物种，可以最方便地通过一个体外系统的研究。事实上，在隔离，生肌前体细胞（MPC）中的鱼或myosatellite细胞（MSCs）在哺乳动物中很容易进入这个涉及细胞增殖，细胞周期停药，并成肌细胞的终末分化和融合的成肌成肌管新生的高度管制的过程。普遍缺乏鱼品种的转基因报告基因的菌株（与斑马鱼67和虹鳟鱼69可能是个例外）限制在 MPC / MSC活化，增殖和分化的体内工作，因此这里介绍的体外系统是一个有吸引力的平台，在鱼类物种的研究。
MPC /干细胞，无论是品种，培养成功在很大程度上取决于一）严格注意无菌;骨骼肌T B）彻底分离机械问题;和c）酶消化的优化。中的肌肉组织分离的初始步骤，极大必须小心，以确保组织的必要量切除而不污染。这是最重要的是鱼（或正在使用的任何动物，对于这个问题）正确消毒，70％乙醇和足够的时间。在我们手中30秒效果最好;较短的时间内可能会导致污染和更长的时间，损失的组织的完整性和细胞活力。乙醇可以用作固定剂，所以必须小心，不要解剖前脱水的鱼。夹层可在层流细胞培养罩的外面进行;然而，我们建议这个过程被一个罩内完成，以尽量减少任何潜在的细菌或真菌污染。
尽管上述机械解离可能看起来粗糙和/或冗长的，首先，它是分离过程的关键。两个大的手术刀片，拉过去彼此的滑动运动（如在视频协议），产生最好的结果。一旦完成后，将匀浆的一致性应是淤浆或果浆，并与一宽口血清吸液管（ 即 25毫升）中容易地回收。简单地说，更好的机械解离，较高的MPC / MSC产率和更好的所得到的培养。可怜的解离会阻碍消化酶，减少细胞产量。虽然它可能是很有诱惑力的考虑，采用电动组织匀浆显着降低细胞活力，尽管其明显的便利性，至少在鱼的多用途储值卡。
如同所有的协议，上面详述的方法的优化通常是必要的。这已被证明真实的在我们的工作与几个danionin种。结果从我们的实验室表明，较小的danionins（ 如斑马鱼）产量每克骨骼肌更多的MPC大于做较大的品种（ 如 GI蚂蚁或小胡子斑马）。然而，如果胶原酶（0.3％）的浓度较高是使用从较小的物种的组织，这是唯一的实现。在我们的手中，0.2％的浓度是适当的鲑鱼物种（ 例如虹鳟鱼，山鳟[Oncorhynchusclarki]，大鳞大麻哈鱼[Oncorhynchustschawytscha]），较大danionins，蝾螈（Ambystomamexicanum）四肢和尾巴，甚至小鼠骨骼肌。同样，必须小心选择适当的胶原酶。根据我们的经验，Ⅳ型胶原酶保持细胞活力远高于推荐用于纤维组织如骨骼和肌肉（ 如胶原酶II型）70胶原酶更好。而消化可以在较短的时间内更完全，细胞膜受体的完整性可能是由在这些制剂中增加的胰蛋白酶活性的影响。对于胰蛋白酶，我们实验室一直采取草率胰酶制剂PUR从猪胰化了，而不是“更纯”制剂可用。在我们与不同种类的文化活动，我们已经注意到了不同浓度的胰蛋白酶很少有益的影响。
研磨是该协议的关键。它两个解离骨骼肌的纤维基质，并增加表面积为胰蛋白酶消化所有的同时手动破坏肌纤维的结构完整性。当执行triturations，依次用较小的孔移液管和插管比使用插管和注射器通俗易懂容易得多。直接进到triturations用插管和注射器可导致插入的插管和/或过大的压力被施加到细胞。采用胰蛋白酶消化不充分的研磨会大大降低电池的产量。
一旦分离，培养过程是相当简单的。大多数出版物迄今使用的协议机智ħ一个媒体为增殖和分化33,71-75，包括我们自己的;然而，写的几个法国研究者最近的文章已经描述了两个媒体协议，配有独立的媒体和增殖和分化33血清含量。这种“新”的协议更紧密地模仿那些在鼠MSC和myoblastsand的培养中使用似乎提高早期成肌细胞增殖33和可控制细胞增殖和/或细胞分化的更合适。然而，如果没有基因表达的广泛的特性，因此很难断定这样的“扩散”媒体是否还能节省更多的'成肌细胞样'的状态并不比传统的媒体的方法。描述基因的表达，无论是在转录或蛋白质水平以前的出版物，报告说，使用了传统的媒体协议3。或者，一个单一的媒体（DMEM本文所述）可以补充有胎牛血清（FBS）的不同浓度：对细胞增殖和2％的差异的10％。
虽然研究者采用哺乳动物细胞培养系统可适应使用二氧化碳气氛对这些细胞的培养，培养一种不同的方法陆地和水生气体交换的呼叫之间的内在差异，当鱼或水密闭urodele细胞，包括多用途储值卡。这里详述的媒体缓冲带哌嗪衍生的，两性离子的有机化合物[HEPES：4 - （2 -羟乙基）哌嗪-1 -乙磺酸]和碳酸氢钠（ 碳酸氢钠 ）。因此，随着注气的孵化器是不需要或需要为这些细胞的培养。更重要的是，这样的孵化器应具备冷却，而不是热的能力，如温度需要培养鱼和urodele的MPC 18-26℃之间的范围此外，鲑鱼的MPC可以是Cultured在如果需要较低的温度下，进一步强调需要冷却培养箱中培养。此外，我们还发现（因为有其他的研究者，如先前传达）培养板中的密封是必要的，以保持细胞活力。简单包装的文化盖子，板与标准实验室磁带之间的接口足以实现这一目标。
尽管这两个主要的MPC /干细胞/成肌细胞的传代是常见的哺乳动物细胞培养物，它不会出现与鱼的细胞中，至少后期MB阶段（大约培养的第6天）之前，就可以了。因此，细胞足以支持细胞增殖和到达实验的目标的适当数量必须在培养开始进行接种。另外，如果低于预期的细胞产率获得，它是不可能的繁殖细胞，然后后来replate的后代。我们将此归因特性对extracel的依赖增加鱼MPC /成肌细胞的lular基质（ECM）。或者，它可能是这样的层粘连蛋白底物的人工制品，从而进一步经验确定所需的鱼MPC / MB的增殖和分化是必要的细胞外基质成分。然而，我们注意到，我们几个合作者已经成功地从培养基质中删除晚期成肌细胞（〜培养6天），再接种这些细胞（JM弗勒利希和公关Biga的，个人通信）。
使用此协议或一个类似于它，实验涉及的RT-PCR 3,71-74,76-78，Western blot检测32,79-81，免疫细胞化学32,33，增殖实验32,33,59，基因转染15，形态分析78，毒理学筛查82，和染色质免疫沉淀（ChIP; JM弗勒利希和公关Biga的，未公布结果）已经完成。然而，额外的维生素进一步说明RO协议，即那些涉及传代和无性繁殖，是非常必要的。事实上，罗杰斯实验室15通过优化协议，用于诱导虹鳟成肌细胞的转染取得显著进步，在鱼的MPC /成肌细胞的文化。基于这种方法，涉及RNA干扰或骨骼肌特异性表达的目标，特别是那些假定参与与硬骨鱼类的终身成长轨迹，进一步调查不仅是可能的，但可能会导致显著进步，在水产养殖和生物医学领域科学的。
