Summary
El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la proliferación y la diferenciación en un entorno de cultivo primario permite la identificación de los mecanismos de regulación conservados y divergentes a lo largo los linajes de vertebrados.
Abstract
Debido a la dificultad y el tiempo inherente implicado con estudiar el programa miogénico in vivo, los sistemas de cultivo primarios derivados de las células madre adultas residentes de músculo esquelético, las células precursoras miogénicas (PSM), han demostrado ser indispensable para nuestra comprensión del desarrollo del músculo esquelético de mamíferos y crecimiento. Particularmente entre los taxones basal de vertebrados, sin embargo, los datos son limitados describir los mecanismos moleculares que controlan la auto-renovación, la proliferación y diferenciación de los PSM. De particular interés son los posibles mecanismos que subyacen a la capacidad de los vertebrados basales a someterse considerable postlarvas miofibra hiperplasia esquelético (es decir, peces teleósteos) y la regeneración completa tras la pérdida apéndice (es decir urodelos anfibios). Además, el uso de mioblastos cultivados podría ayudar en la comprensión de la regeneración y la recapitulación del programa miogénico y las diferencias entre ellos. Aello, se describe en detalle un protocolo robusto y eficiente (y sus variaciones) para aislar y mantener PSM y su progenie, mioblastos y miotubos inmaduros, en cultivo celular como una plataforma para la comprensión de la evolución del programa miogénico, comenzando por el más vertebrados basales. Aprovechando la situación organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), informe sobre la aplicación de este protocolo para pequeños peces del clado ciprínidos Danioninae. A la par, este protocolo puede utilizarse para realizar un enfoque comparativo más amplio mediante el aislamiento de los PSM del ajolote mexicano (Ambystomamexicanum) e incluso roedores de laboratorio. Este protocolo se utiliza ampliamente en el estudio de la miogénesis en varias especies de peces, como la trucha arco iris, el salmón, el besugo y 1-4.
Introduction
Entendimiento considerable de miogénesis mamíferos se ha obtenido a través de la recapitulación de este proceso en los dos cultivos de mioblastos de ratón primario (Mus musculus) y la línea celular derivada de ratón bien descrito, C2C12 5. A partir de la década de 1950 6, estas culturas han dado lugar a mucho progreso en la comprensión del programa murinemyogenic y, por extensión, la miogénesis en otros vertebrados. Además, una sola célula de las técnicas de miofibras de explantes han aumentado a cabo comprensión de las interacciones entre las células satélite y miofibras que rodean 7-9. Los cultivos celulares son particularmente atractivos para las investigaciones de la miogénesis debido al corto tiempo de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidad de la transfección para ARNi 11-14, transgénico 15,16 y sobreexpresión estudios 14,17,18, la expansión in vitro seguida de trasplante in vivo 18-20, e incluso un borradorarison de células precursoras miogénicas y sus agentes reguladores de todo taxa 21,22. Mientras que las diferencias debido a la ambiente artificial del sistema de cultivo han sido descritos 5,23, estos sistemas in vitro han demostrado ser indispensable para nuestra disección del programa intrincada que rige la formación de multinucleadas, myofibersfrom diferenciación terminal mononucleadas células progenitoras proliferativas conocidas como myosatellite células (MSC) entre los mamíferos.
Fuera de la clase de los mamíferos, sin embargo, la conservación y / o divergencia de los mecanismos que controlan la miogénesis, son poco conocidos, en gran parte debido a la dificultad en el cultivo de células precursoras miogénicas (PSM) y mioblastos de varios taxones. De hecho, cultivos de mioblastos primarios sólo se han descrito en tres aves 24-26, un reptil 27, un par de anfibios 28-30, y algunos peces 1,3,4,31-33. Continuas líneas de células miogénicas de VErtebrates distintas de roedores 34-36 son aún más raros, con la única línea que no sean mamíferos miogénica de células que se deriva de la codorniz japonesa (Cortunix japonica), QM7 37. A pesar de muchos intentos de inmortalización, una línea celular miogénica teleósteos sigue siendo difícil de alcanzar y un protocolo para la transfección eficiente de estas células sólo se publicó este año 15. Por lo tanto, los protocolos claros y bien optimizados para el cultivo de los PSM primarias y mioblastos a partir de una variedad de vertebrados son muy necesarias, no sólo para ampliar aún más nuestro conocimiento de la evolución del programa miogénico, pero para emplear el poder de la fisiología comparada a hacer avances en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético y trastornos humanos.
Mientras que la literatura contiene muchos informes de aislamiento MPC / mioblastos 38-49, es común que los autores describen los protocolos para estos aislamientos en breves, a menudo incompletos, formatos. Además, los protocolos más instructivas reportorted se han desarrollado para los ratones 50-53, y algunos de ellos dependen de la selección de anticuerpos 54,55 o 56,57 transgenes de fluorescencia, por lo que estos protocolos inutilizable o especie no roedora más íntimos poco prácticos utilizados por los biólogos musculares. Con poco conocido sobre piscine, anfibios y reptiles miogénesis, un protocolo detallado y minucioso, que se describe con la guía audiovisual y con una eficacia demostrada en especies alejadas, sería más útil para el campo.
Descrita por primera vez por Powell y sus colegas en 1989 58, el siguiente protocolo fue desarrollado inicialmente para aislar PSM y mioblastos de salmónidos (a saber, la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, y el salmón del Atlántico, Salmo salar) y algunos ciprínidos grandes (es decir, peces de colores, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau y Paboeuf optimizan una cultura de mioblastos primarios para la trucha arco iris 59 y minoroptimizations made ese protocolo utilizable en varios pececillos pequeños del clado Danioninae (pez cebra, Danio rerio, y danio gigante, Devario aequipinnatus) 32 debido a las muchas herramientas genéticas disponibles para el trabajo de pez cebra y por lo tanto sus familiares cercanos. Peces teleósteos son organismos atractivos para el estudio debido a su estrategia de crecimiento divergente (al menos en la mayoría de las especies). Las grandes salmónidos, como la mayoría de los peces, crecen indeterminadamente, con potencial de crecimiento sin restricciones de una asíntota en la madurez, incluso en edad 60-62 años. A diferencia de pez cebra, grandes danionins como el danio gigante 63 y potenciales de crecimiento display danio bigotudos típicas de los peces teleósteos, por lo que su yuxtaposición directa en una plataforma ideal para la comprensión de si la elección del destino celular MPC juega un papel en la hiperplasia del músculo esquelético en comparación con la hipertrofia.
Asimismo, hemos demostrado que este protocolo se puede utilizar con ratones y ajolotes, con rendimiento relativamente alto de células y VIABíndices LIDAD. Salamandras urodele, como el ajolote mexicano (Ambystomamexicanum), poseen la notable capacidad de regenerar los tejidos, incluyendo las extremidades y la cola 64-66 enteras. Esta característica hace que estos anfibios interesantes modelos de pérdida de músculo esquelético y el envejecimiento. Utilizando el protocolo descrito a continuación, un enfoque similar puede llevarse a cabo como se ha hecho en muchas especies de peces, proporcionando un contexto comparativo aún más amplia para tales estudios. Como muchos biólogos verdaderamente aprecian comparativos, los avances más significativos en la biología básica y la biomedicina traslacional se pueden hacer cuando se analizan los datos dentro del más amplio espectro (en este caso, todo el linaje de vertebrados).
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Protocol
Declaración de Ética: Todo experimentación con animales vertebrados se describen en el presente documento fue aprobado previamente por el Comité de la Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Cuidado de Animales y el uso y está en consonancia con las directrices establecidas por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos.
1. Preparación para la Cultura
- Preparar el medio de base de la siguiente manera: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L) en DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L).
- Determinar el pH y ajustar a 7,40 con HCl o NaOH.
- Determinar la osmolalidad y ajustar a ~ 300 mOsm con NaCl (si es necesario).
- Filtro de esterilizar usando (2) sistemas de esterilización 1 L de vacío y se almacenan a 4 ° C protegido de la luz para un máximo de 2-3 meses.
NOTA: Consulte las tablas 1 y 2 para el reactivo completa, herramientas, consumbles, y la información del equipo.
- Preparar poli-L-lisina-tratada placas por disolución de 5 mg de γ-irradiado poli-L-lisina (> 300.000 MW) en 50 ml de agua ultrapura estéril. Mezclar suavemente por inversión durante 10 minutos a temperatura ambiente, asegurando la plena disolución de polímeros de lisina.
- Pipetear la cantidad necesaria de solución de poli-L-lisina en cada pocillo, según el tipo de placa (Tabla 3). Permitir placas en reposo en campana de flujo laminar durante 5 minutos.
- A continuación, eliminar la solución de poli-L-lisina y se lava dos veces con agua estéril. Permitir platos se sequen al aire en la campana de flujo laminar durante 20 minutos.
- Obtener 1 mg de laminina (origen de Engelbreth-Holm-Swarm) y disolver en 50 ml de medio base a una concentración final de 20 mg / ml. Aplique una solución de laminina para placas de cultivo celular de poli-L-lisina tratados en 2 mg / cm 2. (Véase la Tabla 3 para diferentes tamaños de placa)
- Remover con suavidad la solución para garantizar full y cobertura. Sellar las placas con cinta de laboratorio y colocar en la incubadora durante 24 horas. La incubadora debe ajustarse a la temperatura adecuada para las especies que se utilizan (véase el cuadro 7), y no hay gases adicionales deben agregarse a la incubadora.
NOTA: La laminina se debe permitir que se adhieran a las placas durante 24 horas antes de la siembra de células. El no hacerlo resultará en malas o ninguna adherencia de las células. - Preparar los medios de comunicación como se describe en la Tabla 4. Medios de comunicación completa se prepara mejor el día de uso.
- En preparación para el aislamiento de los tejidos, juntad a los siguientes artículos y autoclave: 300-500 vaso (s) ml; platos de Petri de vidrio; bisturí maneja; fórceps (fino y grueso); tijeras de disección; y varias hojas de papel autoclave de repelente de agua.