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Disclosures
没有什么可以透露。
Acknowledgments
作者希望感谢许多扩展到博士。何塞普普拉纳斯和胡安·卡斯蒂略为他们的专业知识，在这种文化协议的开发和应用，以小型鱼类和两栖类动物。还要感谢的无数个人谁不知疲倦地帮助肌肉组织的许多鱼（无论是在种类和数量），包括马修充电，Delci克里斯滕森，扎卡里福勒，布鲁克弗伦岑，弥敦道弗勒利希，基拉马歇尔的解剖和分离，本·迈耶，伊桑Remily和Sinibaldo罗梅罗。这项工作是由阿拉巴马大学生物启动资金的伯明翰部，中心蛋白酶研究美国国立卫生研究院资助＃2P20 RR015566，美国国立卫生研究院NIAMS格兰特＃R03AR055350支持，并NDSU前进NSF资助＃HRD-0811239到PRB。技术支持也由UAB的营养肥胖研究中心奖＃P30DK056336，美国国立卫生研究院NIDDK提供， 其内容完全是作者的责任，并不一定代表了美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. Detailed Reagent Information | |||
| Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture |
| γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| Table 2. Consumables, Tools and Equipment | |||
| Consumable | Tools | Equipment | |
| Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | |
| Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | |
| Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | |
| 0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | |
| Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | |
| Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | |
| 12-16 G Cannulas with Luer Locks | |||
| Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** |
| 6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| *0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | ||
| Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | |||
| Reagent | Isolation | Wash | Dissociation |
| Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | - |
| Donor Equine Serum | 75.00 mL | - | - |
| Fetal Bovine Serum*** | - | - | - |
| * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | |||
| Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume |
| 6 well | 9.5 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 1 mL |
| 24 well | 1.9 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 250 μL |
| 48 well | 0.95 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 150 μL |
| 96 well | 0.32 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 50-100 μL |
| Table 6. Average number of cells per g tissue | |||
| Species | Average # cells/g tissue | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| Table 7. Recommended Incubation Temperatures | |||
| Species | Temperature | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 °C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* - 18 °C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18°C | ||
| * Lower temperatures support lower proliferation rates. | |||
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