NOTA: Por cada persona que ayuda con el proceso de disección, (2) los mangos de bisturí, (1) pinzas (tipo dependiendo de la preferencia personal), (1) tijeras de disección, y (5-10) hojas de papel autoclave repelente al agua sonsuficiente. - Además de los elementos tratados en autoclave anteriores, montar etanol al 70%, el equilibrio de peso, tubos cónicos de 50 ml estériles (el número depende del tamaño de la cultura), y el hielo.
2. Disección de tejido
- Antes de empezar, asegúrese de que una población suficiente de pescado disponible.
NOTA: La edad de los peces que se utilizará es de importancia crítica. Mientras que los peces de dos especies diferentes pueden ser de un peso similar, un pez más joven de una especie poseerá más PSM que un pez mayor de otra especie. Como regla general, los peces más jóvenes, sobre todo cuando se trabaja con los salmónidos, son los mejores. Para danionins, peces tan viejos hasta un año se puede utilizar de manera óptima, mientras que los salmónidos de edad de 4-6 meses de edad o menos (hasta 15 g) son óptimos. - Para cada 5 g de tejido a ser disecado, alícuota de 25 ml de medio de aislamiento en un tubo cónico de 50 ml estéril.
- Pesar, masa de grabación, y el número del tubo (s). Coloque los tubos en hielo.
- La eutanasia a los peces 2-3a la vez por inmersión en> 300 mg / L de bicarbonato de sodio tamponada con tricaína metanosulfonato. Permitir movimiento opercular cesar durante> 5 minutos y luego sumergir los peces en etanol al 70% (contenido en los recipientes estériles) durante 30 segundos.
- Retire el pescado de etanol al 70% y colocar sobre papel autoclave repelente al agua. Directamente detrás de los opérculos, utiliza un bisturí para hacer una incisión superficial y poco profundo. Quite las escamas y la piel sujetando la piel en la incisión antes mencionado y tirar hacia la cola de pescado.
- Después de la eliminación de la piel, cortar el epaxial, rápido-glucolítica muscular "blanca" de los peces de ambas partes (evitando el músculo lento oxidativo 'roja' se encuentra cerca de la línea lateral) y el lugar en medio de aislamiento. Desechar el resto de los peces como es requerido por la institución.
Células Aunque es perfectamente posible PSM cultura procedentes de músculo rojo, casi cada publicación mediante teleósteos PSM ha utilizado aislados del m epaxial: NOTAyotome. - Repetir los pasos 2.4 a 2.6 hasta que se obtiene una cantidad suficiente de músculo. Durante la disección, asegurar que el tejido muscular agrupada permanece en hielo para mantener la viabilidad celular.
3. Disociación mecánica
- Vierta un tubo de 25 ml / 5 g de tejido muscular en una placa de Petri de vidrio. Usando dos bisturí maneja con adjuntos # 10 hojas de bisturí, tejido picada a una suspensión o puré de consistencia. Una moción "ida y vuelta" de tirar las hojas de bisturí más allá de uno que funciona mejor.
NOTA: Si bien homogeneizadores de tejidos pueden parecer apropiado, el número de células viables se reduce dramáticamente, si no abolida. - Usando una pipeta serológica de 25 ml y pipeta serológica, eliminar el tejido se suspendió y reemplazar en el tubo cónico originales.
- Repetir los pasos 3.1 a 3.2 hasta que todo el tejido en todos los tubos se ha disociado mecánicamente.
- Tejido Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g y 10 º C.
- Folldebido centrifugación, desechar los 25 ml de sobrenadante de medios con una pipeta de 25 ml serológica, aspirador de vacío, o mediante una cuidadosa decantación.
- Añadir 25 ml de medio de lavado a cada tejido de las trompas, resuspender y centrifugar como anteriormente.
- Lavar dos veces con medio de lavado, eliminar el sobrenadante cada vez.
4. Disociación enzimática
- Durante el paso 3.4, preparar la solución de colagenasa combinando 0,22 g de colagenasa tipo IV y 44 ml de medio de base (o la cantidad suficiente a 0,11 g/0.22 ml).
- Mezcle en un vaso de precipitados durante 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro de esterilizar con una jeringa de 50 ml y un filtro de jeringa de 0,45 micras.
NOTA: Es posible que se necesite más de un filtro de jeringa, dependiendo de la preparación de colagenasa. La colagenasa obtenidos de proveedores distintos de Worthington Biochemical plantea más dificultades durante la filtración. La colagenasa se utiliza para disociar los enlaces peptídicos en el colágeno que constituye el endomisio. Estedigestión eliminará la barrera protectora de las fibras musculares. - Por cada gramo de tejido muscular, tejido resuspender en una solución de colagenasa 0,2%. Para 5 g de tejido muscular, añadir 10 ml de solución de colagenasa y 15 ml de medio base.
- Añadir 10 l de FDP por ml de solución del medio de colagenasa / base (por ejemplo 250 l a 25 ml). Asegúrese de que el tejido está bien suspendido, ya que esto puede afectar a la eficiencia de la digestión enzimática.
- Incubar el tejido muscular en la colagenasa durante 60 minutos a 18 ° C con agitación suave. Dependiendo del grado de disociación y especies mecánica, digestión con colagenasa puede extenderse a 90 minutos, aunque esto puede afectar la viabilidad celular.
- Después de tubos de digestión colagenasa, cónicas centrifugar a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el tejido en 25 ml de medio de lavado.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita con el medio de lavado por segunda vez.
- Después de lavar dos veces el tejido, el tejido muscular se vuelve a suspender en 25 ml de medio de lavado y se tritura con una pipeta serológica de 10 ml hasta que el tejido / homogeneizado medio pasa dentro y fuera de la pipeta con relativa facilidad. 5-10 trituraciones suele ser suficiente.
- Repita con una pipeta serológica de 5 ml y luego una cánula de metal de calibre 16 unida a una jeringa.
- Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar el sobrenadante.
- Durante la centrifugación por encima de 5 minutos, preparar la solución de digestión con tripsina mediante la combinación de 0,25 g de tripsina con 5 ml de medio base.
- Se agita a 4 ° C durante 10-15 minutos y esterilizar por filtración con una jeringa de 20 ml y 0,45 micras filtro de jeringa.
- Recuperar tubos cónicos y añadir 100 ml de solución de tripsina y 4,9 ml de medio de disociación para cada 1 g de tejido muscular a cada tubo. Para example, añadir 500 l de solución de tripsina y 24,5 ml de medio de disociación a 5 g de tejido muscular.
NOTA: La tripsina es una proteasa serina que separar células precursoras miogénicas de la lámina basal. - Resuspender el tejido en el tripsina / pocillo de medio de disociación. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C.
- Después de la primera incubación con tripsina, tubos cónicos de centrífuga a 300 xg durante 1 min a 12 ° C.
- Neutralizar la tripsina mediante la combinación de los sobrenadantes con medio de aislamiento a una concentración de 1 volumen de sobrenadante a 4 volúmenes de medio de aislamiento. Almacenar a 4 ° C durante la segunda digestión con tripsina.
- Para el sedimento restante de tejido, repita los pasos 4.12 a 4.15, combinando el sobrenadante después de la etapa de 4,15 con el medio sobrenadante / aislamiento de la primera digestión con tripsina.
- Alternativa: Las digestiones de colagenasa y tripsina se pueden combinar para maximizar los rendimientos celulares. <ol>
- Para hacer esto, tritura el colagenasa digerir usando una cánula de metal (6 en longitud y el calibre 16 que funciona mejor) unido a una jeringa de 20 ml hasta que el homogeneizado pasa fácilmente a través de la cánula.
- Para el homogeneizado, añadir 500 l de solución de tripsina (preparado en el paso 4,10) y se incuba a 18 ° C durante 20 minutos.
- Siguiendo los tubos de incubación, cónicas centrifugar a 300 xg durante 1 minuto a 12 ° C.
- Neutralizar la tripsina mediante la combinación de los sobrenadantes con medio de aislamiento a una concentración de 1 volumen de sobrenadante a 4 volúmenes de medio de aislamiento.
- Almacenar a 4 ° C durante la segunda digestión con tripsina.
- Continúe con el punto 4.18 al igual que con el protocolo estándar.
5. Contar, dilución y siembra de células
- Después de la centrifugación final en el paso 4,25, eliminar el sobrenadante por decantación o cuidado con una pipeta serológica. Resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio completo.
- Con las células se volvieron a suspender totalmente, retire 20 l; De la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 5 l de colorante azul de tripano y espere 5 minutos. El uso de un hemocitómetro, determinar el número de células viables.
- Tras la determinación, diluir las células a la concentración necesaria. Teleost PSM están mejor sembró a 150.000-200.000 células por cm 2. Para que una estrategia de seis pocillos chapado, diluyendo las células de 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml apoya la proliferación y diferenciación suficiente.
- Recuperar poli-L-lisina tratados, placas recubiertas con laminina y células de semillas. (Véase la Tabla 5 para las diluciones de placa específica y volúmenes de galvanoplastia.) NOTA: Tabla 6 representa el número promedio de células aisladas por gramo de tejido muscular aislado a partir de diversas especies de teleósteos. Trucha arco iris (O. mykiss) presentan un menor número de países socios mediterráneos por gramo de tejido muscular que hacer el pez cebra (D. rerio) y por lo tanto requieren más pescado para aislar a partir de la siembra adecuada.
- Sellar las placas con cinta de laboratorio y colocar en la incubadora de enfriamiento a la temperatura adecuada. PSM de todas las especies incluidas aquí (salvo para los ratones) pueden incubar en condiciones atmosféricas normales, sin dióxido de carbono (CO 2) de la suplementación. (Véase el cuadro 7.)
- ALTERNATIVA: Algunos laboratorios han adoptado un protocolo que pide permitiendo PSM a adherirse a los sustratos de cultivo durante 40 minutos.
- Luego enjuague placas con medio de lavado para eliminar las células poco adheridas y no adheridas. Advertencia: Este paso es muy importante para evitar la adhesión "no específica" de otras células (fibroblastos) de los sustratos de cultivo.
- Añadir medio completo y las células de lugar en la incubadora y cuidar como se detalla a continuación.
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Representative Results
Veinticuatro horas después de la siembra, las células precursoras miogénicas (PSM) deben ser visibles adjunto al sustrato de laminina (véanse las figuras 1a y 1d). Después de la siembra, las células (PSM) adoptan una forma de tipo huso, indicativo de este tipo de células (Figura 1) y son MyoD1 + (Figura 2). En las especies Danio, PSM parecen ser más compacto con procesos bipolares más pequeños que hacen PSM de especie Oncorhynchus y Salmo. Sin embargo, más de cuatro días de cultivo, los PAM de todas las especies examinadas piscine adoptan morfologías similares y se ven claramente como mioblastos (Figuras 1b y 1e). Medios de comunicación, es necesario desmontar y PSM deben lavarse dos veces con medio de lavado. Los miofibroblastos pueden contaminar cultivos miogénicos y son fácilmente distinguibles de los PSM / mioblastos por su morfología en forma de estrella (frente a la forma de huso de la mioblastos). El lavado de las placas enormemente improves la supresión de tales fibroblastos.
En las especies que aquí se describen (véase el cuadro 7), los cambios de medios diarios producen los mejores resultados. PSM y la progenie (mioblastos y miotubos nacientes) deben lavarse una vez o dos veces antes de la adición de medio completo fresco. Alternativamente, los cambios de medios se pueden reducir a cada otro día después de que las células han alcanzado la etapa de mioblastos definitiva (aproximadamente el día 4 de cultivo). Miotubos deben formar el plazo de 2-3 días (Figuras 1c y 1f) y se miogenina + (Figura 2), especialmente cuando se cultivan en medio de diferenciación (véase más adelante). Mientras que los períodos de semanas a meses se han reportado en varias especies de mamíferos, PSM piscine y mioblastos no parecen tolerar tales períodos de tiempo. Las células proliferan durante los primeros seis días de cultivo (Figura 3), con la consiguiente diferenciación entre los días 7 y 9 a 11 de la cultura. Después, las células senescencia o unpoptose.
La naturaleza miogénico de PSM y su progenie aislado mediante este protocolo se ha determinado 3,32,33 basado en la expresión génica. A diferencia de los sistemas de cultivo de mamíferos, la proliferación de los PSM y la progenie de mioblastos es relativamente baja durante los primeros días de la cultura (en comparación con los sistemas que utilizan mioblastos murinos primarios o C2C12), con aumentos rápidos detectados como las células forman miotubos inmaduros durante los días 6-9 de la cultura en especies Danio 32. Los informes de la trucha arco iris han utilizado un medio de diferenciación (común en cultivos de mioblastos de mamíferos, pero no es necesario en sistemas piscine) e indican que los índices de proliferación disminuyen a medida que se esperaba con myotube formación 33. En nuestras manos, los miotubos resultantes pueden permanecer en cultivo durante un máximo de 9-11 días (especie Danio) y 11-13 días (especies Oncorhynchus) antes ocurre la senescencia celular o apoptosis.
| Reactivo | Company (Preferred v Suplente) | Número de catálogo (Preferred v Suplente) | Cantidad por la Cultura |
| γ irradiado-poli-L-lisina | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (glucosa alta) | Sigma-Aldrich (Cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| La laminina | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1,51 g |
| HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9,53 g |
| De antibiótico / antimicótico | Thermo Scientific (SIGMA-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 ml |
| Sulfato de Gentamicina | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 ml |
| Donantes Equina Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 ml |
| Bovino Fetal sueros | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 ml |
| La colagenasa (tipo IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0,44 g |
| La tripsina (de páncreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
Cuadro 1. Lista detallada reactivo con el fabricante preferido y el número de catálogo.
| Consumible | Instrumentos | Equipo |
| Las placas de cultivo celular | Pinzas (Grueso) | Pipeta serológica |
| 50 ml tubos cónicos estériles | Pinzas (Fina) | pH Meter |
| Tape Laboratory | Los mangos de bisturí | Chilling Incubadora (Echotherm) |
| 0.2 Sistemas de esterilización micras de vacío | Hojas Hojas tipo bisturí (# 10, # 11) | Campana de Flujo Laminar |
| Agua-repelente Autoclave Papel | Tijeras quirúrgicas | Colector de vacío |
| Pipetas serológicas | Platos de Petri de vidrio | Microosmolality Meter |
| 12-16 T cánulas con Luer Locks |
Tabla 2. Consumibles, herramientas y equipos necesarios para el cultivo celular.
| Tamaño de la placa | cm 2 por Bueno | Poli-L-lisina * | La laminina ** |
| 6 así | 9.5 | 1,6 ml | 1 |
| 24 así | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 así | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 así | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| * La concentración de 0,1 mg / ml | ** Concentración de 0,020 mg / ml |
Tabla 3. Optimizado volúmenes para el recubrimiento de placas de cultivo de células con poli-L-lisina y laminina.
| Reactivo | Aislamiento | Lavado | Disociación | Completo |
| Base Medium | 419,25 ml | 395,40 ml | 297,00 ml | 178,00 ml |
| PSF * | 5,00 ml | 4,00 ml | 3,00 ml | 2,00 ml |
| Sulfato de Gentamicina ** | 0,75 ml | 0,60 ml | - | - |
| Donantes Equina Serum | 75,00 ml | - | - | - |
| Suero bovino fetal *** | - | - | - | 20,00 ml |
| * PSF: penicilina / estreptomicina / cóctel fungizona (100x); ** 50 mg / ml de concentración; Caracterizado *** |
Tabla 4. Diferentes preparaciones de medios para el aislamiento y cultivo de células precursoras miogénicas (PSM).
| Tamaño de la placa | cm 2 por Bueno | Dilución | Volumen Plating |
| 6 así | <td> 9.51,5 - 2,0 x 10 células / ml 6 | 1 ml | |
| 24 así | 1.9 | 1,5 - 2,0 x 10 células / ml 6 | 250 l |
| 48 así | 0.95 | 1,5 - 2,0 x 10 células / ml 6 | 150 l |
| 96 así | 0.32 | 1,5 - 2,0 x 10 células / ml 6 | 50-100 l |
Tabla 5. Diluciones recomendadas y los volúmenes de chapado por tamaño y placa de cultivo celular.
| Especies | # Células / g Promedio tejido |
| Danio rerio | 6400000 |
| Dangila Danio | 1783000 |
| Devario aequipinnatus | 1797000 |
| Oncorhynchus mykiss | 66800 |
. Tabla 6 Número medio de células precursoras miogénicas aisladas de 1 gramo de tejido muscular de varias especies de teleósteos: Danio rerio (pez cebra), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (danio gigante) y Oncorhynchus mykiss (trucha arco iris).
| Especies | Temperatura |
| Danio / Devario spp. | 26-28 ° C |
| Oncorhynchus / Salmo spp. | 10 * - 18 ° C |
| Ambystoma mexicanum | 18 ° C |
| * Las temperaturas más bajas soportan tasas de proliferación más bajos. |
Tabla 7. Recomendado temperaturas de incubación para piscine y anfibios p miogénicocélulas recursor (PAM).
Figura 1. Representante imágenes brillantes de campo de los PSM (a la izquierda), mioblastos (centro), y principios de los miotubos (más a la derecha) a partir de dos especies, la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss, arriba) y el pez cebra (Danio rerio, abajo).
Figura 2. Inmuno tinción Representante del PSM (a, c) y miotubos (b, d) aisladas y cultivadas de danio gigante (Devario aequipinnatus, arriba) y la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss, abajo). En la cultura, los mioblastos son MyoD1 + positivo (a, c)como se visualiza utilizando comercialmente disponibles MyoD1 + anticuerpos (danio: C-20, Santa Cruz de Biotecnología; truchas: NB100-80899, Novus Biologicals). Además, como los mioblastos se diferencian, expresan myogenin (b, d) como se visualiza usando anticuerpos miogenina disponibles comercialmente (danio: M-225, la trucha: SC-567, ambos de Santa Cruz de Biotecnología).
Figura 3. Datos de proliferación de células representativas utilizando BrdU para medir las tasas de proliferación celular a través del tiempo en la cultura. Los datos obtenidos de PSM aisladas y cultivadas de danio gigante 67.
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Discussion
El programa miogénica, en el que las especies examinadas, se puede estudiar más fácilmente a través de un sistema in vitro. De hecho, después del aislamiento, las células precursoras miogénicas (PSM) en el pescado o células myosatellite (MSC) en mamíferos entran fácilmente este proceso altamente regulado que implica la proliferación, la retirada del ciclo celular, y la diferenciación terminal de los mioblastos y la fusión de los mioblastos en miotubos nacientes. La falta general de cepas transgénicas gen reportero de especies piscine (con la posible excepción del pez cebra 67 y la trucha arco iris 69) limita en el trabajo in vivo de la activación MPC / MSC, proliferación, y diferenciación, y por lo tanto el sistema in vitro que aquí se presenta es un plataforma atractiva para los estudios en especies de peces.
Cultivo con éxito de MPC / MSC, sin importar la especie, es altamente dependiente de a) la atención rigurosa a la esterilidad; b) completa disociación mecánica de músculo esquelético tcuestión; y c) la optimización de la digestión enzimática. Durante los pasos iniciales del músculo aislamiento tejido, gran se debe tener cuidado para asegurar que la cantidad necesaria de tejido se extirpa y sin contaminación. Es de suma importancia que los peces (o cualquier animal que se utilizan, para el caso) se desinfectan adecuadamente en etanol al 70% y durante el tiempo suficiente. En nuestras manos, 30 segundos funciona mejor; períodos más cortos de tiempo pueden dar lugar a la contaminación y por más tiempo, la pérdida de la integridad del tejido y la viabilidad celular. El etanol puede ser utilizado como fijador, por lo que se debe tener cuidado de no deshidratar el pescado antes de la disección. La disección se puede hacer fuera de una campana de cultivo de células de flujo laminar; Sin embargo, se recomienda que este proceso se realice dentro de una capucha para minimizar cualquier contaminación bacteriana o fúngica potencial.
Mientras que la disociación mecánica descrito anteriormente puede parecer crudo y / o tedioso al principio, que es crítica para el procedimiento de aislamiento. Dos grandes hojas de bisturí, pasado tiradoentre sí en un movimiento de deslizamiento (como se muestra en el protocolo de vídeo), produce los mejores resultados. Una vez terminado, la consistencia de la homogeneizado debe ser la de una suspensión o de puré, y fácilmente recogida con una pipeta serológica de gran calibre (es decir, 25 ml). Simplemente, el mejor la disociación mecánica, mayor es el / rendimiento MSC MPC y el mejor el cultivo resultante. Malo disociación obstaculizará la digestión enzimática y disminuir el rendimiento de células. Aunque puede ser tentador considerar el uso de homogeneizadores de tejidos eléctricos reduce drásticamente la viabilidad celular a pesar de su evidente conveniencia, por lo menos con PSM piscine.
Al igual que con todos los protocolos, la optimización del procedimiento detallado anteriormente es a menudo necesario. Esto ha demostrado ser cierto en nuestro trabajo con varias especies danionin. Los resultados de nuestro laboratorio indican que danionins más pequeñas (por ejemplo, el pez cebra) producen más PSM por gramo de músculo esquelético que hacer especies más grandes (por ejemplo, gidanio hormiga o bigotes). Sin embargo, esto sólo se realiza si una mayor concentración de colagenasa (0,3%) se utiliza con el tejido a partir de especies más pequeñas. En nuestras manos, una concentración de 0,2% es apropiado para las especies de salmónidos (por ejemplo, la trucha arco iris, trucha degollada [Oncorhynchusclarki], salmón Chinook [Oncorhynchustschawytscha]), los danionins más grandes, axolotl (Ambystomamexicanum) de las extremidades y la cola, e incluso el músculo esquelético del ratón. Asimismo, se debe tener cuidado para seleccionar la colagenasa adecuada. En nuestra experiencia, la colagenasa tipo IV preserva la viabilidad celular mucho mejor que colagenasas recomendadas para los tejidos fibrosos, como el hueso y el músculo (es decir, la colagenasa tipo II) 70. Mientras que la digestión puede ser más completa en un período de tiempo más corto, la integridad del receptor de membrana celular se probable comprometida por aumento de la actividad tríptica en estas preparaciones. Con respecto a la tripsina, nuestro laboratorio ha utilizado siempre la más cruda tripsina preparación PURified de páncreas porcino, en lugar de los preparativos "pura" disponibles. En nuestras actividades de cultivo con diferentes especies, hemos notado poco efecto beneficioso de las concentraciones de tripsina que varían.
La trituración es fundamental para este protocolo. Es tanto se disocia la matriz fibrosa del músculo esquelético y aumenta el área de superficie para la digestión tríptica todo el tiempo interrumpir manualmente la integridad estructural de las miofibras. Al realizar las trituraciones, utilizando sucesivamente pipetas y cánulas de calibre más pequeñas es mucho más fácil que el uso de la cánula y la jeringa inmediatamente. Procediendo directamente a trituraciones con una cánula y la jeringa puede resultar en cánulas conectados y / o una presión excesiva que se aplica a las células. La aplicación de la digestión tríptica sin trituración adecuada reducirá dramáticamente los rendimientos celulares.
Una vez aislado, el proceso de cultivo es bastante sencillo. La mayoría de las publicaciones hasta la fecha han utilizado un protocolo de ingenioh un medio tanto para la proliferación y diferenciación 33,71-75, incluyendo la nuestra; Sin embargo, los artículos más recientes escritos por varios investigadores franceses han descrito un protocolo de dos medios de comunicación, con los medios de comunicación independientes y basadas en el contenido de suero durante la proliferación y diferenciación 33. Este protocolo 'más reciente' imita más estrechamente los utilizados en el cultivo de MSC murinos y myoblastsand parece aumentar la proliferación de los mioblastos las primeras etapas 33 y puede ser más adecuada para controlar la proliferación y / o diferenciación de células. Sin embargo, sin una amplia caracterización de la expresión génica, es difícil concluir si un medio de comunicación como 'proliferación' también conserva un estado más '-mioblastos como "lo que lo hace la metodología de uno de los medios tradicionales. Publicaciones anteriores que describen la expresión de genes, ya sea en la transcripción o nivel de proteínas, informaron el uso de la tradicional protocolo de un soporte 3. Alternativamente, un único medios de comunicación (DMEM describe en el presente documento) se puede complementar con diferentes concentraciones de suero bovino fetal (FBS): 10% para la proliferación y 2% para la diferenciación.
Mientras que los investigadores que emplean sistemas de cultivo de células de mamífero pueden ser aclimatadas a la utilización de atmósferas de dióxido de carbono para el cultivo de estas células, las diferencias intrínsecas entre llamada por central de gas terrestre y acuática para un enfoque diferente cuando se cultiva piscine o células urodelos confinado con el agua, incluidos los países socios mediterráneos. Medios detallan aquí se almacenan con derivados de la piperazina, de ion híbrido de compuestos orgánicos [HEPES: ácido 4 - (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico] y bicarbonato de sodio (NaHCO3). Por lo tanto, una incubadora con inyección de gas no es necesario o requerido para el cultivo de estas células. Más importante aún, estas incubadoras deben poseer la capacidad de enfriar en lugar de calor, ya que las temperaturas necesarias para la cultura piscine y urodelos PSM oscilan entre 18-26 ° C. Además, los PSM salmónidos pueden ser cultured a temperaturas más bajas si es necesario, destacando además la necesidad de una incubadora de enfriamiento. Además, hemos encontrado (como lo han hecho otros investigadores, tal como se comunicó anteriormente) de que el sellado de las placas de cultivo es necesario para preservar la viabilidad celular. Simplemente envolver la interfaz entre la tapa y la placa de cultivo con cinta estándar de laboratorio es suficiente para alcanzar este objetivo.
Si bien los pases de ambos PSM / MSC / mioblastos primarios es común en el cultivo de células de mamíferos, que no parece ser posible con células piscine, por lo menos antes de la etapa tardía Mb (alrededor del día 6 de cultivo). Por lo tanto, el número apropiado de células suficientes para apoyar la proliferación y para alcanzar los objetivos del experimento debe ser sembrada en el inicio del cultivo. Además, si se obtienen menos de lo esperado rendimientos celulares, no es posible propagar las células y luego replate la progenie más tarde. Hemos atribuido esta característica a la creciente dependencia de la extracellular matriz (ECM) de piscine MPC / mioblastos. Alternativamente, es posible que este es un artefacto del sustrato de laminina y por lo tanto más empírica determinación de componentes de ECM necesarios para la proliferación MPC piscine / Mb y la diferenciación se justifica. Nosotros observamos, sin embargo, que varios de nuestros colaboradores han eliminado con éxito mioblastos en etapa tardía (~ 6 días de cultivo) del sustrato del cultivo y replated estas células (JM Froehlich y PR Biga, comunicación personal).
El uso de este protocolo o una similar, la experimentación en la RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, inmunocitoquímica 32,33, ensayos de proliferación 32,33,59, transfección de genes 15, morfométricas análisis de 78, investigación de la toxicología 82, e inmunoprecipitación de cromatina (CHIP; JM Froehlich y PR Biga, resultados no publicados) se ha hecho. Sin embargo, una descripción más detallada de adicional en vitprotocolos ro, es decir, los que implican pases y propagación clonal, son muy necesarias. De hecho, el laboratorio Rodgers 15 hizo avances significativos en la cultura de la piscine PSM / mioblastos mediante la optimización de un protocolo para la inducción de la transfección de los mioblastos de trucha arco iris. Sobre la base de esta metodología, nuevas investigaciones que involucran RNAi o sobreexpresión de los objetivos específicos de los músculos esqueléticos, en especial los postulados de estar involucrados en las trayectorias de crecimiento de toda la vida de los peces teleósteos, no sólo son posibles, pero puede dar lugar a avances significativos en el campo de la biomedicina y de la acuicultura de la ciencia.
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quisieran expresar muchas gracias a los Dres. Josep Planas y Juan Castillo por su experiencia profesional en el desarrollo y aplicación de este protocolo de cultivo de pequeños peces y anfibios. Se agradece también a las innumerables personas que han colaborado incansablemente con la disección y la disociación del tejido muscular de muchos peces (tanto en las especies y número), entre ellos Mateo carga, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily y Sinibaldo Romero. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Alabama en el Departamento de Biología fondos iniciales Birmingham, Centro para la Investigación de la proteasa NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 y NDSU Avance ADELANTE NSF Grant # HRD-0811239 al PRB. El apoyo también fue proporcionado por el Centro de Investigación de la UAB Nutrición Obesidad premio # P30DK056336, NIH NIDDK. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no necesariamenterepresentar los puntos de vista oficiales de la NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. Detailed Reagent Information | |||
| Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture |
| γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| Table 2. Consumables, Tools and Equipment | |||
| Consumable | Tools | Equipment | |
| Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | |
| Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | |
| Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | |
| 0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | |
| Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | |
| Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | |
| 12-16 G Cannulas with Luer Locks | |||
| Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** |
| 6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| *0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | ||
| Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | |||
| Reagent | Isolation | Wash | Dissociation |
| Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | - |
| Donor Equine Serum | 75.00 mL | - | - |
| Fetal Bovine Serum*** | - | - | - |
| * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | |||
| Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | |||
| Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume |
| 6 well | 9.5 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 1 mL |
| 24 well | 1.9 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 250 μL |
| 48 well | 0.95 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 150 μL |
| 96 well | 0.32 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 50-100 μL |
| Table 6. Average number of cells per g tissue | |||
| Species | Average # cells/g tissue | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| Table 7. Recommended Incubation Temperatures | |||
| Species | Temperature | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 °C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* - 18 °C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18°C | ||
| * Lower temperatures support lower proliferation rates. | |||
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